Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de K12CA090628 (SSK), du National Comprehensive Cancer Network (SSK), du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), de la Predolin Foundation (SSK), du Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) et le Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Ce protocole suit les lignes directrices du Conseil d'examen institutionnel (CISR) de la clinique Mayo et du Comité de biosécurité institutionnelle (BAC).
1. Production de cellules CART19
<ol><li>Isolement cellulaire, stimulation et culture ex-vivo<ol>
<li>Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une hotte de culture cellulaire en utilisant l'équipement de protection individuelle approprié. Récoltez les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) des cônes nor...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour employer la technologie DE CRISPR/Cas9 pour induire des modifications secondaires dans les cellules de CAR-T. Plus précisément, cela est démontré à l'aide de la transduction lentivirale avec un vecteur viral qui contient du gRNA ciblant le gène d'intérêt et Cas9 pour générer des cellules GM-CSFk/o CART19. Nous avions précédemment montré que la neutralisation de GM-CSF améliore CRS et NT dans un modèle de xénogreffe. 12</s...

La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est très prometteuse dans le traitement du cancer. 1 Fois , 2 Deux thérapies cellulaires CAR-T ciblant le CD19 (CART19) ont récemment été approuvées aux États-Unis et en Europe pour l'utilisation dans les malignités des cellules B après avoir démontré des résultats frappants dans des essais cliniques multicentriques. 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Les obstacles à une utilisation plus répandue des cellules CAR-T sont une activité limitée dans les tumeurs solides et les toxicités associées, y compris le syndrome de libération de cytokine (SRC) et la neurotoxicité (NT). 3 (en) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 Pour améliorer l'indice thérapeutique de la thérapie cellulaire CAR-T, des outils d'ingénierie génomique tels que les nucléases de doigts de zinc, taleNs et CRISPR sont utilisés pour modifier davantage les cellules CAR-T dans le but de générer des cellules CAR-T moins toxiques ou plus efficaces. 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis (
Dans cet article, nous décrivons une méthode pour générer des cellules CAR-T éditées CRISPR/Cas9. L'objectif spécifique de cette méthode est de modifier génétiquement les cellules CAR-T pendant la fabrication des cellules CAR-T via CRISPR/Cas9 pour générer des cellules CAR-T moins toxiques ou plus efficaces. La raison d'être de l'élaboration de cette méthodologie repose sur les leçons tirées de l'expérience clinique de la thérapie cellulaire CAR-T, ce qui indique un besoin urgent de nouvelles stratégies pour augmenter la fenêtre thérapeutique de la thérapie cellulaire CAR-T et étendre l'application à d'autres tumeurs et est soutenue par les progrès récents dans la biologie synthétique permettant des modifications multiples des cellules de CAR-T qui ont commencé à entrer dans la clinique. Alors que plusieurs outils d'ingénierie génomique sont en cours de développement et d'application dans différents contextes, tels que les nucléases de doigts de zinc, taleNs, et CRISPR, notre méthodologie décrit la modification CRISPR/Cas9 des cellules CAR-T. 10 Ans et plus , 11 CRISPR/Cas9 est un mécanisme de défense bactérienne à base d'ARN qui est conçu pour éliminer l'ADN étranger. CRISPR s'appuie sur les endonucalases pour censer une séquence cible identifiée à l'aide d'un ARN guide (gRNA). L'édition CRISPR des cellules CAR-T offre plusieurs avantages par rapport à d'autres outils d'ingénierie génomique. Il s'agit notamment de la précision de la séquence gRNA, la simplicité de concevoir un gRNA ciblant le gène d'intérêt, l'efficacité élevée d'édition de gènes, et la capacité de cibler plusieurs gènes puisque plusieurs gARN peuvent être utilisés en même temps.
Plus précisément dans les méthodes décrites ici, nous avons utilisé un lentivirus codant L'ARN guide CRISPR et Cas9 pour perturber un gène pendant la transduction cararie des lymphocytes T. En sélectionnant une technique appropriée pour modifier les cellules CAR-T, nous suggérons que la technique décrite ici est un mécanisme efficace pour générer des cellules CAR-T de qualité de recherche, mais parce que l'effet à long terme de l'intégration permanente de Cas9 dans le génome est inconnu, nous proposer cette méthodologie pour développer des cellules CAR-T de qualité de recherche de preuve de concept mais pas pour produire de bonnes pratiques de fabrication catégorie cellules CAR-T.
En particulier, ici nous décrivons la génération du facteur stimulant de colonie de macrophage de granulocyte (GM-CSF) knock-out des cellules de CAR-T de BUT-T ciblant CD19 humain. Ces cellules CAR-T ont été générées par transduction avec des particules lentivirales codant un ARN guide spécifique à GM-CSF (nom de gène CSF2) et Cas9. Nous avons précédemment constaté que la neutralisation de GM-CSF améliore CRS et NT dans un modèle de xénogreffe. 12 cellules GM-CSFk/o CAR-T permettent l'inhibition de GM-CSF pendant le processus de fabrication, réduisant efficacement la production de GM-CSF tout en améliorant l'activité antitumorale et la survie des cellules CAR-T in vivo par rapport aux cellules cartumanes de type sauvage. 12 Ainsi, ici nous fournissons une méthodologie pour générer des cellules CAR-T éditées CRISPR/Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est une nouvelle option de traitement de pointe et potentiellement révolutionnaire pour le cancer. Cependant, il y a des limites significatives à son utilisation répandue dans le traitement du cancer. Ces limitations incluent le développement des toxicités uniques telles que le syndrome de dégagement de cytokine (CRS) et la neurotoxicité (NT) et l'expansion limitée, les fonctions d'effecteur, et l'activité antitumorale dans les tumeurs pleines. Une stratégie visant à améliorer l'efficacité du CAR-T et/ou à contrôler les toxicités des cellules CAR-T consiste à modifier le génome des cellules CAR-T elles-mêmes lors de la fabrication des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons l'utilisation de l'édition de gène CRISPR/Cas9 dans les cellules DE CAR-T par transduction avec une construction lentivirale contenant un ARN de guide au facteur de stimulation de colonie de macrophage de granulocyte (GM-CSF) et cas9. À titre d'exemple, nous décrivons CRISPR/Cas9 pare-t-il de GM-CSF. Nous avons montré que ces cellules GM-CSFk/o CAR-T produisent effectivement moins de GM-CSF tout en maintenant la fonction critique des lymphocytes T et entraînent une activité antitumorale accrue in vivo par rapport aux cellules carturiennes de type sauvage.

La figure 1 montre la réduction de GM-CSF dans les cellules GM-CSFk/o CART19. Pour vérifier que le génome des lymphocytes T a été modifié pour koiller GM-CSF, le séquençage TIDE a été utilisé dans les cellules GM-CSFk/o CART19 (figure 1A). La coloration de la surface des cellules CAR-T vérifie que les lymphocytes T expriment avec succès le récepteur de surface de la RCA in vitro en gating sur d...

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Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Ici, nous présentons un protocole pour modifier génétiquement les cellules CAR-T via un système CRISPR/Cas9.

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Notre protocole décrit la modification génétique des cellules CAR-T lors de leur fabrication via la technologie CRISPR pour générer des produits plus efficaces et moins toxiques. Un avantage de cette technique est que la production de cellules CAR-T et la manipulation génétique peuvent toutes deux se produire dans une cellule avec une bonne efficacité. Rosalie Sterner, doctorante en médecine, Michelle Cox, technologue et étudiante aux cycles supérieurs, et Reona Sakemura, stagiaire postdoctorat, de mon laboratoire, démontreront la procédure.Après avoir isolé les cellules T des cellules mononucléaires périphériques récoltées, commencez à les cultiver en préparant d’abord le milieu des cellules T, puis en le stérilisant en le filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 micromètre, puis à l’aide d’un filtre à vide stérile de 0,22 micromètre. Le jour de la stimulation des lymphocytes T ou du jour zéro, avant la stimulation, lavez les perles CD3/CD28 en plaçant le volume requis de perles dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et en réutilisant en un millilitre de TCM. Placez le tube en contact avec un aimant pendant une minute.Ensuite, aspirez le TCM et resuspendez dans un millilitre de TCM frais pour laver les perles à nouveau et répéter pour un total de trois lavages. Et enfin, resuspendez les perles dans un millilitre de TCM. Après avoir compté les cellules T, transférer les perles aux cellules T à un rapport de trois à une perle aux cellules.Ensuite, diluer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pendant 24 heures. Après l’acquisition d’une construction CART19 dans un vecteur lentiviral, effectuez la production de lentiviral en couveant d’abord le plasmide lentiviral, vecteur d’emballage, vecteur d’enveloppe, réagent précomplexant, réagent de transfection et milieu de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuer des travaux lentiviraux en utilisant bsl2 +précautions, y compris les hottes de culture cellulaire, l’équipement de protection individuelle, et la désinfection des matériaux utilisés avec de l’eau de Javel avant l’élimination.Après l’incubation, ajouter ces réhabilités de transfection aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius et 5%CO2. À 24 et 48 heures après la transfection, la récolte, la centrifugeuse, le filtre et le concentré contenant des virus supernatants par ultracentrifugation et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Le premier jour, résuspendez doucement les cellules T qui ont été stimulées à un million de cellules par millilitre le jour zéro afin de briser les rosettes des cellules.Selon les précautions appropriées bsl2+, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux cellules T simulées à une multiplicité d’infection de 3,0. Continuer à couver les t-cells transduced à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Les jours trois et cinq, comptez les cellules CAR-T et ajoutez du TCM frais préchauffé à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T d’un million de cellules par millilitre.Six jours après la simulation, retirer les perles des cellules T transduites en récoltant et en réutilisant les cellules. Transférer les cellules dans des tubes coniques de 50 millilitres et placer les tubes dans un aimant pendant une minute. Après avoir recueilli le supernatant contenant des cellules CAR-T et jeté les perles, remettre les cellules en culture à une concentration d’un million de cellules par millilitre dans un flacon de culture.Utilisez un échantillon de cellules pour la cytométrie du débit afin d’évaluer l’expression de surface des DRC. Incuber le reste pour reprendre l’expansion, puis récolter et cryo-préserver les cellules au huitième jour comme décrit dans le manuscrit. Pour perturber le facteur stimulant de la colonie de macrophages granulocytes, utilisez un ARN guide tel que décrit dans le manuscrit.Incuber les réhésifs transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez-les aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de la culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pour produire un lentivirus. À 24 et 48 heures, récolter et concentrer le supernatant contenant des virus par ultracentrifugation dans des tubes ultracentrifugeuses de 50 millilitres et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.Puis, le premier jour, résuspendez doucement les T-cells pour briser les rosettes. Dans un laboratoire approuvé par BSL2+, pour produire des cellules CAR-T, ajoutez le lentivirus CAR19 et le lentivirus CRISPR ciblant le GMCSF aux cellules T simulées. Le troisième jour et le cinquième jour pour les cellules T éditées avec succès par lentiCRISPR portant la résistance de puromycine, traitent des cellules avec le dihydrochlorure de puromycine à une concentration d’un microgramme de puromycine par millilitre.Le séquençage des marées a été utilisé pour confirmer une réduction de GM-CSF dans les cellules CART19 à élimination directe GM-CSF avec une efficacité de perturbation d’environ 71 % Les parcelles de surface des cellules CAR-T entachées sur des cellules CD3 positives vivantes montrent que cart19 et GM-CSF knockout CART19 de type sauvage réussissent et expriment de la même manière le récepteur de surface CAR in vitro. D’autre part, la coloration intracellulaire de GM-CSF par cytométrie d’écoulement également fermée sur les cellules CD3-positives vivantes démontre l’expression diminuée de GM-CSF dans les cellules de KNOCKOUT comparées aux cellules cart19 de type sauvage confirmant le succès fonctionnel du KO. Un soin particulier doit être pris pendant les étapes de transduction de cette procédure car elles sont les plus critiques pour le développement des cellules CAR-T génétiquement modifiées.La méthodologie décrite peut potentiellement être appliquée à une variété de gènes pour modifier les cellules CAR-T via CRISPR/CAS9 pour aider à générer un produit moins toxique et plus efficace. La technologie CRISPR/CAS9 fournit les stratégies pour cibler directement le génome des cellules CAR-T afin de concevoir des solutions aux lacunes cliniques actuelles.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modèle de lymphome de B-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de T de voiture CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’immunofluorescence d’ADN simple brin

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Implantation intracrânienne de canules pour des perfusions de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) locorégional en série chez la souris

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...