Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von K12CA090628 (SSK), dem National Comprehensive Cancer Network (SSK), dem Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), der Predolin Foundation (SSK), dem Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) und das Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) und des Institutional Biosafety Committee (IBC) der Mayo Clinic.
1. CART19 Zellproduktion
<ol><li>T-Zell-Isolierung, Stimulation und Ex-Vivo-Kultur<ol>
<li>Führen Sie alle Zellkulturarbeiten in einer Zellkulturhaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durch. Ernte peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) aus nicht identifizierten normalen Spenderblutkegeln, die während der Apherese gesammelt wur...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methodik zur Nutzung der CRISPR/Cas9-Technologie, um sekundäre Modifikationen in CAR-T-Zellen zu induzieren. Insbesondere wird dies mit hilfe einer lentiviralen Transduktion mit einem viralen Vektor demonstriert, der gRNA enthält, die auf das Gen von Interesse und Cas9 zur Erzeugung von GM-CSFk/o CART19-Zellen abzielt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 Wie bereits beschrie...

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie zeigt großes Versprechen in der Behandlung von Krebs. 1 , 2 Zwei CAR-T-Zelltherapien, die auf CD19 (CART19) abzielen, wurden kürzlich in den Vereinigten Staaten und in Europa für die Anwendung bei B-Zell-Malignitäten zugelassen, nachdem sie auffällige Ergebnisse in multizentrischen klinischen Studien nachgewiesen hatten. 3 , 4 , 5 Hindernisse für eine breitere Nutzung von CAR-T-Zellen sind begrenzte Aktivität bei soliden Tumoren und damit verbundenen Toxizitäten wie Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Um den therapeutischen Index der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern, werden Genom-Engineering-Tools wie Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR eingesetzt, um CAR-T-Zellen weiter zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. 10 , 11
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zum Generieren von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen. Das spezifische Ziel dieser Methode ist es, CAR-T-Zellen während der HERSTELLUNG von CAR-T-Zellen über CRISPR/Cas9 genetisch zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Methodik basieren auf den Erkenntnissen aus klinischen Erfahrungen mit der CAR-T-Zelltherapie, die auf die dringende Notwendigkeit neuer Strategien hinweisen, um das therapeutische Fenster der CAR-T-Zelltherapie zu erhöhen und die Anwendung auf andere Tumoren und wird durch die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie unterstützt, die mehrere Modifikationen von CAR-T-Zellen ermöglichen, die begonnen haben, in die Klinik zu gelangen. Während mehrere Genom-Engineering-Tools entwickelt und in verschiedenen Umgebungen eingesetzt werden, wie Z.B. Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR, beschreibt unsere Methodik die CRISPR/Cas9-Modifikation von CAR-T-Zellen. 10 , 11 CRISPR/Cas9 ist ein RNA-basierter bakterieller Abwehrmechanismus, der entwickelt wurde, um fremde DNA zu eliminieren. CRISPR stützt sich auf Endonukleasen, um eine Zielsequenz zu spalten, die durch eine Guide-RNA (gRNA) identifiziert wurde. Die CRISPR-Bearbeitung von CAR-T-Zellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-Engineering-Tools. Dazu gehören die Genauigkeit der gRNA-Sequenz, die Einfachheit bei der Entwicklung einer gRNA, die auf das Gen von Interesse abzielt, eine hohe Gen-Editing-Effizienz und die Fähigkeit, mehrere Gene anzusprechen, da mehrere gRNAs gleichzeitig verwendet werden können.
Insbesondere in den hier beschriebenen Methoden verwendeten wir eine Lentivirus-Codierung von CRISPR-Guide-RNA und Cas9, um ein Gen während der CAR-Transduktion von T-Zellen zu stören. Bei der Auswahl einer geeigneten Technik zur Bearbeitung von CAR-T-Zellen schlagen wir vor, dass die hier beschriebene Technik ein effizienter Mechanismus zur Erzeugung von CAR-T-Zellen der Forschungsstufe ist, aber da die langfristige Wirkung einer dauerhaften Integration von Cas9 in das Genom unbekannt ist, schlagen diese Methode vor, um den Nachweis der Konzeptforschung Car-T-Zellen zu entwickeln, aber nicht für die Herstellung guter Herstellungspraxis Grade CAR-T-Zellen.
Insbesondere beschreiben wir hier die Erzeugung von Granulozyten-Makrophagen-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) Knockout CAR-T-Zellen, die auf menschliche CD19 abzielen. Diese CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit lentiviralen Partikeln erzeugt, die eine Fürleitungs-RNA spezifisch für GM-CSF (Genname CSF2) und Cas9 kodieren. Wir haben zuvor festgestellt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 GM-CSFk/o CAR-T-Zellen ermöglichen die Hemmung von GM-CSF während des Herstellungsprozesses, wodurch die Produktion von GM-CSF effektiv reduziert wird und gleichzeitig die Antitumoraktivität und das Überleben von CAR-T-Zellen in vivo im Vergleich zu Wildtyp-CAR-T-Zellen verbessert werden. 12 Hier bieten wir daher eine Methodik zur Generierung von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie ist eine innovative und potenziell revolutionäre neue Behandlungsoption für Krebs. Allerdings gibt es erhebliche Einschränkungen für seine weit verbreitete Verwendung bei der Behandlung von Krebs. Zu diesen Einschränkungen gehören die Entwicklung einzigartiger Toxizitäten wie Zytokin-Release-Syndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT) und begrenzte Expansion, Effektorfunktionen und Anti-Tumor-Aktivität bei soliden Tumoren. Eine Strategie zur Verbesserung der CAR-T-Wirksamkeit und/oder zur Kontrolle der Toxizität von CAR-T-Zellen besteht darin, das Genom der CAR-T-Zellen während der Herstellung von CAR-T-Zellen selbst zu bearbeiten. Hier beschreiben wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 Gen-Editing in CAR-T-Zellen mittels Transduktion mit einem lentiviralen Konstrukt, das eine Führungs-RNA zum Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Cas9 enthält. Als Beispiel nennen wir CRISPR/Cas9 vermittelten Knockout von GM-CSF. Wir haben gezeigt, dass diese GM-CSFk/o CAR-T-Zellen effektiv weniger GM-CSF produzieren, während sie die kritische T-Zellfunktion beibehalten und zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität in vivo im Vergleich zu wilden CAR-T-Zellen führen.

Abbildung 1 zeigt die Reduktion von GM-CSF in GM-CSFk/o CART19-Zellen. Um zu überprüfen, ob das Genom der T-Zellen in Knockout GM-CSF verändert wurde, wurde tide Sequenzierung in den GM-CSFk/o CART19-Zellen verwendet (Abbildung 1A). Car-T-Zelloberflächenfärbung bestätigt, dass die T-Zellen den CAR-Oberflächenrezeptor erfolgreich in vitro exprimieren, indem sie auf lebende CD3+-Zellen gezerstäuben (<s...

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Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Unser Protokoll beschreibt die genetische Veränderung von CAR-T-Zellen während ihrer Herstellung über die CRISPR-Technologie, um effektivere und weniger toxische Produkte zu erzeugen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass CAR-T Zellproduktion und genetische Manipulation in einer Zelle mit guter Effizienz auftreten können. Die MdB-Doktorandin, Michelle Cox, Technologin und Doktorandin, und Reona Sakemura, postdoktorandische Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.Nach der Isolierung von T-Zellen aus geernteten peripheren mononukleären Blutzellen beginnen Sie, sie zu kultivieren, indem Sie zuerst T-Zell-Medium vorbereiten und es dann sterilisieren, indem Sie es durch einen 0,45 Mikrometer sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 Mikrometer sterilen Vakuumfilter filtern. Am Tag der T-Zell-Stimulation oder Tag Null, vor der Stimulation, waschen CD3/CD28 Perlen, indem Sie das erforderliche Volumen der Perlen in einem sterilen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und Resuspending in einem Milliliter TCM. Setzen Sie das Rohr eine Minute lang mit einem Magneten in Kontakt.Dann die TCM ansaugen und in einem Milliliter frischer TCM wieder aufsetzen, um die Perlen wieder zu waschen und insgesamt drei Wäschen zu wiederholen. Und schließlich, resuspend die Perlen in einem Milliliter TCM. Nach dem Zählen der T-Zellen, übertragen Sie die Perlen zu den T-Zellen im Verhältnis von drei zu eins Perlen zu Zellen.Dann verdünnen Sie die Zellen auf eine endige Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 für 24 Stunden. Nach dem Erwerb eines CART19-Konstrukts in einem lentiviralen Vektor führen Sie die lentivirale Produktion durch, indem Sie zunächst lentivirales Plasmid, Verpackungsvektor, Hüllkurvenvektor, vorkomplexereagenz, Transfektionsreagenz und Transfektionsmedium bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Durchführung von lentiviralen Arbeiten mit BSL2+-Vorkehrungen, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion von gebrauchten Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.Nach der Inkubation fügen Sie diese Transfektionsreagenzien zu den 293 T-Zellen hinzu, die 70 bis 90 % Konfluenz erreicht haben, und die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 kulturieren. Nach 24 und 48 Stunden nach der Transfektion, Ernte, Zentrifuge, Filter und Konzentrat virushaltiger Überstand durch Ultrazentrifugation und Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Am ersten Tag, sanft resuspendT-Zellen, die mit einer Million Zellen pro Milliliter am Tag Null stimuliert wurden, um die Rosetten der Zellen aufzubrechen.Fügen Sie den simulierten T-Zellen unter geeigneten BSL2+-Vorkehrungen frische oder gefrorene geerntete Viren bei einer Vielzahl von Infektionen von 3,0 hinzu. Die transduzierten T-Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, weiterhin inkubieren. An den Tagen drei und fünf zählen SIE CAR-T-Zellen und fügen Sie der Kultur frische vorgewärmte TCM hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aufrechtzuerhalten.Sechs Tage nach der Simulation entfernen Sie Perlen aus den transduzierten T-Zellen, indem Sie zuerst die Zellen ernten und wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellen in 50 Milliliter konische Röhren und legen Sie die Rohre in einem Magneten für eine Minute. Nach dem Sammeln des CAR-T-zellhaltigen Überstandes und dem Wegwerfen der Perlen, legen Sie die Zellen mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in einen Kulturkolben zurück in die Kultur.Verwenden Sie eine Stichprobe von Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Oberflächenexpression der CARs zu bewerten. Den Rest inkubieren, um die Expansion wieder aufzunehmen und dann die Zellen an Tag acht zu ernten und zu kryo-konservieren, wie im Manuskript beschrieben. Um den granulozyten Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA, wie im Manuskript beschrieben.Transfektionsreagenzien bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation, fügen Sie sie zu den 293 T-Zellen, die 70 bis 90% Konfluenz erreicht haben und Kultur der transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, um ein Lentivirus zu produzieren. Nach 24 und 48 Stunden virushaltigen Überstand durch Ultrazentrifugation in 50 Milliliter Ultrazentrifugenröhren ernten und konzentrieren und bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung einfrieren.Dann am ersten Tag, sanft die T-Zellen wieder aussetzen, um Rosetten aufzubrechen. In einem BSL2+zugelassenen Labor, um CAR-T-Zellen zu erzeugen, fügen Sie CAR19 lentivirus und GMCSF-targeting CRISPR lentivirus zu den simulierten T-Zellen hinzu. Am dritten Tag und Tag fünf für erfolgreich transduzierte lentiCRISPR-bearbeitete T-Zellen mit Puromycinresistenz, behandeln Zellen mit Puromycindihydrochlorid in einer Konzentration von einem Mikrogramm Puromycin pro Milliliter.Die Gezeitensequenzierung wurde verwendet, um eine GM-CSF-Reduktion in GM-CSF-Knockout CART19-Zellen mit einer Störeffizienz von ca. 71% Flow-Plots von CAR-T-Zelloberflächenfärbungen zu bestätigen, die auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt sind, zeigen, dass sowohl wild-type CART19 als auch GM-CSF knockout CART19 erfolgreich und in ähnlicher Weise den CAR-Oberflächenrezeptor in vitro ausdrücken. Auf der anderen Seite zeigt die intrazelluläre Färbung von GM-CSF durch Durchflusszytometrie, die auch auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt ist, eine verminderte Expression von GM-CSF in den Knockout-Zellen im Vergleich zu wildtypisierten CART19-Zellen, die den funktionellen Erfolg des Knockouts bestätigen. Besondere Vorsicht ist bei den Transduktionsschritten dieses Verfahrens geboten, da sie für die Entwicklung genetisch veränderter CAR-T-Zellen am wichtigsten sind.Die beschriebene Methode kann möglicherweise auf eine Vielzahl von Genen angewendet werden, um CAR-T-Zellen über CRISPR/CAS9 zu modifizieren, um ein weniger toxisches und effektiveres Produkt zu erzeugen. Die CRISPR/CAS9-Technologie bietet Strategien, um direkt auf das Genom von CAR-T-Zellen zu zielen, um Lösungen für aktuelle klinische Mängel zu entwickeln.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Forschung

Krebsforschung

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...