Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת באמצעות מענקים מ K12CA090628 (SSK), הלאומי סרטן מקיף ברשת (SSK), מרכז הקליניקה של מאיו עבור הרפואה האישית (SSK), קרן Predolin (SSK), משרד מרפאת מאיו של תרגום לתרגול (SSK), ו התוכנית מדען רפואי מאיו מרפאת הדרכה רוברט ל. האוול מלגה מדען (RMS).

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הלוח המוסדי של מרפאת מאיו (IRB) והועדה הביובטיטיתית המוסדית (IBC).
1. הפקת תא CART19
<ol><li>בידוד תא T, גירוי ותרבות vivo לשעבר<ol>
<li>לבצע את כל התרבות תאים העבודה במכסה של תרבות התא ניצול ציוד הגנה אישית מתאים. בציר דם היקפי בתאי מוננובית (PBMCs) מתוך מזוהה התא?...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

בדו ח זה, אנו מתארים מתודולוגיה לניצול CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כדי לגרום שינויים משניים בתאי רכב-T. באופן ספציפי, זה מוצג באמצעות התמרה ויראלית עם וקטור ויראלי המכיל gRNA מיקוד הגן של עניין Cas9 לייצר GM-שדרתי התאיםk/o CART19. הצגנו בעבר כי הניטרול של GM-שדרתי נטרול קילה CRS ו-NT במודל מבע. 12 ?...

שצ קולטן אנטיגן T (רכב-T) טיפול תא מציג הבטחה גדולה לטיפול בסרטן. מיכל בן , 2 שתי מכונית-T טיפולים תא המיקוד CD19 (CART19) אושרו לאחרונה בארצות הברית הצהיר ובאירופה לשימוש B ממאירות תא לאחר הוכחת תוצאות מדהימות ב מולטיב להיכנס ניסויים קליניים. מיכל שלוש , ד , 5 מחסומים לשימוש נרחב יותר של מכונית-T תאים הם פעילות מוגבלת של גידולים מוצקים ורעלים משויכים כולל תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT). מיכל שלוש , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9 כדי לשפר את המדד התרפויטי של מכונית-t טיפול בתאים, הנדסת הגנום כלים כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, talens, ו CRISPR מועסקים לשנות עוד יותר תאים מכונית-t בניסיון לייצר פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-t תאים. מיכל עשור , מיכל בן 11
במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי ליצור CRISPR/Cas9 לערוך תאים רכב-T. המטרה הספציפית של שיטה זו היא לשנות גנטית בתאי רכב-T במהלך ייצור תא רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי ליצור פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-T תאים. הרציונל לפיתוח מתודולוגיה זו בנויה על הלקחים שנלמדו מניסיון קליני של הטיפול בתאי רכב T, אשר מצביע על צורך דחוף אסטרטגיות הרומן כדי להגביר את החלון הטיפולי של המכונית-T טיפול בתאי ולהרחיב את היישום לתוך גידולים אחרים נתמך על ידי ההתקדמות האחרונה בביולוגיה סינתטי המאפשר שינויים מרובים של תאים רכב-T שהתחילו להיכנס למרפאה. בעוד כמה כלים הנדסת הגנום מפותחים ומיושמים בהגדרות שונות, כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, TALENs, ו CRISPR, המתודולוגיה שלנו מתארת CRISPR/Cas9 שינוי של תאים מכונית-T. מיכל עשור , 11 crispr/Cas9 הוא מנגנון RNA מבוססי הגנה בקטריאלי אשר נועד לחסל DNA זר. CRISPR מסתמך על האנונוקיטיות כדי לדבוק רצף היעד מזוהה דרך RNA מדריך (gRNA). העריכה CRISPR של התאים רכב-T מציע מספר יתרונות על פני כלים אחרים הנדסת הגנום. אלה כוללים דיוק של רצף gRNA, פשטות לעצב gRNA מיקוד את הגן של עניין, גבוה לעריכת היעילות של הגן, ואת היכולת למקד גנים מרובים מאז Grna מרובים ניתן להשתמש באותו זמן.
באופן ספציפי בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו בקידוד מדריך CRISPR לקודד וירוס RNA ו Cas9 לשבש גן במהלך התמרה מכונית של תאי T. בבחירת הטכניקה המתאימה כדי לערוך מכונית T תאים, אנו מציעים את הטכניקה המתוארת כאן הוא מנגנון יעיל כדי ליצור מחקר כיתה תא רכב T, אבל בגלל ההשפעה לטווח ארוך של שילוב קבוע של Cas9 לתוך הגנום אינו ידוע, אנו להציע מתודולוגיה זו כדי לפתח הוכחה של מחקר המושג תאים-T בכיתה רכב, אבל לא להפקת טוב בפועל ייצור תאים מכונית-T.
בפרט, כאן אנו מתארים את הדור של גרנולוציט מקרופאג המושבה גורם מגרה (GM-שדרתי) הסתרה מכונית T תאים מיקוד האדם CD19. אלה תאי רכב-T נוצרו על ידי התמרה עם חלקיקים לקידוד מדריך RNA ספציפי GM-שדרתי (שם גן CSF2) ו Cas9. בעבר מצאנו כי הניטרול של GM-שדרתי הCRS קילה ו-NT במודל מבע. 12 GM-שדרתי מכוניותk/o -T תאים לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור הרכב-T תא אנטי גידול פעילות והישרדות vivo לעומת ווילטיפ רכב-t תאים. 12 לכן, כאן אנו מספקים מתודולוגיה כדי ליצור CRISPR/CAS9 לרכב תאים T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

צ ' ושמעון אנטיגן לקולטן T (רכב-T) הטיפול בתאים הוא קצה חיתוך ואפשרות הטיפול המהפכני החדש של סרטן. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות לשימוש נרחב בטיפול בסרטן. מגבלות אלה כוללות פיתוח של רעלים ייחודיים כגון תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT) והרחבה מוגבלת, פונקציות אפקטור, ופעילות נגד הגידול בגידולים מוצקים. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות רכב-T ו/או בקרת רעלים של תאי רכב-T היא לערוך את הגנום של התאים רכב-T עצמם במהלך ייצור תא רכב T. כאן, אנו מתארים את השימוש CRISPR/Cas9 gene העריכה בתאי רכב-T באמצעות התמרה עם בניית לנטינגיזציה המכילה RNA מדריך כדי גרנולוציט מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-שדרתי) ו Cas9. כדוגמה, אנו מתארים CRISPR/Cas9 בתיווך מתווכת של GM-שדרתי. הראינו כי אלה מוטורס-מכוניות מסוגk/o מכונית T לייצר ביעילות gm-שדרתי פחות, תוך שמירה על פונקציית התאים הקריטיים t ותוצאה של פעילות אנטי סרטניים משופרת vivo לעומת מסוג פראי רכב-T תאים.

איור 1 מראה הפחתה של gm-שדרתי ב gm-שדרתי CART19 תאיםk/o . כדי לוודא כי הגנום של התאים T שונתה לנוקאאוט GM-שדרתי, רצף הגאות שימש בתאי GM/o CART19 (איור 1a). רכב-T תא המשטח הצביעת מוודאת כי התאים T לבטא בהצלחה את קולטן פני השטח של המכונית בחוץ גופית ע...

Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את השינוי הגנטי של תא CAR-T במהלך הייצור שלהם באמצעות טכנולוגיית CRISPR כדי ליצור מוצר יעיל יותר ופחות רעיל. היתרון של טכניקה זו הוא כי ייצור תא CAR-T ומניפולציה גנטית יכולים להתרחש בתא אחד עם יעילות טובה. הדגימה של ההליך תהיה רוזלי סטרנר, דוקטורנטית לרפואה, מישל קוקס, טכנולוגית וסטודנטית לתואר שני, וראונה סאקורה, פוסט דוקטורטורית, מהמעבדה שלי.לאחר בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי שנקטפו, התחל ללטף אותם על-ידי הכנת מדיום תאי T ולאחר מכן עיקורו על-ידי סינונו באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.22 מיקרומטר. ביום של גירוי תא T או יום אפס, לפני הגירוי, לשטוף חרוזי CD3/CD28 על ידי הצבת נפח הנדרש של חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר ו resuspending במיליליטר אחד של TCM. מניחים את הצינור במגע עם מגנט לדקה אחת.לאחר מכן שאפו את ה- TCM והקדישו מיליליטר אחד של TCM טרי לשטוף שוב את החמרוזים ולחזור על סך של שלוש שטיפות. ולבסוף, תן שימוש חוזר גם את חרוזים במיליליטר אחד של TCM. לאחר ספירת תאי ה- T, העבר את חרוזים לתאי T ביחס של שלושה עד חרוזים אחד לתאים.לאחר מכן לדלל את התאים לריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 במשך 24 שעות. לאחר רכישת מבנה CART19 בווקטור lentiviral, לבצע ייצור lentiviral על ידי הדגירה הראשונה lentiviral פלסמיד, וקטור אריזה, וקטור מעטפה, reagent precomplexing, reagent transfection, ו מדיום transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לבצע עבודה lentiviral באמצעות BSL2 + אמצעי זהירות כולל מכסה המנוע תרבות התא, ציוד מגן אישי, וחיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני סילוק.לאחר הדגירה, הוסיפו את אותם רה-גנטים טרנספקטיים ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המרובים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ב 24 ו 48 שעות לאחר transfection, קציר, צנטריפוגה, לסנן ולרכז על טבעי המכיל וירוסים על ידי אולטרה צנטריפוגה להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ביום הראשון, תן שימוש חוזר בעדינות בתאי T שעוררו במיליון תאים למיליליטר ביום אפס כדי לשבור את רוזט התאים.תחת אמצעי זהירות מתאימים BSL2+, להוסיף וירוס טרי או קפוא שנקטפו לתאי T מדומה בריבוי של זיהום של 3.0. המשך להדרגר את תאי T מתומרים ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2. בימים 3 ו-5, לספור תאי CAR-T ולהוסיף TCM מחומם מראש טרי לתרבות כדי לשמור על ריכוז תא CAR-T של מיליון תאים למיליליטר.שישה ימים לאחר הסימולציה, להסיר חרוזים מן תאי T מתומרים על ידי קציר הראשון ו resuspending התאים. מעבירים את התאים בצינורות חרוטיים 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות במגנט למשך דקה אחת. לאחר איסוף CAR-T תא המכיל supernatant והשליכת חרוזים, למקם את התאים בחזרה בתרבות בריכוז של מיליון תאים למיליליטר בבקבוק תרבות.השתמש בדגימת תאים עבור ציטומטריית זרימה כדי להעריך את ביטוי פני השטח של רשות האישורים. הדגירה את השאר כדי לחדש את ההתרחבות ולאחר מכן לקצור ול Cryo-לשמר את התאים ביום שמונה כמתואר בכתב היד. כדי לשבש את הגורם מגרה מושבת מקרופאג גרנולוציטים, השתמש במדריך RNA כמתואר בכתב היד.דגירה reagents transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו אותם ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המפוסלים ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 כדי לייצר lentivirus. ב 24 ו 48 שעות, לקצור ולרכז וירוס המכיל על טבעי על ידי אולטרהצנטריפוגציה ב 50 צינורות אולטרהצנטריפוגה מיליליטר להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.ואז ביום הראשון, בעדינות להשתמש בתאי T כדי לשבור רוזטות. במעבדה מאושרת BSL2+, כדי ליצור תאי CAR-T, להוסיף CAR19 lentivirus ו- GMCSF מיקוד CRISPR lentivirus לתאי T מדומה. ביום השלישי והיום החמישי עבור תאי T שנערכו בהצלחה על ידי lentiCRISPR הנושאים עמידות לפורומיצין, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוכלוריד בריכוז של מיקרוגרם אחד של puromycin למיליליטר.רצף הגאות שימש כדי לאשר הפחתת GM-CSF בתאי CART19 נוקאאוט GM-CSF עם יעילות שיבוש של כ 71% זרימה חלקות של כתם משטח תא CAR-T מגודר על תאים חיוביים CD3 לחיות להראות כי הן פראי סוג CART19 ו- GM-CSF נוקאאוט CART19 בהצלחה ובאופן דומה לבטא את קולטן משטח CAR במבחנה. מצד שני, כתמים תאיים של GM-CSF על ידי ציטומטריה זרימה גם מגודר על תאים חיוביים CD3 חי מדגים ביטוי מופחת של GM-CSF בתאי הנוקאאוט לעומת תאי CART19 מסוג בר המאשרים הצלחה תפקודית של הנוקאאוט. טיפול מסוים צריך להילקח במהלך שלבי ההעתקה של הליך זה כפי שהם הקריטיים ביותר להתפתחות של תאי CAR-T מהונדסים גנטית.המתודולוגיה המתוארת עשויה להיות מיושמת על מגוון גנים כדי לשנות תאי CAR-T באמצעות CRISPR /CAS9 כדי לעזור ליצור מוצר פחות רעיל ויעיל יותר. טכנולוגיית CRISPR/CAS9 מספקת את האסטרטגיות למקד ישירות את הגנום של תאי CAR-T כדי להנדס פתרונות לחסרונות הקליניים הנוכחיים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

עכבר Syngeneic B-Cell לימפומה מודל להערכת קליניים בתאי T המכונית CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

השתלת צינורית תוך גולגולתית עבור קולטן אנטיגן כימרי טורי (CAR) עירוי תאי T בעכברים

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...