Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto attraverso sovvenzioni da K12CA090628 (SSK), la National Comprehensive Cancer Network (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), la Predolin Foundation (SSK), l'Ufficio Mayo Clinic of Translation to Practice (SSK) e il programma di formazione Per studenti della Mayo Clinic Medical Scientist Robert L. Howell Medical-Scientist Scholarship (RMS).

Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) di Mayo Clinic e del Institutional Biosafety Committee (IBC).
1. Produzione di cellule CART19
<ol><li>Isolamento, stimolazione e cultura delle cellule T<ol>
<li>Eseguire tutto il lavoro di coltura cellulare in una cappa di coltura cellulare utilizzando attrezzature di protezione personale appropriate. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da coni di sangue normali donatori de-identificati ...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

In questo rapporto, descriviamo una metodologia per utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per indurre modifiche secondarie nelle cellule CAR-T. In particolare, questo è dimostrato utilizzando la trasduzione lentivirale con un vettore virale che contiene gRNA mirando al gene di interesse e Cas9 per generare cellule GM-CSFk/o CART19. In precedenza avevamo dimostrato che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 Come descritto in precedenza, le cellule...

La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una grande promessa nel trattamento del cancro. 1 : il nome del , 2 Due terapie cellulari CAR-T rivolte a CD19 (CART19) sono state recentemente approvate negli Stati Uniti e in Europa per l'uso in neoplasie delle cellule B dopo aver dimostrato risultati sorprendenti negli studi clinici multicentri. 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Le barriere all'uso più diffuso delle cellule CAR-T sono attività limitate nei tumori solidi e nelle tossicità associate, tra cui la sindrome di rilascio di citochine (CRS) e la neurotossicità (NT). 3 (COM del nome , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 Per migliorare l'indice terapeutico della terapia cellulare CAR-T, vengono impiegati strumenti di ingegneria genomica come nucleasi di dita di zinco, TALEN e CRISPR per modificare ulteriormente le cellule CAR-T nel tentativo di generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. 10 del sistema , 11 Del sistema di
In questo articolo viene descritto un metodo per generare celle CAR-T modificate CRISPR/Cas9. L'obiettivo specifico di questo metodo è quello di modificare geneticamente le cellule CAR-T durante la produzione di cellule CAR-T tramite CRISPR/Cas9 per generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. La motivazione per sviluppare questa metodologia si basa sulle lezioni apprese dall'esperienza clinica della terapia cellulare CAR-T, che indica un'urgente necessità di nuove strategie per aumentare la finestra terapeutica della terapia cellulare CAR-T e per estendere l'applicazione in altri tumori ed è supportato dai recenti progressi nella biologia sintetica che consentono più modifiche di cellule CAR-T che hanno iniziato ad entrare nella clinica. Mentre diversi strumenti di ingegneria genomica sono in fase di sviluppo e applicazione in diversi ambienti, come le nucleasi di dita di zinco, i TALENs e il CRISPR, la nostra metodologia descrive la modifica CRISPR/Cas9 delle cellule CAR-T. 10 del sistema , 11 CRISPR/Cas9 è un meccanismo di difesa batterico basato sull'RNA progettato per eliminare il DNA estraneo. CRISPR si basa su endonucleasi per fendere una sequenza bersaglio identificata attraverso un RNA guida (gRNA). L'editing CRISPR delle cellule CAR-T offre diversi vantaggi rispetto ad altri strumenti di ingegneria genomica. Questi includono la precisione della sequenza di gRNA, la semplicità di progettare un gRNA che colpisca il gene di interesse, l'elevata efficienza di editing genico e la capacità di indirizzare più geni poiché più gRNA possono essere utilizzati contemporaneamente.
In particolare nei metodi qui descritti, abbiamo usato un lentivirus che codifica l'RNA e la guida CRISPR per interrompere un gene durante la trasduzione CAR delle cellule T. Nella scelta di una tecnica appropriata per modificare le cellule CAR-T, suggeriamo che la tecnica descritta di seguito sia un meccanismo efficiente per generare cellule CAR-T di grado di ricerca, ma poiché l'effetto a lungo termine dell'integrazione permanente del Cas9 nel genoma è sconosciuto, non è noto proporre questa metodologia per sviluppare prove di ricerca di grado CAR-T cellule, ma non per la produzione di buona pratica di produzione grado CAR-T cellule.
In particolare, qui descriviamo la generazione di granulociti colonia macrofato stimolante fattore di stimolazione (GM-CSF) knockout cellule CAR-T di mira persone umane CD19. Queste cellule CAR-T sono state generate dalla trasduzione con particelle lentivirali che codificano una guida RNA specifica di GM-CSF (gene name CSF2) e Cas9. In precedenza abbiamo scoperto che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 cellule GM-CSFk/o CAR-T consentono l'inibizione di GM-CSF durante il processo di produzione, riducendo efficacemente la produzione di GM-CSF migliorando nel contempo l'attività antitumorale delle cellule CAR-T e la sopravvivenza in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico. 12 Così, qui forniamo una metodologia per generare cellule CAR-T modificate CRISPR/Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una nuova opzione di trattamento all'avanguardia e potenzialmente rivoluzionaria per il cancro. Tuttavia, ci sono limitazioni significative al suo uso diffuso nel trattamento del cancro. Queste limitazioni includono lo sviluppo di tossicità uniche come la sindrome del rilascio di citochine (CRS) e neurotossicità (NT) e l'espansione limitata, le funzioni degli efumani e l'attività anti-tumorale nei tumori solidi. Una strategia per migliorare l'efficacia car-T e/o la tossicità del controllo delle cellule CAR-T consiste nel modificare il genoma delle cellule CAR-T stesse durante la produzione di cellule CAR-T. Qui, descriviamo l'uso dell'editing del gene CRISPR/Cas9 nelle cellule CAR-T attraverso la trasduzione con un costrutto lentivirale contenente un RNA guida al granulocito macrofato fattore stimolante della colonia (GM-CSF) e Cas9. Ad esempio, descriviamo CRISPR/Cas9 mediato knockout di GM-CSF. Abbiamo dimostrato che queste cellule GM-CSFk/o CAR-T producono efficacemente meno GM-CSF, pur mantenendo la funzione critica delle cellule T e si traducono in una maggiore attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico.

La figura 1 mostra la riduzione di GM-CSF nelle celle GM-CSFk/o CART19. Per verificare che il genoma delle cellule T sia stato alterato per eliminare la GM-CSF, il sequenziamento TIDE è stato utilizzato nelle cellule GM-CSFk/o CART19 (Figura 1A). La colorazione della superficie delle cellule CAR-T verifica che le cellule T esprimano con successo il recettore della superficie CAR in vitro gating su cellule C...

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Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Il nostro protocollo descrive la modificazione genetica delle cellule CAR-T durante la loro produzione attraverso la tecnologia CRISPR per generare prodotti più efficaci e meno tossici. Un vantaggio di questa tecnica è che la produzione di cellule CAR-T e la manipolazione genetica possono verificarsi entrambe in una cellula con una buona efficienza. A dimostrare la procedura saranno Rosalie Sterner, dottoranda, Michelle Cox, tecnologa e studentessa laureata, e Reona Sakemura, post-dottorato, del mio laboratorio.Dopo aver isolato le cellule T dalle cellule mononucleari del sangue periferico raccolte, inizia a coltivarle preparando prima il mezzo a cellule T e poi sterilizzandole filtrandole attraverso un filtro sterile sottovuoto da 0,45 micrometri e poi con un filtro sottovuoto sterile da 0,22 micrometri. Il giorno della stimolazione delle cellule T o del giorno zero, prima della stimolazione, lavare le perline CD3/CD28 posizionando il volume richiesto di perline in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri e rimosintendo in un millilitro di TCM. Posizionare il tubo a contatto con un magnete per un minuto.Quindi aspirare il TCM e rimescolare in un millilitro di TCM fresco per lavare di nuovo le perline e ripetere per un totale di tre lavaggi. E infine, rimospendare le perline in un millilitro di TCM. Dopo aver contato le cellule T, trasferire le perline alle cellule T con un rapporto di tre a una perline con le cellule.Quindi diluire le cellule a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per 24 ore. Dopo aver acquisito un costrutto CART19 in un vettore lentivirale, eseguire la produzione lentivirale incubando prima il plasmide lentivirale, il vettore di imballaggio, il vettore dell'inviluppo, il reagente precomplesso, il reagente di trasfezione e il mezzo di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Eseguire lavori lentivirali utilizzando precauzioni BSL2+, tra cui cappe di coltura cellulare, dispositivi di protezione individuale e disinfezione di materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.Dopo l'incubazione, aggiungere questi reagenti di trasfezione alle 293 cellule T che hanno raggiunto il 70-90% di confluenza e coltura le cellule trasfette a 37 gradi Celsius e 5%CO2. A 24 e 48 ore dalla trasfezione, raccolta, centrifuga, filtra e concentrato il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Il primo giorno, rimorsiva delicatamente le cellule T che sono state stimolate a un milione di cellule per millilitro il giorno zero al fine di rompere le rosette delle cellule.In base alle opportune precauzioni BSL2+, aggiungere virus raccolto fresco o congelato alle cellule T simulate a una molteplicità di infezione di 3.0. Continuare a incubare le cellule T trasdotto a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Nei giorni tre e cinque, contare le cellule CAR-T e aggiungere TCM fresco pre-riscaldato alla coltura per mantenere una concentrazione cellulare CAR-T di un milione di cellule per millilitro.Sei giorni dopo la simulazione, rimuovere le perline dalle cellule T trasdotto raccogliendo e riutilizzando le cellule. Trasferire le celle in tubi conici da 50 millilitri e posizionare i tubi in un magnete per un minuto. Dopo aver raccolto il supernatante contenente cellule CAR-T e aver scartato le perline, riposizionare le cellule in coltura ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in un pallone di coltura.Utilizzare un campione di cellule per la citometria del flusso per valutare l'espressione superficiale dei CATE. Incubare il resto per riprendere l'espansione e quindi raccogliere e crio-preservare le cellule all'ottavo giorno come descritto nel manoscritto. Per interrompere il fattore stimolante della colonia di macrofagi granulociti, utilizzare un RNA guida come descritto nel manoscritto.Incubare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungili alle 293 cellule T che hanno raggiunto la confluenza dal 70 al 90% e coltivi le cellule trasfette a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per produrre un lentivirus. A 24 e 48 ore, raccogliere e concentrare il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione in tubi ultracentrifugi da 50 millilitri e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.Quindi, il primo giorno, rimospensì delicatamente le cellule T per rompere le rosette. In un laboratorio approvato da BSL2+, per generare cellule CAR-T, aggiungere il lentivirus CAR19 e il lentivirus CRISPR mirato al GMCSF alle cellule T simulate. Il terzo e quinto giorno per le cellule T modificate lentiCRISPR con successo che trasportano resistenza alla puromicina, trattare le cellule con puromicina diidrocloruro ad una concentrazione di un microgrammo di puromicina per millilitro.Il sequenziamento delle maree è stato utilizzato per confermare una riduzione GM-CSF delle cellule CART19 knockout GM-CSF con un'efficienza di interruzione di circa il 71% I grafici di flusso della colorazione della superficie cellulare CAR-T gated su cellule positive CD3 in diretta mostrano che sia cart19 di tipo selvaggio che GM-CSF knockout CART19 con successo e in modo simile esprimono il recettore di superficie CAR in vitro. D'altra parte, la colorazione intracellulare di GM-CSF per citometria a flusso gated anche su cellule positive cd3 in diretta dimostra una diminuzione dell'espressione di GM-CSF nelle cellule knockout rispetto alle cellule CART19 di tipo selvatico che confermano il successo funzionale del knockout. Particolare attenzione dovrebbe essere presa durante le fasi di trasduzione di questa procedura in quanto sono le più critiche per lo sviluppo di cellule CAR-T geneticamente modificate.La metodologia descritta può potenzialmente essere applicata a una varietà di geni per modificare le cellule CAR-T tramite CRISPR/CAS9 per aiutare a generare un prodotto meno tossico e più efficace. La tecnologia CRISPR/CAS9 fornisce le strategie per indirizzare direttamente il genoma delle cellule CAR-T per progettare soluzioni alle attuali carenze cliniche.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

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Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

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Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

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Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

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Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

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