Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
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この研究は、K12CA090628(SSK)、国立総合癌ネットワーク(SSK)、メイヨークリニックセンター(SSK)、プレドリン財団(SSK)、メイヨークリニック実践局(SSK)の助成金を通じて支援されました。メイヨークリニック医療科学者養成プログラムロバートL.ハウエル医師-科学者奨学金(RMS)。

このプロトコルは、メイヨークリニックの機関審査委員会(IRB)および機関バイオセーフティ委員会(IBC)のガイドラインに従っています。
1. CART19細胞生産
<ol><li>T細胞単離、刺激、および生体内培養<ol>
<li>適切な個人用保護具を用いた細胞培養フード内のすべての細胞培養作業を行う。これらはPBMCの生存可能な供給源であることが知られているとして、アフェレス中に採取...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

本報告では,CRISPR/Cas9技術を利用してCAR-T細胞に二次修飾を誘導する方法論について述べた.具体的には、目的の遺伝子を標的とするgRNAとCas9を含むウイルスベクターを用いてレンチウイルス伝達を用いてGM-CSFk/o CART19細胞を生成することが実証されている。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを示した。12前述したように、GM-CSFk/o</...

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、癌の治療において大きな期待を示す。1,2 CD19(CART19)を標的とする2つのCAR-T細胞療法は、マルチセンター臨床試験で顕著な結果を実証した後、B細胞悪性腫瘍の使用のために最近、米国で承認されました。3,4,5 CAR-T細胞のより広範な使用への障壁は、固形腫瘍およびサイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)を含む関連毒性における限られた活性である。3,5,6,7,8,9 CAR-T細胞治療の治療指標を高めるために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなどのゲノム工学ツールを用いて、CAR-T細胞をさらに改変し、毒性の低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成する試みを行います。10歳,11歳
この記事では、CRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法について説明します。この方法の具体的な目的は、CRISPR/Cas9を介したCAR-T細胞製造中にCAR-T細胞を遺伝的に改変し、毒性が低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成することです。この方法論を開発するための根拠は、CAR-T細胞療法の臨床経験から学んだ教訓に基づいて構築されており、CAR-T細胞療法の治療窓口を拡大し、適用を拡大するための新しい戦略の緊急の必要性を示しています。他の腫瘍および合成生物学の最近の進歩によって支えられ、診療所に入り始めたCAR-T細胞の複数の修飾を可能にする。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなど、さまざまな設定で複数のゲノム工学ツールが開発・応用されていますが、CAR-T細胞のCRISPR/Cas9改質について説明しています。10歳,11 CRISPR/Cas9は外来DNAを除去するように設計されているRNAベースの細菌防御機構である。CRISPRは、ガイドRNA(gRNA)を介して同定された標的配列を切り分けるためにエンドノクレアーゼに依存しています。CAR-T細胞のCRISPR編集は、他のゲノム工学ツールに対していくつかの利点を提供します。これらには、gRNA配列の精度、目的の遺伝子を標的とするgRNAを設計する簡易性、高い遺伝子編集効率、および複数のgRNAを同時に使用できるため、複数の遺伝子を標的とする能力が含まれる。
具体的には、ここで説明する方法では、CRISPRガイドRNAとCas9をコードするレンチウイルスを用いて、T細胞のCAR伝達中に遺伝子を破壊した。CAR-T細胞を編集するための適切な手法を選択する際には、ここで説明する技術は、研究グレードのCAR-T細胞を生成する効率的なメカニズムであることを示唆していますが、Cas9をゲノムに永久的に統合する長期的な効果は不明であるため、この方法論は、概念実証研究グレードCAR-T細胞を開発するために提案するが、良好な製造実践グレードCAR-T細胞を製造するためのものではない。
特に、ヒトCD19を標的とする顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ノックアウトCAR-T細胞の生成について説明する。これらのCAR-T細胞は、GM-CSF(遺伝子名CSF2)およびCas9に特異的なガイドRNAをコードするレンチウイルス粒子との伝達によって生成された。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを見出した。12 GM-CSFk/o CAR-T細胞は、製造プロセス中のGM-CSFの阻害を可能にし、野生型CAR-T細胞と比較してCAR-T細胞抗腫瘍活性および生体内での生存を高めながら、GM-CSFの産生を効果的に減少させる。12このように、ここではCRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法論を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、がんに対する最先端かつ潜在的に革命的な新しい治療オプションです。しかし、癌の治療におけるその広範な使用には重大な制限がある。これらの制限には、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)などのユニークな毒性の開発と、固形腫瘍における限定的な拡張、エフェクター機能、および抗腫瘍活性が含まれる。CAR-T細胞の有効性および/または制御毒性を高めるための1つの戦略は、CAR-T細胞製造中にCAR-T細胞自体のゲノムを編集することです。ここでは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびCas9へのガイドRNAを含むレンチウイルス構造を用いたトランスダクションによるCAR-T細胞におけるCRISPR/Cas9遺伝子編集の使用について述べた。例として、GM-CSFのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトについて説明する。これらのGM-CSFk/o CAR-T細胞は、重要なT細胞機能を維持しながらGM-CSFを効果的に産生し、野生型CAR-T細胞と比較して生体内で抗腫瘍活性を高める結果をもたらすことを示した。

図1は、GM-CSFk/o CART19細胞におけるGM-CSFの減少を示す。T細胞のゲノムがノックアウトGM-CSFに改変されたことを確認するために、TIDEシーケンシングをGM-CSFk/o CART19細胞(図1A)で使用した。CAR-T細胞表面染色は、T細胞が生きているCD3+細胞にゲーティングすることによりインビトロでCAR表面受容体を正常に発現して?...

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Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。

CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

当社のプロトコルは、CRISPR技術を介して製造中のCAR-T細胞の遺伝子改変を記述し、より効果的で毒性の低い製品を生成します。この技術の利点は、CAR-T細胞の産生と遺伝子操作の両方が効率の良い1つの細胞で起こり得る点である。この手順のデモンストレーションは、MD博士課程の学生であるロザリー・スターナー、技術者で大学院生のミシェル・コックス、私の研究室の博士研究員のレオナ・サケムラです。採取した末梢血単核細胞からT細胞を単離した後、最初にT細胞培地を調製し、0.45マイクロメートルの無菌真空フィルターを通してそれを濾過し、0.22マイクロメートルの無菌真空フィルターで殺菌することによって培養を開始する。T細胞刺激またはゼロ日の日には、刺激の前に、無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに必要な量のビーズを入れ、TCMの1ミリリットルで再懸濁してCD3/CD28ビーズを洗浄します。チューブを磁石に1分間接触します。その後、TCMを吸引し、新鮮なTCMの1ミリリットルで再懸濁してビーズを再び洗浄し、合計3回の洗浄を繰り返します。そして最後に、ビーズをTCMの1ミリリットルで再中断します。T細胞を数えた後、ビーズをT細胞に3対1のビーズの比率で細胞に移す。その後、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度に細胞を希釈し、摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートします。LENTiviralベクターでCART19コンストラクトを取得した後、レンチウイルスプラスミド、包装ベクター、エンベロープベクター、前錯化試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション培地を室温で30分間インキュベートすることによりレンチウイルス産生を行う。BSL2+の予防措置を使用してレンチウイルス作業を行い、細胞培養フード、個人用保護具、廃棄前に使用済み物質の漂白剤による消毒を行います。インキュベーション後、これらのトランスフェクション試薬を70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクト細胞を摂氏37度および5%CO2で培養します。トランスフェクション、収穫、遠心分離機、超遠心分離によるウイルス含有上清を濾過し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結した後、24時間と48時間後に。初日、ゼロ日目に1ミリリットル当たり100万個の細胞で刺激されたT細胞を穏やかに再懸濁し、細胞のロゼットを分解する。適切なBSL2+予防策の下で、3.0の感染の多重度でシミュレートされたT細胞に新鮮または凍結収穫されたウイルスを追加する。トランスデューションされたT細胞を摂氏37度、5%CO2でインキュベートし続ける。3日目と5日目に、CAR-T細胞を数え、新鮮な事前温められたTCMを培養物に加え、1ミリリットル当たり100万個の細胞のCAR-T細胞濃度を維持する。シミュレーションの6日後、細胞を最初に採取して再懸濁させることで、トランスデューシングされたT細胞からビーズを取り除きます。50ミリリットルの円錐管で細胞を移し、1分間磁石にチューブを入れる。CAR-T細胞含有上清を回収し、ビーズを廃棄した後、培養フラスコ中の1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で細胞を培養に戻す。フローサイトメトリーの細胞サンプルを使用して、CALの表面発現を評価します。残りをインキュベートして拡張を再開し、原稿に記載されているように8日目に細胞を収穫して凍結保存します。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を破壊するために、原稿に記載されているガイドRNAを利用する。トランスフェクション試薬を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクション細胞を摂氏37度、5%CO2で培養し、レンチウイルスを産生する。24時間と48時間で、50ミリリットル超遠心チューブで超遠心分離することによりウイルス含有上清を収穫し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結する。そして1日目に、T細胞を穏やかに再中断してロゼットを分解します。BSL2+承認された実験室で、CAR-T細胞を生成するために、CAR19レンチウイルスおよびGMCSF標的CRISPRレンチウイルスをシミュレートされたT細胞に加える。3日目と5日目に、ピューロマイシン耐性を持つLentiCRISPR編集T細胞を正常にトランスデューシングし、1ミリリットル当たり1マイクログラムのピューロマイシンの濃度でプロマイシンジヒドロクロリドを有する細胞を治療する。潮汐シーケンシングは、生きたCD3陽性細胞にゲート付きCAR-T細胞表面染色ゲートの約71%フロープロットの破壊効率を有するGM-CSFノックアウトCART19細胞のGM-CSF減少を確認するために使用され、野生型CART19およびGM-CSFノックアウトCART19の両方が正常に、同様の方法でCAR受容体を発現することを示す。一方、フローサイトメトリーによるGM-CSFの細胞内染色は、生きたCD3陽性細胞にもゲートされ、ノックアウトの機能的な成功を確認する野生型CART19細胞と比較して、ノックアウト細胞におけるGM-CSFの発現が低下することを示している。遺伝子組み換えCAR-T細胞の開発に最も重要であるため、この手順の導入ステップ中に特に注意する必要があります。記載された方法論は、CRISPR/CAS9を介してCAR-T細胞を改変するために様々な遺伝子に適用される可能性があり、毒性が低く、より効果的な産物を生成するのに役立ちます。CRISPR/CAS9技術は、CAR-T細胞のゲノムを直接標的にして、現在の臨床欠点に対するソリューションを設計する戦略を提供します。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

同系マウス B 細胞リンパ腫モデル CD19 車 T 細胞の前臨床評価

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

一本鎖DNA免疫蛍光法を用いた卵巣癌細胞の複製ストレスの定量化(英語)

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

マウスにおける連続局所キメラ抗原受容体(CAR)T細胞注入のための頭蓋内カニューレ移植

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...