Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet gjennom tilskudd fra K12CA090628 (SSK), National Comprehensive Cancer Network (SSK), den Mayo Clinic Center for individualisert medisin (SSK), den Predolin Foundation (SSK), den Mayo Clinic Office of Translation til Practice (SSK), og den Mayo Clinic medisinsk forsker Training program Robert L. Howell lege-forsker stipend (RMS).

Denne protokollen følger retningslinjene for Mayo Clinic ' s institusjonelle gjennomgang Board (IRB) og institusjonelle biosafety Committee (IBC).
1. CART19 celle produksjon
<ol><li>T celle isolering, stimulering, og ex-vivo kultur<ol>
<li>Utføre all cellekultur arbeid i en cellekultur hette utnytte egnet personlig verneutstyr. Harvest perifere blod mononukleære celler (Pbmc) fra de-identifiserte normal donorblod kjegler samlet under aferese som disse er kjent for å være en levedyktig k...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

I denne rapporten beskriver vi en metodikk for å utnytte CRISPR/Cas9-teknologi for å indusere sekundære modifikasjoner i CAR-T-celler. Nærmere bestemt er dette demonstrert ved hjelp lentiviral Transduction med en viral vektor som inneholder gRNA rettet mot genet av interesse og Cas9 å generere GM-CSFk/o CART19 celler. Vi hadde tidligere vist at GM-CSF nøytralisering ameliorates CRS og NT i en xenograft modell. 12 som tidligere beskrevet, GM-CSFk/o Car-T-celler tillater ...

Chimeric antigen reseptor T (CAR-T) celle terapi utstillinger store løftet i behandling av kreft. 1 den andre , 2 to bil-T celle terapier rettet mot CD19 (CART19) ble nylig godkjent i United uttalte og i Europa for bruk i B-cellen ondartet etter å ha vist slående resultater i multisenter kliniske studier. 3 andre priser , 4 andre priser , 5 barrierer for mer utbredt bruk av Car-T-celler er begrenset aktivitet i solide svulster og tilhørende toksisitet inkludert cytokin Release syndrom (CRS) og NEVROTOKSISITET (NT). 3 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9 for å forbedre den terapeutiske indeks av Car-t celle terapi, er Genova tekniske verktøy som sink finger Nukleaser, TALENS og CRISPR ansatt for ytterligere å endre Car-t-celler i et forsøk på å generere mindre giftige eller mer effektive Car-t-celler. 10 andre , 11 flere
I denne artikkelen beskriver vi en metode for å generere CRISPR/Cas9 redigerte CAR-T-celler. Det konkrete målet med denne metoden er å genetisk modifisere CAR-T-celler under CAR-T celle produksjon via CRISPR/Cas9 å generere mindre giftige eller mer effektive CAR-T-celler. Begrunnelsen for å utvikle denne metodikken er bygget på erfaringene fra klinisk erfaring med CAR-T celle terapi, som indikerer et presserende behov for romanen strategier for å øke den terapeutiske vinduet i CAR-T celle terapi og å utvide programmet til andre svulster og støttes av den nylige fremskritt i syntetisk biologi slik at flere modifikasjoner av CAR-T-celler som har begynt å gå inn i klinikken. Mens flere Genova tekniske verktøy utvikles og brukes i forskjellige innstillinger, for eksempel sink finger nukleaser, TALENs og CRISPR, beskriver vår metodikk CRISPR/Cas9 modifikasjon av CAR-T-celler. 10 andre , 11 CRISPR/Cas9 er en RNA-basert bakteriell forsvarsmekanisme som er designet for å ELIMINERE utenlandsk DNA. CRISPR baserer på endonucleases på å holde en mål sekvens identifisert gjennom en guide RNA (gRNA). CRISPR redigering av CAR-T-celler tilbyr flere fordeler fremfor andre tekniske verktøy for Genova. Disse inkluderer presisjon av gRNA sekvensen, enkelhet å designe en gRNA rettet mot genet av interesse, høy genredigering effektivitet, og evnen til å målrette flere gener siden flere gRNAs kan brukes på samme tid.
Spesielt i metodene beskrevet her, brukte vi en lentivirus koding CRISPR guide RNA og Cas9 å forstyrre et gen under CAR Transduction av T-celler. I å velge en hensiktsmessig teknikk for å redigere CAR-T-celler, foreslår vi at teknikken som er beskrevet her er en effektiv mekanisme for å generere forskning grade CAR-T-celler, men fordi den langsiktige effekten av permanent integrering av Cas9 i Genova er ukjent, vi foreslå denne metodikken for å utvikle bevis på konseptet forskning grade CAR-T-celler, men ikke for å produsere god produksjon praksis grade CAR-T-celler.
Spesielt her beskriver vi generering av granulocytt macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) knockout CAR-T-celler rettet mot menneskelig CD19. Disse CAR-T celler ble generert av Transduction med lentiviral partikler koding en guide RNA spesifikke for GM-CSF (Gen navn CSF2) og Cas9. Vi har tidligere funnet ut at GM-CSF nøytralisering ameliorates CRS og NT i en xenograft modell. 12 GM-CSFk/o Car-T-celler tillater HEMMING av GM-CSF under produksjonsprosessen, effektivt redusere PRODUKSJONEN av GM-CSF samtidig forbedre Car-t celle anti-tumor aktivitet og overlevelse in vivo sammenlignet med wildtype Car-T-celler. 12 derfor, her gir vi en metodikk for å generere CRISPR/CAS9 redigert Car-T-celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

Chimeric antigen reseptor T (CAR-T) celle terapi er en cutting edge og potensielt revolusjonerende ny behandling alternativ for kreft. Det er imidlertid betydelige begrensninger på utbredt bruk i behandling av kreft. Disse begrensninger inkludere utviklingen av enestående toksisitet som cytokin løslate Syndrome (CRS) og nevrotoksisitet (NT) og begrenset ekspansjon, effektor funksjonene, og anti-svulst aktivitet inne robust svulst. En strategi for å forbedre CAR-T effekt og/eller kontroll toksisitet av CAR-T-celler er å redigere Genova av CAR-T cellene selv under CAR-T celle produksjon. Her beskriver vi bruken av CRISPR/Cas9 genredigering i CAR-T-celler via Transduction med en lentiviral konstruksjon som inneholder en guide RNA for å granulocytt macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og Cas9. Som et eksempel, beskriver vi CRISPR/Cas9 mediert knockout av GM-CSF. Vi har vist at disse GM-CSFk/o Car-T-celler effektivt produsere mindre GM-CSF samtidig opprettholde kritisk T celle funksjon og resultere i forbedret anti-tumor aktivitet in vivo i forhold til vill type Car-t-celler.

Figur 1 viser reduksjon av GM-CSF i GM-CSFk/o CART19 celler. For å kontrollere at Genova av T-cellene ble endret til knockout GM-CSF, ble TIDEVANNS sekvensering brukt i GM-CSFk/o CART19 celler (figur 1a). CAR-T celleoverflaten farging bekrefter at T cellene vellykket uttrykke bilen overflaten reseptor in vitro av gating på Live CD3 + celler (figur 1B). Intracellulære farging ...

Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Her presenterer vi en protokoll til genetisk redigere CAR-T-celler via en CRISPR/Cas9 system.

Bruke CRISPR/Cas9 å Knock Out GM-CSF i CAR-T celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Vår protokoll beskriver den genetiske modifikasjonen av CAR-T-cellen under produksjonen via CRISPR-teknologien for å generere mer effektivt og mindre giftig produkt. En fordel med denne teknikken er at CAR-T celleproduksjon og genetisk manipulasjon kan både forekomme i en celle med god effektivitet. Å demonstrere prosedyren vil være Rosalie Sterner, en md ph.d.-student, Michelle Cox, en teknolog og en utdannet student, og Reona Sakemura, en postdoktor, fra laboratoriet mitt.Etter å ha isolert T-celler fra høstede perifere blod mononukleære celler, begynne å kultivere dem ved først å forberede T-celle medium og deretter sterilisere den ved å filtrere den gjennom en 0,45 mikrometer sterilt vakuum filter og deretter med en 0,22 mikrometer sterilt vakuum filter. På dagen for T-cellestimulering eller dag null, før stimulering, vask CD3/ CD28 perler ved å plassere det nødvendige volumet av perler i et sterilt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og resuspending i en milliliter TCM. Plasser røret i kontakt med en magnet i ett minutt.Deretter aspirerer TCM og resuspend i en milliliter frisk TCM for å vaske perlene igjen og gjenta for totalt tre vasker. Og til slutt, resuspend perlene i en milliliter TCM. Etter å ha talt T-cellene, overfør perlene til T-cellene i forholdet mellom tre og en perler til celler.Deretter fortynne cellene til en endelig konsentrasjon av en million celler per milliliter og inkubere ved 37 grader Celsius, 5% CO2 i 24 timer. Etter å ha kjøpt en CART19-konstruksjon i en lentiviral vektor, utfør lentiviralproduksjon ved første inkubering av lentiviral plasmid, emballasjevektor, konvoluttvektor, prekomplementerende reagens, transfeksjonsreagens og transfeksjonsmedium ved romtemperatur i 30 minutter. Utfør lentiviral arbeid ved hjelp av BSL2 + forholdsregler, inkludert cellekultur hetter, personlig verneutstyr, og desinfeksjon av brukte materialer med blekemiddel før avhending.Etter inkubasjon, legg til disse transfection reagensene til de 293 T-cellene som har nådd 70 til 90% samløpet og kultur de trans infiserte cellene ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Ved 24 og 48 timer etter transfection, høst, sentrifuge, filter og konsentrat virusholdige supernatant ved ultracentrifugation og fryse på minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk. På dag én, forsiktig resuspend T-celler som har blitt stimulert på en million celler per milliliter på dag null for å bryte opp rosetter av celler.Under passende BSL2 + forholdsregler, tilsett fersk eller frossen høstet virus til simulerte T-celler ved et mangfold av infeksjon på 3.0. Fortsett å inkubere de transduserte T-cellene ved 37 grader Celsius, 5%CO2. På dag tre og fem teller du CAR-T-celler og legger til fersk forhåndsoppvarmet TCM til kulturen for å opprettholde en CAR-T-cellekonsentrasjon på en million celler per milliliter.Seks dager etter simulering, fjern perler fra de transduserte T-cellene ved først høsting og gjenbruk av cellene. Overfør cellene i 50 milliliter koniske rør og legg rørene i en magnet i ett minutt. Etter å ha samlet CAR-T-cellen som inneholder supernatant og kastet perlene, legg cellene tilbake i kultur i en konsentrasjon på en million celler per milliliter i en kulturkolbe.Bruk et utvalg av celler for flytcytometri til å vurdere overflateuttrykk av cars. Inkuber resten for å gjenoppta ekspansjonen og deretter høste og kryo-bevare cellene på dag åtte som beskrevet i manuskriptet. For å forstyrre granulocytt makrofag koloni stimulerende faktor, bruke en guide RNA som beskrevet i manuskriptet.Inkuber transfeksjonsreagenser ved romtemperatur i 30 minutter. Etter inkubasjon, legg dem til de 293 T-cellene som har nådd 70 til 90% samløpet og kultur de trans infiserte cellene ved 37 grader Celsius, 5% CO2 for å produsere et lentivirus. Ved 24 og 48 timer høster og konsentrerer du virusholdige supernatant ved ultracentrifugation i 50 milliliter ultracentrifuge rør og fryse ved minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk.Så på dag én, forsiktig resuspend T-cellene for å bryte opp rosetter. I et BSL2+godkjent laboratorium, for å generere CAR-T-celler, legg til CAR19 lentivirus og GMCSF-målretting CRISPR lentivirus til de simulerte T-cellene. På dag tre og dag fem for vellykket transdusert lentiCRISPR-redigerte T-celler som bærer renomycinresistens, behandle celler med puromycin dihydroklorid i en konsentrasjon av ett mikrogram puromycin per milliliter.Tidevann sekvensering ble brukt til å bekrefte en GM-CSF reduksjon i GM-CSF knockout CART19 celler med en forstyrrelse effektivitet på ca 71% Flow tomter av CAR-T celle overflate farging inngjerdet på live CD3-positive celler viser at både vill-type CART19 og GM-CSF knockout CART19 vellykket og på en lignende måte uttrykke CAR overflate reseptor in vitro. På den annen side viser intracellulær farging av GM-CSF ved flytcytometri også inngjerdet på live CD3-positive celler redusert uttrykk for GM-CSF i knockout-cellene sammenlignet med wild-type CART19-celler som bekrefter funksjonell suksess for knockout. Spesiell forsiktighet bør tas under transduksjon trinnene i denne prosedyren som de er mest kritiske til utviklingen av genmodifiserte CAR-T celler.Metodikken som beskrives, kan potensielt brukes på en rekke gener for å modifisere CAR-T-celler via CRISPR/CAS9 for å bidra til å generere et mindre giftig og mer effektivt produkt. CRISPR/CAS9-teknologi gir strategiene for direkte å målrette genomet til CAR-T-celler for å konstruere løsninger på nåværende kliniske mangler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

En Syngeneic mus B-celle lymfom modell for pre-klinisk evaluering av CD19 bil T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Undersøkelse av genetisk avhengigheter ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kvantifisering av replikasjonsstress i eggstokkreftceller ved bruk av enkeltstrenget DNA-immunfluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Intrakranial kanyleimplantasjon for serielle lokoregionale kimære antigenreseptor (CAR) T-celleinfusjoner hos mus

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...