Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана за счет грантов от K12CA090628 (SSK), Национальной комплексной онкологической сети (SSK), Клиника Майо Центр индивидуальной медицины (SSK), Фонд Предолин (SSK), клиника Майо Бюро перевода на практике (SSK), и Клиника Майо Медицинская Программа обучения ученых Роберт Л. Хауэлл Врач-ученый стипендий (RMS).

Этот протокол следует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо (IRB) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC).
1. производство клеток CART19
<ol><li>Изоляция Т-клеток, стимуляция и культура бывших виво<ol>
<li>Выполняйте всю работу клеточ?...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

В этом отчете мы описываем методологию использования технологии CRISPR/Cas9 для индуцирования вторичных изменений в клетках CAR-T. В частности, это продемонстрировано с помощью лентивирусной трансдукции с вирусным вектором, который содержит gRNA ориентации гена интереса и Cas9 для создания ГМ-CSF...

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия демонстрирует большие перспективы в лечении рака. 1 , 2 Две CAR-T клеточной терапии ориентации CD19 (CART19) были недавно утверждены в Соединенных Заявленные и в Европе для использования в злокачественных новообразованиях клеток B после демонстрации поразительных результатов в многоцентровых клинических испытаний. 3 , 4 , 5 Барьерами для более широкого использования CAR-T-клеток являются ограниченная активность в твердых опухолях и связанных с ними токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT). 3 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9 Для повышения терапевтического индекса клеточной терапии CAR-T, инженерные инструменты генома, такие как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR используются для дальнейшего изменения car-T-клеток в попытке создать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T. 10 Лет , 11 Год
В этой статье мы описываем метод создания CRISPR/Cas9, отредактированных CAR-T-ячеек. Конкретная цель этого метода заключается в том, чтобы генетически модифицировать CAR-T-клетки во время производства клеток CAR-T через CRISPR/Cas9 для создания менее токсичных или более эффективных клеток CAR-T. Обоснование для разработки этой методологии основывается на уроках, извлеченных из клинического опыта клеточной терапии CAR-T, что указывает на настоятельную необходимость новых стратегий для увеличения терапевтического окна клеточной терапии CAR-T и расширения применения в других опухолей и поддерживается последние достижения в синтетической биологии позволяет несколько модификаций CAR-T клеток, которые начали поступать в клинику. В то время как несколько инженерных инструментов генома разрабатываются и применяются в различных условиях, таких как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR, наша методология описывает модификацию CRISPR/Cas9 клеток CAR-T. 10 Лет , 11 CRISPR/Cas9 является РНК-механизм защиты от бактерий, который предназначен для устранения чужеродных ДНК. CRISPR полагается на эндонуклеазы, чтобы расщеплять целевую последовательность, идентифицированную через направляющий РНК (gRNA). CRISPR редактирования CAR-T клеток предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами инженерного генома. К ним относятся точность последовательности gRNA, простота для разработки gRNA ориентации гена интереса, высокая эффективность редактирования генов, и способность целевых нескольких генов, поскольку несколько гРНК могут быть использованы в то же время.
В частности, в методах, описанных здесь, мы использовали лентивирус, кодируя CRISPR руководство РНК и Cas9 нарушить ген во время трансдукции Т-клеток CAR. При выборе подходящей техники для редактирования CAR-T-клеток, мы предлагаем метод, описанный здесь является эффективным механизмом для создания исследований класса CAR-T клеток, а потому, что долгосрочный эффект постоянной интеграции Cas9 в геном неизвестен, мы предложить эту методологию для разработки доказательства концепции исследования класса CAR-T клеток, но не для производства хорошей производственной практике класса CAR-T клеток.
В частности, здесь мы описываем генерацию гранулоцитов макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) нокаутОМ CAR-T клеток ориентации человека CD19. Эти клетки CAR-T были созданы путем трансдукции с лентивирными частицами, кодируя направляющую РНК, специфичную для GM-CSF (генное название CSF2) и Cas9. Ранее мы обнаружили, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижая производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности CAR-T и выживания в vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. 12 Таким образом, здесь мы предоставляем методологию для создания CRISPR/Cas9 отредактированные клетки CAR-T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия является передний край и потенциально революционный новый вариант лечения рака. Тем не менее, существуют значительные ограничения на его широкое применение в лечении рака. Эти ограничения включают в себя развитие уникальных токсичностей, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT) и ограниченное расширение, функции эффектора и противоопухолевую активность в твердых опухолях. Одной из стратегий повышения эффективности CAR-T и/или контроля токсичности клеток CAR-T является редактирование генома самих клеток CAR-T во время производства клеток CAR-T. Здесь мы описываем использование редактирования генов CRISPR/Cas9 в клетках CAR-T с помощью трансдукции с лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к гранулоцитной колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) и Cas9. В качестве примера мы описываем CRISPR/Cas9 при посредничестве GM-CSF. Мы показали, что эти ГМ-CSFк / о CAR-T клетки эффективно производят меньше ГМ-CSF при сохранении критической функции Т-клеток и привести к повышению противоопухолевой активности in vivo по сравнению с дикими клетками типа CAR-T.

На рисунке 1 показано сокращение ГМ-CSF в клетках GM-CSFk/o CART19. Чтобы убедиться, что геном Т-клеток был изменен на нокаут ГМ-CSF, tide секвенирования был использован в GM-CSFк / о CART19 клеток (Рисунок 1A). CAR-T клеточной поверхности окрашивани?...

Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Здесь мы представляем протокол для генетического отсвагивая клетки CAR-T через систему CRISPR/Cas9.

Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Наш протокол описывает генетическую модификацию клеток CAR-T во время их производства с помощью технологии CRISPR для создания более эффективного и менее токсичного продукта. Преимуществом этого метода является то, что производство клеток CAR-T и генетические манипуляции могут происходить в одной клетке с хорошей эффективностью. Демонстрация процедуры будет Розали Стернер, доктор философии студент, Мишель Кокс, технолог и аспирант, и Реона Sakemura, аспирант, из моей лаборатории.Изолировав Т-клетки от собранных периферических моноядерных клеток крови, начните их культивирование, сначала подготовив Т-клеточную среду, а затем стерилизовав ее, фильтруя ее через 0,45-микрометровый стерильный вакуумный фильтр, а затем с помощью стерильного вакуумного фильтра 0,22 микрометра. В день стимуляции Т-клеток или нулевой день, до стимуляции, мыть CD3/CD28 бусы, поместив необходимый объем бисера в стерильной 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и повторно в один миллилитр ТКМ. Поместите трубку в контакт с магнитом в течение одной минуты.Затем аспирировать ТКМ и повторно в один миллилитр свежего ТКМ мыть бисер снова и повторить в общей сложности три моет. И, наконец, повторно помыть бисер в один миллилитр ТКМ. После подсчета Т-клеток, передать бисер т-клеток в соотношении трех к одному бисера к клеткам.Затем разбавить клетки до конечной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 в течение 24 часов. После приобретения конструкции CART19 в лентивирусном векторе, выполните лентивирусное производство с помощью первой инкубационные лентивирусные плазмиды, вектор упаковки, вектор конверта, прекомплексирующий реагент, трансфектонный реагент и трансфектную среду при комнатной температуре в течение 30 минут. Проведение лентивирусной работы с использованием BSL2'precautions, включая капюшоны клеточной культуры, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию использованных материалов отбеливателем перед утилизацией.После инкубации добавьте эти трансфектные реагенты в 293 Т-клетки, которые достигли 70-90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. В течение 24 и 48 часов после трансфекции, урожай, центрифуга, фильтр и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем. В первый день, мягко повторного T-клеток, которые были стимулированы на один миллион клеток на миллилитр в день нуля, с тем чтобы разбить розетки клеток.В соответствии с соответствующими мерами предосторожности BSL2, добавьте свежий или замороженный собранный вирус в смоделированные Т-клетки при множественности инфекции 3.0. Продолжайте инкубировать трансдуцированные Т-клетки при 37 градусах Цельсия, 5%CO2. В дни три и пять, рассчитывать CAR-T клеток и добавить свежие предварительно разогретых TCM в культуру для поддержания концентрации CAR-T клеток одного миллиона клеток на миллилитр.Через шесть дней после моделирования, удалить бисер из транс индуцированных Т-клеток путем первого сбора урожая и повторного перерасхода клеток. Перенесите клетки в 50 миллилитровых конических трубок и поместите трубки в магнит на одну минуту. После сбора CAR-T-клеток, содержащих супернатант и отбрасывая бисер, место клетки обратно в культуре в концентрации одного миллиона клеток на миллилитр в культуре колбу.Используйте образец клеток для цитометрии потока для оценки поверхностного экспрессии CARs. Инкубировать остальные, чтобы возобновить расширение, а затем урожай и крио-сохранить клетки на восьмой день, как описано в рукописи. Чтобы нарушить гранулоцитов макрофаг колонии стимулирующий фактор, используйте руководство РНК, как описано в рукописи.Инкубация трансфектных реагентов при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации, добавить их к 293 Т-клеток, которые достигли 70 до 90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусов по Цельсию, 5%CO2 для производства лентивируса. В 24 и 48 часов, урожай и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации в 50 миллилитров ультрацентрифуг трубки и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем.Затем в первый день, осторожно повторно Т-клеток, чтобы разбить розетки. В лаборатории, одобренной BSL2, для генерации клеток CAR-T, добавьте lentivirus CAR19 и GMCSF-таргетинга CRISPR лентивируса для моделируемых Т-клеток. На третий день и пятый день для успешно трансдуцированных lentiCRISPR-редактируемых Т-клеток, несущих устойчивость пуромицина, лечить клетки с пуромицин дигидрохлоридом при концентрации одного микрограмма пуромицина на миллилитр.Приливное секвенирование было использовано для подтверждения сокращения GM-CSF в GM-CSF нокаутом CART19 клеток с эффективностью нарушения примерно 71%Flow участков CAR-T поверхности поверхности окрашивания закрыты на живых CD3-положительных клеток показывают, что как дикий тип CART19 и GM-CSF нокаутОМ CART19 успешно и аналогичным образом выразить рецептор поверхности ЦАР в пробирке. С другой стороны, внутриклеточное окрашивание ГМ-CSF по цитометрии потока также закрыто на живых CD3-положительных клетках демонстрирует снижение экспрессии ГМ-CSF в нокаут-клетках по сравнению с клетками дикого типа CART19, подтверждающими функциональный успех нокаута. Особое внимание следует принимать во время трансдукционных этапов этой процедуры, поскольку они являются наиболее важными для развития генетически модифицированных клеток CAR-T.Описанная методология потенциально может быть применена к различным генам для модификации клеток CAR-T с помощью CRISPR/CAS9, чтобы помочь создать менее токсичный и более эффективный продукт. Технология CRISPR/CAS9 предоставляет стратегии непосредственной таргетинга генома клеток CAR-T на разработку решений текущих клинических недостатков.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Ищет пути водитель приобрела устойчивость к таргетной терапии: лекарственно Subclone поколения и чувствительность, восстановление генов нокдаун

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Мышь сингенных B-клеточной лимфомы модель для предварительно клинической оценки CD19 автомобилей Т-клеток

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Количественная оценка репликационного стресса в клетках рака яичников с использованием одноцепочечной иммунофлуоресценции ДНК

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Имплантация внутричерепных канюль для серийных локорегионарных инфузий Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) у мышей

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...