Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes genom bidrag från K12CA090628 (SSK), National omfattande cancer Network (SSK), Mayo Clinic Center för individualiserad medicin (SSK), den Predolin Foundation (SSK), Mayo Clinic Office of Translation till Practice (SSK), och den Mayo Clinic medicinsk vetenskapsman utbildningsprogram Robert L. Howell läkare-forskare stipendium (RMS).

Detta protokoll följer riktlinjerna från Mayo Clinic ' s institutionella Review Board (IRB) och institutionella Biosäkerhetskommittén (IBC).
1. CART19 cell produktion
<ol><li>T cell isolering, stimulering och ex-vivo-kultur<ol>
<li>Utföra alla cellkultur arbete i en cellkultur huva utnyttja lämplig personlig skyddsutrustning. Skörda perifera mononukleära blodceller (PBMCs) från avidentifierade normala blod kottar som samlats in under aferes eftersom dessa är kända för att vara en...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

I denna rapport beskriver vi en metodik för att använda CRISPR/Cas9 teknik för att inducera sekundära modifieringar i CAR-T-celler. Specifikt, detta demonstreras med hjälp av lentiviral transduktion med en viral vektor som innehåller gRNA inriktning genen av intresse och Cas9 att generera GM-CSFk/o CART19 celler. Vi hade tidigare visat att GM-CSF neutralisering Ameliorates CRS och NT i en xenograft modell. 12 som tidigare beskrivits medger GM-CSFk/o Car-T-celler HÄMNIN...

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cellterapi uppvisar stora löfte vid behandling av cancer. 1 , 2 två bil-T cellterapier inriktning CD19 (CART19) godkändes nyligen i Förenade anges och i Europa för användning i B-cellmaligniteter efter att ha visat slående resultat i multicenter kliniska prövningar. 3 , 4 , 5 hinder för en mer utbredd användning av bil-T-celler är begränsad aktivitet i solida tumörer och tillhörande toxicitet inklusive cytokinfrigörarsyndrom (CRS) och neurotoxicitet (NT). 3 , ,5 , 6 , 7 , 8 , 9 för att förbättra det terapeutiska indexet för bil-t cellterapi, genom tekniska verktyg såsom zink finger nukleaser, talens, och CRISPR används för att ytterligare modifiera Car-t-celler i ett försök att generera mindre giftiga eller effektivare bil-t-celler. 10 , elva
I den här artikeln beskriver vi en metod för att generera CRISPR/Cas9 redigerade CAR-T-celler. Det specifika målet med denna metod är att genetiskt modifiera CAR-T-celler under bil-T cell tillverkning via CRISPR/Cas9 för att generera mindre giftiga eller effektivare bil-T-celler. Den logiska grunden för att utveckla denna metod bygger på lärdomar från klinisk erfarenhet av bil-T cellterapi, vilket tyder på ett brådskande behov av nya strategier för att öka det terapeutiska fönstret av bil-T cellterapi och att utvidga tillämpningen till andra tumörer och stöds av de senaste framstegen inom syntetisk biologi tillåter flera modifieringar av bil-T-celler som har börjat komma in i kliniken. Medan flera arvs tekniska verktyg utvecklas och appliceras i olika miljöer, såsom zinkfingernukleaser, TALENs och CRISPR, beskriver vår metodik CRISPR/Cas9 modifiering av CAR-T-celler. 10 , 11 CRISPR/Cas9 är en RNA-baserad bakteriell försvarsmekanism som är utformad för att eliminera främmande DNA. CRISPR förlitar sig på endonukleaser för att klyva en målsekvens som identifierats genom en guide RNA (gRNA). CRISPR-redigering av CAR-T-celler ger flera fördelar jämfört med andra genomtekniska verktyg. Dessa inkluderar precision i gRNA sekvens, enkelhet att utforma en gRNA inriktning genen av intresse, hög genredigering effektivitet, och förmågan att rikta flera gener eftersom flera gRNAs kan användas på samma gång.
Specifikt i de metoder som beskrivs här, vi använde en lentivirus kodning CRISPR guide RNA och Cas9 att störa en gen under bil transduktion av T-celler. Vid val av en lämplig teknik för att redigera bil-T-celler, föreslår vi den teknik som beskrivs här är en effektiv mekanism för att generera forskning grade CAR-T-celler, men eftersom den långsiktiga effekten av permanent integration av Cas9 i arvsmassan är okänd, vi föreslå denna metod för att utveckla bevis på begreppet forskning klass bil-T-celler men inte för att producera god tillverkningssed grade CAR-T-celler.
I synnerhet, här beskriver vi generering av granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) knockout CAR-T-celler riktade mot Human CD19. Dessa CAR-T-celler genererades genom transduktion med lentivirala partiklar som kodar en guide RNA som är specifik för GM-CSF (gen namn CSF2) och Cas9. Vi fann tidigare att GM-CSF neutralisering Ameliorates CRS och NT i en xenograft modell. 12 GM-CSFk/o Car-t-celler möjliggör hämning av GM-CSF under tillverkningsprocessen, effektivt minska produktionen av GM-CSF samtidigt förbättra Car-t cell anti-tumör aktivitet och överlevnad in vivo jämfört med vildtyp bil-t celler. 12 således, här ger vi en metod för att generera CRISPR/CAS9 redigerade Car-T-celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cellterapi är en skäregg och potentiellt revolutionerande nya behandlingsalternativ för cancer. Det finns dock betydande begränsningar för dess utbredda användning vid behandling av cancer. Dessa begränsningar inkluderar utveckling av unika toxiciteter såsom cytokin release syndrome (CRS) och neurotoxicitet (NT) och begränsad expansion, effektor funktioner, och anti-tumör aktivitet i solida tumörer. En strategi för att förbättra bil-T effekt och/eller kontroll toxiciteter av bil-T-celler är att redigera genomet av bil-T-celler själva under bil-T cell tillverkning. Här beskriver vi användningen av CRISPR/Cas9 genredigering i CAR-T-celler via transduktion med en lentiviral konstruktion som innehåller en guide RNA till granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) och Cas9. Som ett exempel beskriver vi CRISPR/Cas9 medierad knockout av GM-CSF. Vi har visat att dessa GM-CSFk/o Car-T-celler effektivt producera mindre GM-CSF samtidigt bibehålla kritisk T-cells funktion och resultera i förbättrad anti-tumöraktivitet in vivo jämfört med vilda typ bil-t-celler.

Figur 1 visar REDUKTION av GM-CSF ik/o CART19-celler i GM-CSF. För att kontrollera att genomet av T-cellerna ändrades till att blockera GM-CSF användes tidvatten sekvensering ik/o CART19-cellerna (figur 1a) i GM-CSF. BIL-T cellytan färgning kontrollerar att T-celler framgångsrikt uttrycka bilen ytan receptorn in vitro genom gating på levande CD3 + celler (figur 1b). Intrac...

Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt redigera CAR-T-celler via ett CRISPR/Cas9-system.

Använda CRISPR/Cas9 för att slå ut GM-CSF i CAR-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Vårt protokoll beskriver den genetiska modifieringen av CAR-T-cell under tillverkningen via CRISPR-tekniken för att generera effektivare och mindre giftig produkt. En fördel med denna teknik är att CAR-T-cellproduktion och genetisk manipulation båda kan förekomma i en cell med god effektivitet. Visar förfarandet kommer att Rosalie Sterner, en MD doktorand, Michelle Cox, en teknolog och en doktorand, och Reona Sakemura, en postdoktor, från mitt laboratorium.Efter att ha isolerat T-celler från skördade mononukleära celler i perifert blod, starta culturing dem genom att först förbereda T-cell medium och sedan sterilisera den genom att filtrera den genom en 0,45 mikrometer sterila vakuumfilter och sedan med en 0,22 mikrometer sterila vakuumfilter. På dagen för T-cellstimulering eller dag noll, före stimulering, tvätta CD3/CD28 pärlor genom att placera den erforderliga volymen av pärlor i en steril 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och resuspending i en milliliter av TCM. Placera röret i kontakt med en magnet i en minut.Därefter aspirera TCM och resuspend i en milliliter av färsk TCM att tvätta pärlorna igen och upprepa för totalt tre tvättar. Och slutligen, resuspend pärlorna i en milliliter av TCM. Efter att ha räknat T-cellerna, överför pärlorna till T-cellerna vid ett förhållande av tre till en pärlor till celler.Späd sedan cellerna till en slutlig koncentration av en miljon celler per milliliter och inkubera vid 37 grader Celsius, 5%CO2 i 24 timmar. Efter att ha förvärvat en CART19 konstruera i en lentiviral vektor, utföra lentiviral produktion genom att först inkubera lentiviral plasmid, förpackning vektor, kuvert vektor, precomplexing reagens, transfection reagens och transfektion medium vid rumstemperatur i 30 minuter. Utför lentiviralt arbete med hjälp av BSL2+försiktighetsåtgärder inklusive cellodlingshuvar, personlig skyddsutrustning, och desinfektion av använda material med blekmedel före bortskaffande.Efter inkubation, tillsätt dessa transfektionsreagenser till de 293 T-celler som har nått 70 till 90%konfluency och odla de transdrekterade cellerna vid 37 grader Celsius och 5%CO2. Vid 24 och 48 timmar efter transfection, skörd, centrifug, filter och koncentrat virusinnehållande supernatant genom ultracentrifugation och frysa vid minus 80 grader Celsius för framtida bruk. Dag ett, försiktigt återanvända T-celler som har stimulerats till en miljon celler per milliliter på dag noll för att bryta upp rosetter av celler.Under lämpliga BSL2+försiktighetsåtgärder, tillsätt färskt eller fryst skördat virus till de simulerade T-cellerna vid en infektionsmultnag på 3,0. Fortsätt att inkubera de transduced T-cellerna vid 37 grader Celsius, 5%CO2. På dag tre och fem, räkna CAR-T-celler och tillsätt färska förvörd TCM till kulturen för att upprätthålla en CAR-T cell koncentration av en miljon celler per milliliter.Sex dagar efter simulering, ta bort pärlor från transduced T-celler genom att först skörda och resuspending cellerna. Överför cellerna i 50 milliliter koniska rör och placera rören i en magnet i en minut. Efter att ha samlat in CELL-T-cellen som innehåller supernatant och kastat pärlorna, placera cellerna tillbaka i kulturen vid en koncentration av en miljon celler per milliliter i en odlingskolv.Använd ett prov av celler för flödescytometri för att bedöma ytuttryck av CARs. Inkubera resten för att återuppta expansionen och sedan skörda och kryo-bevara cellerna vid dag åtta som beskrivs i manuskriptet. För att störa granulocyt makrofagkoloni stimulerande faktor, utnyttja en guide RNA som beskrivs i manuskriptet.Inkubera transfektionsreagenser i rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubation, lägg till dem till 293 T-celler som har nått 70 till 90%confluency och kultur de transfekterade cellerna vid 37 grader Celsius, 5%CO2 för att producera ett lentivirus. Vid 24 och 48 timmar, skörd och koncentrera virus-innehållande supernatant genom ultracentrifugeringen i 50 milliliter ultracentrifugrör och frysa på minus 80 grader Celsius för framtida bruk.Sedan på dag ett, försiktigt återanvända T-celler för att bryta upp rosetter. I ett BSL2+-godkänt laboratorium, för att generera CAR-T-celler, lägger DU TILL CAR19 lentivirus och GMCSF-inriktning PÅ CRISPR lentivirus till de simulerade T-cellerna. På dag tre och dag fem för framgångsrikt transduced lentiCRISPR-redigerade T-celler som transporterar puromycin resistens, behandla celler med puromycin dihydroklorid vid en koncentration av ett mikrogram puromycin per milliliter.Tidvatten sekvensering användes för att bekräfta en GM-CSF minskning av GM-CSF knockout CART19 celler med en störning effektivitet på cirka 71%Flow tomter av CAR-T-cell yta färgning gated på levande CD3-positiva celler visar att både vild-typ CART19 och GM-CSF knockout CART19 framgångsrikt och på ett liknande sätt uttrycka CAR yta receptorn in vitro. Å andra sidan, intracellulära färgning av GM-CSF genom flöde cytometri också gated på levande CD3-positiva celler visar minskat uttryck för GM-CSF i knockout cellerna jämfört med vilda-typ CART19 celler bekräftar funktionella framgång knockout. Särskild försiktighet bör vidtas under transduktionsstegen i detta förfarande eftersom de är de mest kritiska för utvecklingen av genetiskt modifierade CAR-T-celler.Den metod som beskrivs kan potentiellt tillämpas på en mängd olika gener för att modifiera CAR-T-celler via CRISPR/CAS9 för att hjälpa till att generera en mindre giftig och effektivare produkt. CRISPR/CAS9-tekniken ger strategier för att direkt rikta in sig på GENOMET AV CAR-T-celler för att konstruera lösningar på aktuella kliniska brister.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Söker förare vägar av förvärvad resistens till riktad terapi: resistenta Subclone Generation och känslighet återställa av genen Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering för att undersöka onkogena aktiviteten av muterade Calreticulin i cytokin beroende av hematopoetiska celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Utredning av genetiska beroenden med CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller hos möss rekapitulerar avancerad kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kvantifiering av replikationsstress i äggstockscancerceller med hjälp av enkelsträngad DNA-immunofluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Intrakraniell kanylimplantation för seriella lokoregionala chimära antigenreceptor (CAR) T-cellinfusioner hos möss

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...