Name: digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי קרן הפקולטה למשפטים של הנשיא ג'ורג ' האדדיקס והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרסים GM103427. התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

1. לשלב ברקודים DNA ייחודי על פלאמיד המכיל את הרכיבים הנחוצים עבור Allelic Exchange
הערה: חדש פלמיד, בשם pSKAP, עם מספר עותק גבוה ויעילות שינוי מוגבר לעומת הקיים pKD13 allelic exchange באמצע נוצר. הדבר מתואר בשלבים 1.1-1.12 (איור 1). הפלמידים הסופיים המכילים ברקודים ורכיבי DNA ייח...

<ol>
	<li>Beuz&#243;n, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo.">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li><li>B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid.">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li><li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations.">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li><li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+(LAB)+and+methicillin-resistant+S.+aureus+(MRSA)+in+mixed+culture.">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li><li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials.">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303 (2006).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).</li><li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota.">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).</li><li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq.">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li><li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome&#8208;wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn&#8208;seq,+a+high&#8208;throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms.">Genome&#8208;wide fitness and genetic interactions determined by Tn&#8208;seq, a high&#8208;throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li><li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria.">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).</li><li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors.">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella.">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#955;+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22.">&#955; red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li><li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing,+IFN&#947;-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes.">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFN&#947;-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li><li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway.">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li><li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa:+in+vivo+studies.">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li><li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin.">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li><li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5'-nuclease+PCR.">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li><li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques.">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology.">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li><li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR.">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li><li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1,+2-Propanediol.">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li><li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing.">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li></ol>

היכולת לכמת מיקרואורגניזמים במדויק היא בעלת חשיבות עליונה למחקר מיקרוביולוגיה, והיכולת לספור זנים ייחודיים מאוכלוסיה מעורבת ראשונית הוכיחה להיות כלי רב-ערך להערכת תכונות כושר והתקפה אלימה ב חיידקים. עם זאת, הטכניקות לביצוע זה לא התקדמו בקצב עם פיתוחים מודרניים בביולוגיה מולקולרית. הטכנ...

הערכת כושר והתקפה של אורגניזמים פתוגניים הוא היבט בסיסי של מחקר המיקרוביולוגיה. היא מאפשרת השוואות להתבצע בין זנים או בין אורגניזמים מוטציה, אשר מאפשר לחוקרים לקבוע את החשיבות של גנים מסוימים בתנאים ספציפיים. באופן מסורתי, הערכה אלימה משתמשת במודל החי של זיהום באמצעות זנים חיידקיים שונים והתבוננות בתוצאה של החיה הנגועה (למשל מינון זיהומיות50, מינון קטלני50, זמן למוות, חומרת הסימפטום, חוסר סימפטומים וכו '). הליך זה מספק תיאורים יקרי ערך של התקפה אלימה, אבל זה דורש זנים כדי לגרום הבדלים ניכרים בתוצאות כדי לזהות וריאציות מסוג פראי. יתר על כן, התוצאות הן חצי כמותית, כי בעוד התקדמות המחלה ואת חומרת הסימפטום יכול להיות סובייקטיבי לאורך זמן, פרשנות של התקפה אלימה בהשוואה לסוג פראי הוא האיכותי יותר (כלומר, יותר, פחות, או המוני באותה מידה). חלופה מקובלת לביצוע בעלי חיים הנגועים הוא ליצור מדדים תחרותיים (CIs), ערכים השווים ישירות כושר או התקפה אלימה של זן לעמיתו מסוג פראי בזיהום מעורב1. לטכניקה זו יש יתרונות רבים לעומת מודל בעלי חיים מסורתי של זיהום באמצעות סטנדרטיזציה של התקפה אלימה למתח מסוג פראי וקביעת ערך כולל כדי לשקף את מידת ההנחתה. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאמת לניתוח אינטראקציות גנים בחיידקים על ידי קביעת אינדקס תחרותי בוטלה (COI)2. חישוב COI עבור קבוצה של אורגניזמים מוטציה מאפשר לחוקרים לקבוע אם שני גנים באופן עצמאי לתרום פתוגנזה או אם הם מעורבים מסלול התקפה אלימה ותלויים זה בזה. בנוסף, חישוב CI דורש ספירה של חיידקים אשר יכולים לספק תובנות יקרות לתוך הפתוגנזה של אורגניזמים. CIs ו COIs גם לאפשר לחוקרים הישבנים avirulent זנים שאינם גורמים למחלות קליניות אבל עדיין יש הבדלים בכושר. טכניקה זו מוגבלת על ידי שימוש של סמנים מסורתיים עמידות לאנטיביוטיקה כדי לזהות זנים, ובכך להגביל את מספר זני קלט רק אחד או שניים בכל פעם. בשל מגבלה זו, נדרשים מספר רב של קבוצות ומשכפל ניסויים, שבנוסף להוספת העבודה ועלויות החומר, מגביר גם הזדמנויות לשונות בתנאים ניסיוניים ותוצאות לא מדויקות. (לסקירה יסודית של היתרונות והיישומים של שימוש בזיהומים מעורבים לחקר התקפה אלימה, כושר ואינטראקציות גנים, ראה C.R. Beuzón ו D.W. הולדן 1)
ניסיונות נעשו כדי להתגבר על מגבלה זו, כגון שימוש בתאים fluorescently המסומנים באופן כימות דרך זרם cy,3,4,5. טכניקה זו מכמת את התאים באחד משני הצדדים המסומנים בנוגדנים לסמנים או 2) המיוצרים באופן שורש חלבונים פלורסצאריים. לשימוש בנוגדנים עם תוויות יש מגבלה של גילוי של 1,000 תאים/mL, ולכן דורש מספר גבוה של תאים כדי לנתח3. תאים המבטאים חלבונים פלורסנט יש פיזיולוגיה שונה והם רגישים לשינויי כושר וכתוצאה מביטוי חלבון גבוה6. שתי השיטות מוגבלות על ידי מספר סמני פלורסנט הנמצא באמצעות הזרימה cy, try. התקדמות בקוונפיקציה מולקולרית הושגה באמצעות פיתוח של טכניקה microarray שזיהה החליש ב 120 זנים מזיהום ראשוני מעורב של מעל 1,000 זנים במודל murine7. טכניקה זו מנוצל ניתוח microarray של RNA מ זנים מוטציה, אשר להוביל לשונות ניכרת בתוצאה.  אף על פי כן, היא הקימה כי בריכות גדולות של זיהומים מעורבים יכול להיות כלי שימושי, כי על ידי ניצול טכניקות זיהוי רגיש, הבדלים התקפה אלימה חיידקים ניתן לזהות. עם פיתוח של רצף הדור הבא, Tn-seq הרחיב את כלי השירות של טרנספסון מוטציות, המאפשר שיטה רבת עוצמה עבור חיידקים שהיו מוטציה באקראי8,9,10, . בסדר, 11 פרוטוקול חלופי פותחה לאחרונה כי מבטלת את הצורך בטרנספסונים ובמקום זאת משתמשת ברקודים DNA כדי לזהות בקלות רבה יותר ולעקוב אחר שינויים גנומית ואת השפעתם על כושר12. טכנולוגיה זו היא התקדמות גדולה, אבל החדרת ברקודים גנומית הוא עדיין תהליך אקראי. כדי להתגבר על אקראיות של ניסויים קודמים, יון ואח ' פיתחה שיטה כדי לחשב את החבר של העמים סלמונלה זנים באמצעות ברקודים DNA ייחודי מוכנס במיקומים מדויקים על הכרומוזומים של חיידקים13. זנים ברקודים ייחודיים זוהו באמצעות שיטה מבוססת qPCR עם SYBR ירוק ומיוחד התחל כל ברקוד ייחודי. הטכניקה הוגבלה על-ידי אילוצים שהוטלו על-ידי qPCR, כולל הבדלים ביעילות תחל ורגישות נמוכה, המעידים על הצורך בקינון-PCR לפני qPCR. אף על פי כן, גישה זו הוכיחה כי שינויים ממוקדות גנומית יכול להיות מנוצלת לאיתור ופוטנציאל לכמת בריכות של זנים חיידקיים מרובים.
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים מתודולוגיה הרומן לבצע ניסויים בתחרות חיידקים עם בריכות גדולות של מעורבות מעורב ואחריו כימות מדויקת באמצעות טכניקה דיגיטלית רגישה מאוד. הפרוטוקול כרוך גנטית-תיוג זנים חיידקיים עם ברקוד DNA ייחודי מוכנס על אזור לא מזיק של הכרומוזום. שינוי זה מאפשר לזנים להיות במהירות ובאופן מדויק בקוונט באמצעות טכנולוגיה מולקולרית מודרנית במקום מדלל סדרתי מסורתי, ציפוי משוכפל, ו ספירה המושבה היוצרים יחידות המסתמכים על סמנים פנוטימית (כלומר עמידות לאנטיביוטיקה ). השינויים מאפשרים הערכה בו של זנים רבים במאגר יחיד, הפחתת באופן משמעותי את האפשרות של השתנות ניסיוני כי כל הזנים חשופים לאותם תנאים בדיוק. יתר על כן, בעוד טכניקה זו פותחה ב סלמונלה enterica Serovmuריום, זה מאוד להתאמה לכל אורגניזם מחושל גנטית כמעט כל עיצוב ניסיוני שבו ספירות חיידקים מדויקים נדרשים, מתן חדש כדי להגדיל את הדיוק והתפוקה במעבדות המיקרוביולוגיה ללא האילוצים המוטלים על-ידי שיטות קודמות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL culture tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>8599</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>30389241</td>
			<td>Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>17013804</td>
			<td>Use alternative multichannel pipettes with caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST Analysis</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td>Procure from any manufacturer or prepare yourself</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation5 Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MF</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCR Script Cam SK+</td>
			<td>Stratagene/Agilent</td>
			<td>211192</td>
			<td>No longer available commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer/Probe Design</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSKAP and pSKAP_Barcodes</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid numbers 122702-122726</td>
			<td>www.addgene.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864002</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. Typhimurium strain ATCC 14028s</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 14028s</td>
			<td>www.atcc.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take3 Micro-Volume Plate</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>TAKE3</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0054</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD1704</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0504</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0832</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0503</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F534L</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FEREL0011</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Visi-Blue Transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>UV95043301</td>
			<td>Or other transiluminator that allows visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP28191</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella

אינדקס תחרותי הוא שיטה נפוצה המשמשת להערכת כושר בקטריאלי ו/או התקפה אלימה. השירות של גישה זו הוא לידי ביטוי בקלות שלה לבצע את יכולתה לתקנן את הכושר של זנים רבים לאורגניזם פראי. הטכניקה מוגבלת, עם זאת, על-ידי סמנים פנוטיפי זמינים ומספר זנים שניתן להעריך בו, יצירת הצורך מספר רב של ניסויים לשכפל. במקביל עם מספר רב של ניסויים, עלויות העבודה והחומר לכימות חיידקים המבוססים על סמנים פנוטימית אינם משמעותיים. כדי להתגבר על היבטים שליליים אלה תוך שמירה על היבטים חיוביים, פיתחנו גישה מולקולרית מבוסס לכמת מיקרואורגניזמים ישירות לאחר סמנים גנטיים הנדסה על כרומוזומים חיידקיים. ייחודי, 25 ברקוד DNA צמד ברקודים נוספו בתוך לוקוס מזיק על כרומוזום של מסוג פראי ומוטציה זנים של סלמונלה. ניסויים בתחרויות חוץ-גופית בוצעו. באמצעות אינוימדוזה המורכבת מזנים במאגר בעקבות התחרות, המספרים המוחלט של כל זן היו מקוונטים באמצעות ה-PCR הדיגיטלי והמדדים התחרותיים לכל זן חושבו מערכים אלה. הנתונים שלנו עולה כי גישה זו לכמת סלמונלה הוא רגיש מאוד, מדויק, ומדויק לגילוי הן בשפע מאוד (כושר גבוה) נדיר (כושר נמוך) מיקרואורגניזמים. בנוסף, טכניקה זו ניתנת להתאמה בקלות כמעט כל אורגניזם עם כרומוזומים מסוגל לשנות, כמו גם עיצובים ניסיוניים שונים הדורשים קוונפיקציה מוחלטת של מיקרואורגניזמים.

השימוש במתודולוגיה זו דורש שתגובות הבקרה המתאימות מבוצעות כדי לאמת את הרגישות והספציפיות של כל בדיקה המשמשת לזיהוי הדנ א של היעד. בניסוי מייצג זה, הצלחנו לוודא שמונה ברקודים ייחודיים DNA עם שמונת הבדיקות המתאימות לזיהוי. כל שמונת הבדיקות היו שיעור נמוך של תוצאות חיוביות ש...

Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

זו גישה מולקולרית מבוסס לקביעת כושר חיידקי מאפשר זיהוי מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים באמצעות ברקודים ייחודי DNA גנומית כי הם כימות דרך ה-PCR הדיגיטלי. הפרוטוקול מתאר חישוב המדד תחרותי עבור זני סלמונלה ; עם זאת, הטכנולוגיה ניתנת להתאמה בקלות לפרוטוקולים הדורשים קוונפיקציה מוחלטת של אורגניזם גנטית מחושל.

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

טכניקה זו מאפשרת כימות מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים מאוכלוסייה מעורבת של זנים דומים מאוד באמצעות טכניקות מהירות וגבוהות המבוססות על תפוקה מולקולרית. בסופו של דבר, המאפשר השוואות של כושר להיעשות בין זנים. היכולת להעריך בו זמנית זנים רבים בבריכה אחת מפחיתה באופן משמעותי את השונות בין אורגניזם לאורגניזם היטב או אורגניזם, מכיוון שכל הזנים נחשפים בדיוק לאותם תנאים.יכולת ההסתגלות של טכניקה זו מאפשרת להשתמש בה כמעט עבור כל אורגניזם גנטי וכמעט כל תכנון ניסיוני הדורש כימות מדויק של מיקרואורגניזמים. התחל הליך זה עם הנדסה של סמנים גנטיים על כרומוזומים חיידקיים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צור מאגר של דנ"א גנומי המכיל כל ברקוד פרט לאחד.השתמש בבריכה זו כדי לבצע סדרת דילול עם DNA גנומי המכיל את הברקוד היחיד שנותר. הכינו את התגובות ל-PCR דיגיטלי בכפילות בהתאם להמלצות היצרן לשימוש ב-PCR דיגיטלי supermix המיועד לכימיה מבוססת בדיקה. השתמש בדנ"א הגנומי המפולג כדנ"א של תבנית.כמו כן, הוסף את 20 X פריימר בדיקה מאסטר לערבב כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן שכפול תגובות בקרה עבור PCR דיגיטלי בהתאם להמלצות היצרן. תגובות בקרה עבור כל תערובת בדיקה חייבות להיות מורכבות מפקדי תבנית, פקדים שליליים ופקדים חיוביים.חזור על שלבים אלה כדי ליצור תגובות PCR דיגיטליות עבור כל דגימת DNA גנומי ברקוד. צור טיפות עבור כל מצב תגובה באמצעות גנרטור טיפה, על פי הוראות היצרן. העבר טיפות שנוצרו לאחרונה לתוך צלחת 96 באר המתאים.השתמש ב-200 טיפים לפיפיות מיקרוליטר על פיפסה מרובת ערוצים של 5 עד 50 מיקרוליטר. לאחר שכל טיפות נוצרו והועברו, לאטום את הצלחת עם איטום צלחת נייר כסף. השתמש ברכיב האופניים התרמי המומלץ על-ידי היצרן כדי לבצע את תנאי הרכיבה.בעת ביצוע התרמוצ'ילי, תכנת את תוכנת ניתוח הנתונים עם מידע הגדרת הלוח, כגון שם לדוגמה, סוג ניסוי ו- Supermix בשימוש. כלול גם שם יעד 1 וסוג יעד 1, כמו גם שם יעד 2 וסוג יעד 2. לאחר השלמת התרמוצ'ילי, העבר את התגובות שהושלמו לקורא טיפות והתחל את תהליך הקריאה, בהתאם להוראות היצרן.לאחר שכל בארות נקראו וההפעלה הושלמה, פתח את קובץ הנתונים של QLP באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. בחר את כל הבארים לנצל את אותו גשוש פריימר Mastermix. בכרטיסיה Droplets, בדוק את מספר טיפות המנותחות בכל באר, כולל טיפות חיוביות ושליליות.אל תכלול בניתוח באר שהיא פחות מ- 10,000 טיפות סה"כ. עבור ללשונית משרעת 1D ולבחון את משרעת של טיפות חיוביות ושליליות. ודא שהם מהווים 2 אוכלוסיות נפרדות.בתוך התוכנה, השתמש בתכונת הסף כדי לבצע ניתוק בין טיפות חיוביות ושליליות עבור כל בדיקה שנוצלה. לאחר החלת הסף המתאים על כל בארות, התוכנה תחשב את מספר עותקי ה- DNA בכל תגובה. יצא נתונים לגיליון אלקטרוני כדי להקל על ניתוח נוסף.באמצעות ערכים אלה, חשב את מספר העותק ההתחלתי של כל ברקוד גנומי ייחודי בדגימה. קבע את שיעור החיובי הכוזב הממוצע מתגובות הבקרה השלילית והחסיר ערך זה מהערכים המתקבלים בתגובות ניסיוניות. הכפל את הערכים לפי הצורך, בהתבסס על הדילולים שבוצעו בעת הגדרת כל ניסוי.עכשיו, לקבוע את הכושר היחסי של אורגניזם על ידי חישוב המדד התחרותי או בוטל מדד תחרותי מתוך כימות מבוסס PCR דיגיטלי של הזן ברקוד. בצע שלב זה עבור כל זן מקודד בכל נקודות הזמן. דנ"א גנומי המכיל את הברקוד של AA היה מדולל ברקע של כל הדנ"א הגנומי הברקודי האחר.ערוץ 1 מייצג את בדיקה FAM עבור ברקוד AA, בעוד ערוץ 2 מייצג את החללית HEX עבור ברקוד AO. התוצאות של כל בדיקה מוצגות הן משרעת פלואורסצנטי טיפה בודדת היסטוגרמה המייצגת את התדירות של עוצמת פלואורסצנטי של כל טיפות בארות שנבחרו. עבור כל תנאי, טיפות חיוביות ושליליות צריכות ליצור 2 אוכלוסיות נפרדות.יש להפריד בין האוכלוסיות באמצעות תכונת הסף כדי להגדיר טיפות חיוביות ושליליות. ערכי הסף ישתנו בהתאם לבדיקות ששימשו, אבל כל בארות לנצל את אותו תערובת בדיקה צריך להיות סף זהה. במקרה של AA כי היה מדולל, ההיסטוגרמה נראה רק לתאר את האוכלוסייה הבודדת כי טיפות חיוביות הם בנחיתות מספרית באופן משמעותי על ידי טיפות שליליות.עם זאת, 2 אוכלוסיות נפרדות עדיין נראות לעין על ידי בחינת משרעת פלואורסצנטי טיפה בלוחות השמאליים. כמו DNA גנומי ברקוד AA היה מדולל, חלה ירידה טיפות חיוביות, בעוד מספר טיפות AO חיובי נשאר קבוע. לאחר החלת סף מתאים על כל בארות התוכנה תחשב את מספר עותקי ה- DNA בכל תגובה.אם אתה מבצע PCR באופן שגרתי כחלק מהמחקר שלך, אתה יכול לבצע טכניקה זו כדי להעריך את הכושר של האורגניזם המודל שלך. הליך זה ישמש בדרך כלל כדי לקבוע את התוצאות הסופיות של ניסויים במעלה הזרם. התועלת האמיתית שלה היא לקדם קלות ורבגוניות עבור כל ניסויים המסתמכים על כימות חיידקים.אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להעריך את כושר סלמונלה במודל מורין של זיהום. בנוסף, טכניקה זו מותאמת לשימוש עם מיקרואורגניזמים פתוגניים אחרים במעבדה שלנו.

Research

JoVE Journal

Genetics

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...