Name: digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

이 간행물에 보고 된 연구는 조지 F. Haddix 대통령의 교수 연구 기금과 국립 보건원의 일반 의학 연구소에 의해 지원 되었다 (NIH) 수상 번호 GM103427. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 고유 DNA 바코드를 플라스미드에 통합하여 전기 교환에 필요한 구성 요소를 포함
참고: 기존 pKD13 알릴릭 교환 플라스미드에 비해 카피 수가 높고 변환 효율이 향상된 pSKAP라는 새로운 플라스미드가 만들어졌습니다. 이는 단계 1.1-1.12(도1)에 기재되어 있다. 독특한 DNA 바코드와 알레르산화 를 위한 성분을 포함하는 최종 화된 플라스미드는 플?...

<ol>
	<li>Beuz&#243;n, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo.">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li><li>B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid.">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li><li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations.">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li><li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+(LAB)+and+methicillin-resistant+S.+aureus+(MRSA)+in+mixed+culture.">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li><li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials.">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303 (2006).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).</li><li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota.">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).</li><li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq.">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li><li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome&#8208;wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn&#8208;seq,+a+high&#8208;throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms.">Genome&#8208;wide fitness and genetic interactions determined by Tn&#8208;seq, a high&#8208;throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li><li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria.">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).</li><li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors.">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella.">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#955;+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22.">&#955; red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li><li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing,+IFN&#947;-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes.">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFN&#947;-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li><li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway.">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li><li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa:+in+vivo+studies.">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li><li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin.">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li><li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5'-nuclease+PCR.">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li><li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques.">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology.">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li><li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR.">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li><li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1,+2-Propanediol.">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li><li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing.">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li></ol>

미생물을 정확하게 정량화하는 능력은 미생물학 연구에 가장 중요하며, 초기 혼합 인구에서 독특한 균주를 열거하는 능력은 적합성 및 독성 특성을 평가하기위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 박테리아. 그러나, 이것을 달성하기 위한 기술은 분자 생물학에 있는 현대 발달과 보조를 맞추지 않았습니다. 이 기술은 S를 포함한 많은 박테리아의 염색체를 용이하게 수정할 수 있다. Typhimuri...

병원성 유기체의 적합성 과 독성을 평가하는 것은 미생물학 연구의 근본적인 양상입니다. 그것은 균주 사이 또는 돌연변이된 유기체 사이 비교를 가능하게 합니다, 이는 연구원이 특정 조건의 밑에 특정 유전자의 중요성을 결정하는 것을 허용합니다. 전통적으로, 독성 평가는 다른 세균성 긴장을 사용하여 감염된 동물의 결과를 관찰하는 감염의 동물 모형을 이용합니다 (예를 들면 감염성 복용량50,치명적인 복용량50,죽음에 시간, 현상 엄격, 부족의 증상 등) 이 절차는 독성에 대한 귀중한 설명을 제공하지만 야생 형의 변화를 감지하기 위해 결과에 상당한 차이를 일으키기 위해 균주가 필요합니다. 더욱이, 결과는 질병 진행및 현상 엄격이 시간이 지남에 따라 주관적으로 정량화될 수 있기 때문에, 야생 형에 비교된 독성의 해석은 더 질적입니다 (즉, 더, 더 적게, 또는 동등하게 악성). 동물 감염 성 검사를 수행하는 일반적인 대안은 경쟁 지수 (CIs)를 생성하는 것입니다, 직접 혼합 감염에서 야생 형 대응에균주의 적합성 또는 독성을 비교값 1. 이 기술은 야생 형 균주에 독성을 표준화하고 감쇠정도를 반영하는 정량적 값을 결정함으로써 감염의 전통적인 동물 모델에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 취소된 경쟁 지수(COI) 2를 결정함으로써 박테리아에서의유전자 상호작용을 분석하기 위해 적응될 수 있다. 돌연변이 된 유기체의 그룹에 대한 COI를 계산하면 연구원은 두 유전자가 독립적으로 발병 기전에 기여하는지 또는 동일한 독성 경로에 관여하고 서로 의존하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 추가적으로, CI를 계산하는 것은 유기체의 병인에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 박테리아의 열거를 요구합니다. C와 COIs는 또한 연구원이 임상 질병을 일으키지 않지만 여전히 체력에 차이가있는 avirulent 균주를 어지러이로 할 수 있습니다. 이 기술은 긴장을 확인하기 위하여 전통적인 항생 저항 마커의 사용에 의해 제한되고, 따라서 입력 긴장의 수를 한 번에 하나 또는 두개로 제한합니다. 이러한 제한으로 인해 많은 수의 실험 그룹과 복제가 필요하며, 이는 인건비와 재료 비용을 추가하는 것 외에도 실험 조건의 가변성과 부정확한 결과의 변동성을 증가시킵니다. (독성, 피트니스 및 유전자 상호 작용을 연구하기 위해 혼합 감염을 사용하는 이점과 응용 프로그램에 대한 철저한 검토는 C.R. Beuzón 및 D.W. Holden 1참조) 
이러한 한계를 극복하기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 형광 표지세포의 사용이 유세포분석3,4,5를통해 정량화되었다. 이 기술은 1) 표지된 항체를 사용하여 세포에 자형표 또는 2) 내인성 형광 단백질을 생성하여 정량화합니다. 표지된 항체의 사용은 1,000 개의 세포 / mL의 검출한계를 가지고 있으며,따라서 3을 분석하기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 형광 성 단백질을 발현하는 세포는 변형된 생리학을 가지며 고단백 발현으로 인한 체력 변화에 취약하다6. 두 방법 모두 유세포측정법을 사용하여 검출가능한 형광 마커의 수에 의해 제한된다. 분자 정량화의 발전은 뮤린 모델7에서1,000 개 이상의 균주의 초기 혼합 감염에서 120 개의 균주에서 감쇠를 감지하는 마이크로 어레이 기술의 개발을 통해 달성되었습니다. 이 기술은 결과에 있는 상당한 가변성으로 이끌어 내는 돌연변이된 긴장에서 RNA의 마이크로어레이 분석을 이용했습니다.  그럼에도 불구하고, 그것은 혼합 된 감염의 큰 풀이 유용한 도구가 될 수 있으며 민감한 검출 기술을 활용하여 세균 독성의 차이를 식별 할 수 있음을 확립했습니다. 차세대 염기서열 분석의 발달로 Tn-seq는 트랜스포종 돌연변이의 유용성을 확장하여 무작위로 돌연변이된 박테리아를 정량화하는강력한 방법을 8,9,10, 11. 트랜스포손의 필요성을 제거하고 대신 DNA 바코드를 사용하여 게놈 변화와 피트니스에 미치는 영향을 보다 쉽게 식별하고 추적하는 대체 프로토콜이 최근에 개발되었습니다12. 이 기술은 중요한 발전이지만 게놈 바코드의 삽입은 여전히 임의의 과정입니다. 이전 실험의 무작위성을 극복하기 위해, Yoon et al.은 박테리아13의염색체 상에서 정확한 위치에 삽입된 독특한 DNA 바코드를 사용하여 살모넬라 균주의 CI를 계산하는 방법을 개발하였다. 고유한 바코드 균주는 각 고유 바코드에 특적인 SYBR 녹색 및 프라이머를 사용한 qPCR 기반 방법을 사용하여 검출되었습니다. 이 기술은 프라이머 효율성의 차이와 낮은 감도를 포함하여 qPCR에 의해 부과된 제약 조건에 의해 제한되었으며, qPCR 이전에 중첩-PCR의 필요성이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근은 표적으로 한 게놈 수정이 다중 세균성 긴장의 풀을 검출하고 잠재적으로 정량화하기 위해 이용될 수 있었다는 것을 보여주었습니다.
다음 프로토콜에서, 우리는 매우 민감한 디지털 PCR 기술을 사용하여 정확한 정량화 뒤에 혼합 inocula의 큰 풀과 세균 경쟁 실험을 수행하는 새로운 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 염색체의 무해한 지구에 삽입된 유일한 DNA 바코드를 가진 유전으로 표지하는 세균성 긴장을 관련시킵니다. 이 수정을 통해 기존 직렬 희석, 복제 도금 및 표현형 마커(즉, 항생제 내성)에 의존하는 식민지 형성 단위 를 계산하는 대신 현대 분자 기술을 사용하여 균주를 빠르고 정확하게 정량화할 수 있습니다. ). 수정은 모든 균주가 정확한 동일한 조건에 노출되기 때문에 단일 풀화 접종에서 많은 균주의 동시 평가를 허용, 실질적으로 실험 가변성의 가능성을 감소. 또한, 이 기술은 살모넬라 장테리카 혈청염에서 개발되었지만, 모든 유전적으로 가단성 유기체및 정확한 세균 수가 필요한 거의 모든 실험 설계에 매우 적응력이 있어 새로운 이전 방법에 의해 부과 된 제약없이 미생물학 실험실의 정확성과 처리량을 높이기 위한 도구입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL culture tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>8599</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>30389241</td>
			<td>Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>17013804</td>
			<td>Use alternative multichannel pipettes with caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST Analysis</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td>Procure from any manufacturer or prepare yourself</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation5 Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MF</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCR Script Cam SK+</td>
			<td>Stratagene/Agilent</td>
			<td>211192</td>
			<td>No longer available commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer/Probe Design</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSKAP and pSKAP_Barcodes</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid numbers 122702-122726</td>
			<td>www.addgene.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864002</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. Typhimurium strain ATCC 14028s</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 14028s</td>
			<td>www.atcc.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take3 Micro-Volume Plate</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>TAKE3</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0054</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD1704</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0504</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0832</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0503</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F534L</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FEREL0011</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Visi-Blue Transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>UV95043301</td>
			<td>Or other transiluminator that allows visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP28191</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella

경쟁 지수는 세균적 적합성 및/또는 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 접근법의 유용성은 수행하기 쉽고 야생 형 유기체에 많은 균주의 적합성을 표준화하는 능력에 의해 예시됩니다. 이 기술은 그러나, 유효한 자형표 마커 및 동시에 평가될 수 있는 긴장의 수에 의해, 복제 실험의 큰 숫자에 대한 필요를 만드는 제한됩니다. 많은 수의 실험과 동시에, 자형표 마커에 기초한 박테리아를 정량화하기 위한 인건비 및 재료 비용은 중요하지 않다. 긍정적인 양상을 유지하면서 이러한 부정적인 측면을 극복하기 위해, 우리는 세균 염색체에 유전 마커를 엔지니어링 한 후 미생물을 직접 정량화하는 분자 기반 접근법을 개발했습니다. 독특한, 25 염기 쌍 DNA 바코드는 살모넬라의야생 형 및 돌연변이 균주의 염색체에 무해한 궤적에 삽입되었다. 시험관내 경쟁 실험은 풀링된 균주로 구성된 이노큘라를 사용하여 수행하였다. 경쟁 후, 각 스트레인의 절대 숫자는 디지털 PCR을 사용하여 정량화하고 각 변형에 대한 경쟁 지수는 그 값에서 계산되었다. 우리의 데이터는 살모넬라정량화에 대한 이 접근법이 매우 풍부하고 정확하며, 매우 풍부하고(높은 체력) 및 희귀(낮은 피트니스) 미생물을 모두 검출하는 데 매우 민감하고 정확하며 정확하다는 것을 나타냅니다. 또한,이 기술은 미생물의 절대 정량화를 필요로하는 다양한 실험 설계뿐만 아니라 수정 할 수있는 염색체를 가진 거의 모든 유기체에 쉽게 적응 할 수 있습니다.

이 방법론의 사용은 표적 DNA를 확인하기 위하여 이용된 각 탐사기의 감도 그리고 특이성을 확인하기 위하여 적당한 통제 반응이 수행된다는 것을 요구합니다. 이 대표적인 실험에서, 우리는 식별을 위해 8개의 해당 프로브로 8개의 고유 DNA 바코드를 검증했습니다. 모든 8개의 프로브는 NTC 및 음성 대조반응 모두에서 거짓양성의 낮은 비율을 가졌고(표 3), 매우 ...

Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

이 기술은 신속하고 높은 처리량 분자 기반 기술을 사용하여 매우 유사한 균주의 혼합 인구로부터 미생물의 정확하고 정확한 정량화를 가능하게합니다. 궁극적으로, 균주 사이 를 만들 수 있는 피트 니스의 비교를 가능하게. 단일 풀에서 많은 균주를 동시에 평가하는 능력은 모든 균주가 정확하게 동일한 조건에 노출되기 때문에 잘- 잘 또는 유기체 대 유기체 가변성을 실질적으로 감소시킵니다.이 기술의 적응성은 거의 모든 유전적 가단 성 유기체와 미생물의 정확한 정량화를 필요로하는 거의 모든 실험 설계에 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 세균성 염색체에 유전 마커의 공학으로 이 절차를 시작합니다. 하나를 제외한 모든 바코드가 포함된 유전체 DNA 풀을 만듭니다.이 풀을 희석제로 사용하여 남은 단일 바코드를 포함하는 게놈 DNA가 있는 희석 계열을 수행합니다. 프로브 기반 화학을 위해 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 반응을 중복으로 준비합니다. 풀이 된 게놈 DNA를 템플릿 DNA로 사용합니다.또한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 20 X 프라이머 프로브 마스터 믹스를 추가합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 복제 제어 반응을 준비합니다. 각 프로브 믹스에 대한 제어 반응은 템플릿 컨트롤 없음, 음수 컨트롤 및 양수 컨트롤로 구성되어야 합니다.각 바코드 게놈 DNA 샘플에 대한 디지털 PCR 반응을 생성하려면 이러한 단계를 반복합니다. 제조업체의 지침에 따라 액적 발생기를 사용하여 각 반응 조건에 대해 물방울을 생성합니다. 새로 만든 액적을 적절한 96 웰 플레이트로 옮기.5~50마이크로리터 멀티 채널 파이펫에 200개의 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하십시오. 모든 액적이 생성되고 옮겨진 후 호일 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 제조업체권장 열 사이클러를 사용하여 사이클링 조건을 수행하십시오.써모사이클링이 수행되는 동안 사용된 샘플 이름, 실험 유형 및 슈퍼믹스와 같은 플레이트 설정 정보와 함께 데이터 분석 소프트웨어를 프로그래밍합니다. 대상 1 이름과 대상 1 유형뿐만 아니라 대상 2 이름과 대상 2 유형도 포함됩니다. 써모 사이클링이 완료되면 제조업체의 지침에 따라 완성 된 반응을 물방울 판독기에게 전송하고 읽기 프로세스를 시작합니다.모든 우물을 읽고 실행이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 QLP 데이터 파일을 엽니다. 동일한 프라이머 프로브 마스터믹스를 사용하는 모든 웰을 선택합니다. 물방울 탭에서 양수 및 음수 방울을 포함하여 각 우물에서 분석된 액적 수를 검사합니다.총 물방울이 10, 000 미만인 우물은 분석에서 제외됩니다. 1D 진폭 탭으로 이동하고 양수 및 음수 방울의 진폭을 검사합니다. 2개의 고유한 인구로 구성되어 있는지 확인합니다.소프트웨어 내에서 임계값 을 사용하여 사용된 각 프로브에 대해 양수 및 음수 액적 간에 구분합니다. 모든 우물에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응에서 DNA 사본 수를 계산합니다. 추가 분석을 용이하게 하기 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.이러한 값을 사용하여 샘플의 각 고유 유전체 바코드의 초기 복사 수를 계산합니다. 음의 대조군 반응에서 평균 거짓 긍정 비율을 결정하고 실험 반응에서 얻은 값에서 이 값을 뺍니다. 각 실험을 설정할 때 수행된 희석제에 따라 필요에 따라 값을 곱합니다.이제, 경쟁 지수를 계산하거나 바코드 변형의 디지털 PCR 기반 정량화에서 경쟁 지수를 취소하여 유기체의 상대적 적합성을 결정한다. 모든 시간 지점에서 각 바코드 변형에 대해 이 단계를 수행합니다. AA 바코드를 포함하는 유전체 DNA는 다른 모든 바코드 게놈 DNA의 배경에서 희석되었다.채널 1은 AA 바코드의 FAM 프로브를 나타내고 채널 2는 AO 바코드에 대한 HEX 프로브를 나타냅니다. 각 프로브의 결과는 선택된 우물에 있는 모든 물방울의 형광 강도의 주파수를 나타내는 개별 물방울 형광 진폭 및 히스토그램으로 제시됩니다. 각 조건에 대 한, 양성 및 부정적인 물방울 형성 해야 2 별개의 인구.임계값 피쳐를 사용하여 인구를 분리하여 양수 및 음수 물방울을 정의해야 합니다. 임계값은 사용된 프로브에 따라 다르지만 동일한 프로브 믹스를 사용하는 모든 우물에는 동일한 임계값이 있어야 합니다. 희석된 AA의 경우, 히스토그램은 양수 방울이 음수물방울에 의해 실질적으로 열세이기 때문에 단일 인구만을 묘사하는 것으로 보입니다.그러나, 2개의 명백한 인구는 왼쪽 패널에 있는 물방울 형광 진폭을 검토해서 아직도 보입니다. AA 바코드 게놈 DNA가 희석됨에 따라 양성 물방울의 감소가 있었고, 긍정적인 AO 물방울의 수는 일정하게 유지되었습니다. 모든 우물에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응의 DNA 사본 수를 계산합니다.연구의 일환으로 PCR을 일상적으로 수행하는 경우 이 기술을 수행하여 모델 유기체의 적합성을 평가할 수 있습니다. 이 절차는 일반적으로 업스트림 실험의 최종 결과를 결정하는 데 사용됩니다. 그것의 진정한 유틸리티는 세균 성 정량화에 의존하는 모든 실험에 대한 용이성과 다양성을 촉진하는 것입니다.우리는 감염의 뮤린 모형에 있는 살모넬라 적합성을 평가하기 위하여 이 기술을 사용하고 있습니다. 추가적으로, 이 기술은 우리의 실험실에 있는 그밖 병원성 미생물과 사용하기 위해 적응되고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...