Name: digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

Bu yayında rapor edilen araştırma, George F. Haddix Cumhurbaşkanı fakülte Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel tıp bilimi (NıH) tarafından GM103427 ödül numarası uyarınca desteklenmektedir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.

1. Allelic Exchange için gerekli bileşenleri Içeren bir Plasmid üzerine benzersiz DNA barkodları dahil
Not: Yeni bir Plasmid, pskap adlı, yüksek kopya numarası ve artan dönüşüm verimliliği ile karşılaştırıldığında mevcut pKD13 allelik değişim plazmid oluşturuldu. Bu, 1.1-1.12 adımlarda açıklanmıştır (Şekil 1). Benzersiz DNA barkodları ve allelik değişimi için bileşenler içeren sonuçlandırılmış plazmids bir P...

<ol>
	<li>Beuz&#243;n, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo.">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li><li>B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid.">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li><li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations.">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li><li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+(LAB)+and+methicillin-resistant+S.+aureus+(MRSA)+in+mixed+culture.">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li><li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials.">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303 (2006).</li><li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria.">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).</li><li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota.">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).</li><li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq.">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li><li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome&#8208;wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn&#8208;seq,+a+high&#8208;throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms.">Genome&#8208;wide fitness and genetic interactions determined by Tn&#8208;seq, a high&#8208;throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li><li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria.">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).</li><li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors.">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella.">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#955;+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22.">&#955; red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li><li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., V&#225;zquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing,+IFN&#947;-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes.">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFN&#947;-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li><li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway.">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li><li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa:+in+vivo+studies.">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li><li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin.">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li><li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5'-nuclease+PCR.">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li><li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques.">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology.">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li><li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR.">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li><li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1,+2-Propanediol.">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li><li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing.">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li></ol>

Mikroorganizmaların doğru şekilde ölçülmesine yönelik yetenek, mikrobiyoloji araştırmaları için önemli bir öneme sahiptir ve ilk karma nüfusun benzersiz suşları numaralandırılması, Fitness ve virülans özelliklerini değerlendirmek için paha biçilmez bir araç olduğunu kanıtladı Bakteri. Ancak, bunu gerçekleştirmek için teknikler moleküler biyoloji modern gelişmeler ile ilerlemedi değil. Birçok bakterinin kromozomları kolayca değiştirmek için teknoloji, S dahil . Typhimurium, ...

Patojen organizmaların Fitness ve virulinin değerlendirilmesi Mikrobiyoloji araştırmalarının temel bir özelliğidir. Bu karşılaştırmalar suşları veya mutasyona uğramış organizmalar arasında yapılması için, hangi araştırmacılar belirli koşullarda belirli genlerin önemini belirlemek için izin verir. Geleneksel olarak, virülans değerlendirmesi farklı bakteriyel suşları kullanarak enfeksiyon bir hayvan modeli kullanır ve enfekte hayvanın sonucunu gözlemlemek (örneğin bulaşıcı doz50, ölümcül doz50, ölüm zamanı, belirti şiddeti, eksikliği Belirtiler, vb.). Bu prosedür, virulence değerli açıklamaları sağlar, ancak vahşi türde varyasyonları algılamak için sonuçlar önemli farklılıklar neden suşları gerektirir. Ayrıca, sonuçlar yarı niceliksel çünkü hastalık ilerlemesi ve semptom şiddeti zaman içinde subjektif olarak niceleyilebilir, vahşi türe kıyasla virülans yorumu daha niteliksel (yani daha fazla, daha az veya eşit derecede virlan). Hayvan infeksiyonunun gerçekleştirilmesi için ortak bir alternatif, rekabetçi Endeksleri (BDT), doğrudan Fitness ya da bir gerinlik virülans karma bir enfeksiyon bir vahşi tip mevkidaşı karşılaştırmak değerleri oluşturmak için1. Bu teknik, vahşi tip bir gerinim için virülans standardizasyon ve zayıflatma derecesini yansıtacak şekilde ölçülebilir bir değer belirleme tarafından enfeksiyon geleneksel hayvan modeli üzerinde sayısız avantajları vardır. Bu teknik, iptal edilmiş bir rekabetçi Endeks (COı)2belirlenerek bakterilerde gen etkileşimlerini analiz etmek için de adapte edilebilir. Bir COI 'nin bir grup mutasyona uğramış organizmalar için hesaplanması, araştırmacılar iki genin bağımsız olarak patogeneze katkıda bulunup bulunmadığını ya da aynı virülans yoluna katılıp birbirlerine bağımlı olup olmadığını belirlemesine olanak tanır. Ayrıca, bir CI hesaplanması, organizmaların patogenezine değerli Öngörüler sağlayan bakterilerin numaralandırılmasını gerektirir. BDT ve COIs de araştırmacılar klinik hastalığa neden olmayan ama hala Fitness farklılıkları var avirlan suşları asses izin. Bu teknik, suşları tanımlamak için geleneksel antibiyotik direnci belirteçlerinin kullanımı ile sınırlıdır, böylece giriş suşlarının sayısını aynı anda sadece bir ya da iki kez sınırlandırır. Bu sınırlama nedeniyle, çok sayıda deneysel grup ve çoğaltır gereklidir, bu da işçilik ve malzeme maliyetlerine ilaveye ek olarak, deneysel koşullarda değişkenlik ve hatalı sonuçlar için fırsatları da arttırır. (Virulence, Fitness ve gen etkileşimlerini incelemek için karışık enfeksiyonlar kullanmanın faydaları ve uygulamalarının kapsamlı bir gözden geçirilmesi için, bkz: CR Beuzón ve D.W. Holden 1)
Akış cytometri3,4,5ile niceli floresan etiketli hücrelerin kullanımı gibi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için girişimleri yapılmıştır. Bu teknik, 1 ' i kullanarak hücreleri ölçülebilir) fenotipik işaretçileri veya 2) endojenously üretilen floresan proteinleri etiketli antikorlar. Etiketli antikorların kullanımı 1.000 hücre/mL algılama sınırı vardır ve bu nedenle3analiz etmek için hücre yüksek sayıda gerektirir. Floresan proteinlerini ifade eden hücreler değiştirilmiş bir fizyolojisine sahiptir ve yüksek protein ifadesi6' dan kaynaklanan Fitness değişikliklerine duyarlıdır. Her iki yöntem de Akış sitometrisi kullanılarak algılanabilir floresan belirteçleri sayısı ile sınırlıdır. Bir duvar modeli7' de 1.000 suşlarının ilk karma enfeksiyonundan 120 suşlarında zayıflama tespit eden bir Mikroarray tekniğinin gelişimi ile moleküler ölçüte bir gelişme elde edildi. Bu teknik, sonuç olarak önemli değişkenlik sağlayan mutasyona uğramış suşlarından RNA 'nın Mikroarray analizini kullandı.  Yine de, karışık enfeksiyonların büyük havuzları yararlı bir araç olabilir ve hassas algılama teknikleri kullanarak, bakteriyel virülans farklılıkları tespit edilebilir kuruldu. Yeni nesil sıralamanın geliştirilmesi ile, TN-Seq transpozon mutasyonların yardımcı programını genişletti ve rasgele mutasyona uğramış bakteri ölçümü için güçlü bir yöntem sağlayan8,9,10, 11' den itibaren. Alternatif bir protokol son zamanlarda Transpozonlar ihtiyacını ortadan kaldırır ve bunun yerine daha kolay tanımlamak ve genomik değişiklikleri ve fitness üzerindeki etkilerini izlemek için DNA barkodları kullanır geliştirilmiştir12. Bu teknoloji büyük bir ilerlemedir, ancak genomik barkodların eklenmesi hala rasgele bir süreçtir. Önceki deneylerin rastgele üstesinden gelmek için, Yoon et al. bakterilerin kromozomları üzerinde kesin yerlere yerleştirilen benzersiz DNA barkodları kullanarak Salmonella suşlarının BDT 'sını hesaplamak için bir yöntem geliştirdi13. Benzersiz barkodlu suşlar, SYBR yeşil ve her benzersiz barkodan spesifik astar içeren qPCR tabanlı bir yöntem kullanılarak saptandı. Bu teknik, qPCR 'den önceki iç içe-PCR ihtiyacının kanıtlandığı primer verimlilikler ve düşük hassasiyette farklılıklar da dahil olmak üzere KSC tarafından uygulanan kısıtlamalarla sınırlıdır. Yine de bu yaklaşım, hedeflenen genomik değişikliklerin, birden fazla bakteriyel suşların havuzlarını tespit etmek ve potansiyel olarak ölçmek için yararlanabileceğini göstermiştir.
Aşağıdaki protokolde, son derece hassas bir dijital PCR tekniği kullanarak büyük karışık inokula havuzları ve ardından doğru ölçüte sahip bakteriyel rekabet denemeleri yapmak için yeni bir metodoloji tarif ediyoruz. Protokol, kromozom bir zararsız bölgeye yerleştirilen benzersiz bir DNA barkod ile genetik etiketleme bakteriyel suşları içerir. Bu değişiklik suşları hızlı ve doğru geleneksel seri seyreltme yerine modern moleküler teknoloji kullanarak nicelik sağlar, yineleme kaplama, ve fenotipik belirteçler (yani antibiyotik direnci güveniyor koloninin şekillendirme birimleri sayma ). Değişiklikler, tek bir havuza alınan inokulum içinde birçok suşların eşzamanlı değerlendirilmesi için izin, önemli ölçüde tüm suşları tam aynı koşullara maruz çünkü deneysel değişkenlik olasılığını azaltır. Ayrıca bu teknik Salmonella enterica serovar typhimurium 'da geliştirilirken, herhangi bir genetik olarak kötü hale gelebilen organizmaya ve doğru bakteriyel sayılarının gerekli olduğu neredeyse her deneysel tasarıma son derece uyarlanabilir, yeni bir önceki yöntemlerle uygulanan kısıtlamalar olmadan Mikrobiyoloji laboratuvarlarında doğruluğu ve verimi artırmak için bir araçtır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL culture tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>8599</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>30389241</td>
			<td>Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>17013804</td>
			<td>Use alternative multichannel pipettes with caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST Analysis</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td>Procure from any manufacturer or prepare yourself</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation5 Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MF</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCR Script Cam SK+</td>
			<td>Stratagene/Agilent</td>
			<td>211192</td>
			<td>No longer available commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer/Probe Design</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSKAP and pSKAP_Barcodes</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid numbers 122702-122726</td>
			<td>www.addgene.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864002</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. Typhimurium strain ATCC 14028s</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 14028s</td>
			<td>www.atcc.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Take3 Micro-Volume Plate</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>TAKE3</td>
			<td>Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0054</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD1704</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERFD0504</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0832</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FERK0503</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F534L</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FEREL0011</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Visi-Blue Transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>UV95043301</td>
			<td>Or other transiluminator that allows visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP28191</td>
			<td>Procure from any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital pcr-based competitive index for high-throughput analysis of fitness in salmonella

Rekabetçi bir endeks, bakteriyel Fitness ve/veya virulence değerlendirmek için kullanılan ortak bir yöntemdir. Bu yaklaşımın yarar gerçekleştirmek için kolaylığı ve bir vahşi tip organizmaya birçok suşların Fitness standartlaştırmak yeteneği tarafından örneklenmiştir. Teknik, ancak, mevcut fenotipi belirteçler ve aynı anda değerlendirilebilir suşların sayısı tarafından, çoğaltır deneyler çok sayıda ihtiyacı oluşturarak sınırlıdır. Çok sayıda deney ile eşzamanlı olarak, fenotipik işaretçileri dayalı bakterilerin ölçülmesini için işçilik ve malzeme maliyetleri önemsiz değildir. Olumlu yönlerini koruyarak bu olumsuz yönlerini aşmak için, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçleri mühendislik sonra doğrudan mikroorganizmalar ölçmek için moleküler tabanlı bir yaklaşım geliştirdik. Benzersiz, 25 baz çifti DNA barkodları, yaban tipi ve Salmonellamutant suşlarının kromozom üzerinde bir zararsız Locus yerleştirilir. In vitro rekabet denemeleri, havuzlanmış suşlardan oluşan inocula kullanılarak yapılmıştır. Rekabetin ardından, her bir gerilimin mutlak sayısı dijital PCR kullanılarak ölçülebilir ve her bir gerinim için rekabetçi endeksleri bu değerlerden hesaplanır. Verilerimiz, Salmonella 'yı ölçmek için bu yaklaşımın, hem son derece bol (yüksek Fitness) hem de nadir (düşük Fitness) mikroorganizmaları tespit etmek için son derece hassas, doğru ve hassas olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu teknik, neredeyse herhangi bir organizmaya modifikasyon yapabilen kromozomlar ve mikroorganizmaların mutlak ölçülmesini gerektiren çeşitli Deneysel tasarımlar için kolayca uyarlanabilir.

Bu metodolojinin kullanımı, hedef DNA 'yı tanımlamak için kullanılan her prob hassasiyeti ve özgüllüğü doğrulamak için uygun kontrol reaksiyonları gerçekleştirilmesini gerektirir. Bu temsilci denemede, sekiz benzersiz DNA barkodları ile kimlik tespiti için sekiz probla onaylandı. Tüm sekiz probların hem NTC hem de negatif kontrol reaksiyonları (Tablo 3) yanlış pozitifi düşük bir oranı vardı, oldukça benzer DNA dizileri arasında bile kendi ö...

Watch this Scientific Journal Video about Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella at JoVE.com

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Bu teknik, mikroorganizmaların hızlı ve yüksek verimli moleküler tabanlı teknikler kullanarak son derece benzer suşların karışık popülasyonundan doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Sonuçta, suşları arasında yapılacak fitness karşılaştırmalar sağlayan. Tek bir havuzda aynı anda birçok suşları değerlendirme yeteneği, tüm suşları tam olarak aynı koşullara maruz olduğu için iyi-to-well veya organizma-organizma değişkenliğini önemli ölçüde azaltır.Bu tekniğin uyarlanabilirliği, neredeyse genetik olarak şekillendirilebilir organizmalar ve mikropların doğru bir şekilde ölçülmesi gereken neredeyse tüm deneysel tasarımlar için kullanılmasını sağlar. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçlerin mühendisliği ile başlayın. Biri hariç her barkodu içeren genomik DNA havuzu oluşturun.Tek kalan barkod içeren genomik DNA ile seyreltme serisi gerçekleştirmek için seyreltici olarak bu havuzu kullanın. Prob tabanlı kimya için tasarlanmış bir dijital PCR supermix kullanmak için üreticinin önerilerine göre yinelenen dijital PCR için reaksiyonlar hazırlayın. Şablon DNA olarak birleştirilmiş genomik DNA'yı kullanın.Ayrıca, metin protokolünde açıklandığı gibi 20 X primer sondası Master Mix ekleyin. Üreticinin önerilerine göre dijital PCR için çoğaltma kontrol reaksiyonları hazırlayın. Her sonda karışımı için denetim reaksiyonları Şablon yok denetimleri, negatif denetimler ve pozitif denetimlerden oluşmalıdır.Her barkodlu genomik DNA örneği için dijital PCR reaksiyonları oluşturmak için bu adımları tekrarlayın. Üreticinin talimatlarına göre, bir damlacık jeneratör kullanarak her reaksiyon durumu için damlacıklar oluşturun. Yeni oluşturulan damlacıkları uygun 96 kuyu plakasına aktarın.5 ile 50 mikrolitre lik çok kanallı pipette 200 mikrolitre lik pipet ucu kullanın. Tüm damlacıklar üretilip transfer edildikten sonra, plakayı folyo plakalı bir mühürle kapatın. Üretici bisiklet koşullarını gerçekleştirmek için termal döngücün tavsiye sini kullanın.Termobisiklet yapılırken, veri analiz yazılımını örnek ad, deneme türü ve supermix gibi plaka kurulum bilgileriyle programlayın. Ayrıca Hedef 1 adı ve Hedef 1 türünün yanı sıra Hedef 2 adı ve Hedef 2 türünü de içerir. Termobisiklet tamamlandıktan sonra, tamamlanan reaksiyonları damlacık okuyucuya aktarın ve üreticinin talimatlarına göre okuma işlemini başlatın.Tüm kuyular okunduğunda ve çalışma tamamlandığında, veri çözümleme yazılımını kullanarak QLP veri dosyasını açın. Aynı astar sondası Mastermix kullanan tüm kuyuları seçin. Damlacıklar sekmesinde, hem pozitif hem de negatif damlacıklar da dahil olmak üzere her kuyuda analiz edilen damlacıkların sayısını inceleyin.10.000 toplam damlacıktan daha az olan kuyuları analizden hariç tut. 1B Genlik sekmesine geçin ve pozitif ve negatif damlacıkların genliklerini inceleyin. 2 farklı popülasyondan oluştuğundan emin olun.Yazılım içinde, kullanılan her sonda için pozitif ve negatif damlacıklar arasında bir kesme yapmak için eşik özelliğini kullanın. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra, yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar. Daha fazla analiz kolaylaştırmak için verileri elektronik tabloya aktarın.Bu değerleri kullanarak, örnekteki her bir benzersiz genomik barkodun ilk kopya numarasını hesaplayın. Negatif kontrol reaksiyonlarından ortalama yanlış pozitif oranı belirleyin ve bu değeri deneysel reaksiyonlarda elde edilen değerlerden çıkarın. Her denemeyi kurarken yapılan seyreltmelere göre değerleri gerektiği gibi çarpın.Şimdi, rekabetçi endeksi hesaplayarak bir organizmanın göreceli uygunluğunu belirleyin veya barkodlu suş dijital PCR tabanlı niceleme rekabet endeksi iptal. Her zaman noktalarında her barkodlu zorlanma için bu adımı gerçekleştirin. AA barkodu içeren genomik DNA diğer tüm barkodlu genomik DNA'nın arka planında seyreltildi.Kanal 1, AA barkodiçin FAM sondasını, Kanal 2 ise AO barkod için HEX sondasını temsil eder. Her sondanın sonuçları hem tek tek damlacık floresan genliği hem de seçilen kuyularda bulunan tüm damlacıkların floresan yoğunluğunun sıklığını temsil eden bir histogram olarak sunulur. Her durum için pozitif ve negatif damlacıklar 2 ayrı popülasyon oluşturmalıdır.Popülasyonlar pozitif ve negatif damlacıkları tanımlamak için eşiközelliği kullanılarak ayrılmalıdır. Eşik değerleri kullanılan problara bağlı olarak değişir, ancak aynı prob karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır. Seyreltilmiş AA durumunda, histogram pozitif damlacıklar önemli ölçüde negatif damlacıklar tarafından sayıca az olduğu için sadece tek popülasyon tasvir görünür.Ancak, 2 farklı popülasyon lar sol panellerde damlacık floresan genliği inceleyerek hala görülebilir. AA barkodlu genomik DNA seyreltildikçe pozitif damlacıklarda azalma oldu, pozitif AO damlacıklarının sayısı sabit kaldı. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar.Araştırmanızın bir parçası olarak rutin olarak PCR yaparsanız, model organizmanızın zindeliğini değerlendirmek için bu tekniği gerçekleştirebilirsiniz. Bu yordam normalde upstream deneylerin sonunda sonuçlarını belirlemek için kullanılır. Onun gerçek yarar bakteriyel nicelik güveniyor herhangi bir deney için kolaylık ve çok yönlülük teşvik etmektir.Biz enfeksiyon bir murine modelisalmonella fitness değerlendirmek için bu tekniği kullanıyoruz. Ayrıca bu teknik laboratuvarımızda diğer patojen mikroorganizmalarla kullanılmak üzere uyarlanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...