Name: a rabbit model of aqueous-deficient dry eye disease induced by concanavalin a injection into the lacrimal glands: application to drug efficacy studies
Uploaded: 2020-01-24T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies at JoVE

Tutti gli studi sugli animali sono stati completati in conformità e nel rispetto di tutte le pertinenti linee guida normative e istituzionali. Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Review Board della Stony Brook University e sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visionaria.
Questi studi sono stati sostenuti in parte da una sovvenzione Targeted Research Opportunities della Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) e da una borsa di ricerca di Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Gli autori ringraziano Michele McTernan per il supporto editoriale.

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	<li>Paulsen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+in+the+Beaver+Dam+Offspring+Study:+prevalence,+risk+factors,+and+health-related+quality+of+life.">Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life.</a> American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).</li><li>Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+risk+factors+of+dry+eye+disease+in+a+British+female+cohort.">Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).</li><li>Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. 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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti ad eccezione di BR che ha una posizione di capitale in Medicon Pharmaceuticals, Inc. e LH, un dipendente di Medicon Pharmaceuticals, Inc.

I conigli sono molto attraenti per lo studio del DED. La loro cornea e congiuntiva hanno una superficie più vicina a quella degli esseri umani rispetto a topi e ratti; il loro complemento di enzimi metabolizzanti farmacologici come le ereditiche, e l'elandologia delle loro ghiandole lacrimali sono simili a quelli degli esseri umani, e i loro occhi sono abbastanza grandi per studi farmacocinetici informativi. Rispetto ai maiali e alle scimmie, con cui condividono caratteristiche simili, costano meno e la loro manipolazione sperimentale è più facile. Se si contemplano studi meccanicistici, un relativo inconveniente del coniglio, rispetto ai topi, è che sono disponibili meno reagenti (ad esempio, anticorpi monoclonali). D'altra parte, il coniglio è di gran lunga superiore ai topi per gli studi farmacocinetici e di biodistribuzione perché i singoli tessuti sono facilmente sezionati e di dimensioni sufficienti per il lavoro analitico, evitando il "sample pooling".
Un parametro generale critico è il periodo di acclimatazione dei conigli. Gli animali vengono spediti dal venditore in condizioni che spesso non garantiscono un ambiente di trasporto della temperatura o dell'umidità appropriata. Alcuni animali potrebbero aver già sviluppato l'occhio secco all'arrivo. Si raccomanda un periodo di acclimatazione di due settimane. Altrettanto importante è l'attenzione scrupolosa all'umidità e alla temperatura dello spazio in cui i conigli studio sono alloggiati nel vivaio. Le deviazioni in entrambe le condizioni possono indurre enormi variazioni nel loro stato oculare. Avere umidificatori di back-up e deumidificatori a portata di mano. Se il sistema centrale si guasta, agire rapidamente per ripristinare l'umidità ambiente utilizzando l'apparecchiatura di backup. Tenete a mente che tali sviluppi sfortunati sono più comuni nei mesi estivi. I tre passaggi più critici, tuttavia, per indurre con successo il DED nei conigli sono: 1) l'uso abile dell'imaging statunitense per identificare l'ILG e dirigere e confermare l'iniezione di Con A; 2) garantire l'iniezione sia dell'ILG che delle due parti del SLG; e 3) in modo affidabile e riproducibile riassumendo i parametri del DED.
Lo sviluppo della competenza sperimentale richiesta non è banale, ma non dovrebbe scoraggiare alcun investigatore serio. Aspettatevi che la curva di apprendimento venga completata entro cinque iterazioni. Un sistema di imaging statunitense di qualità ragionevole è essenziale. Il riconoscimento dei segni anatomici da parte degli Stati Uniti è importante, quindi, l'investigatore dovrebbe rivedere l'anatomia del coniglio. L'eccellente descrizione dell'anatomia del coniglio di Davis25, un classico, può essere immensamente utile. Anche tenere a mente la variazione delle dimensioni del ILG. Il corollario di questo è che il successo di Con A deve sempre essere confermato con l'imaging di follow-up. Variazioni nella risposta al Con A in un gruppo di conigli è più spesso dovuto alla tecnica di iniezione (iniezione non riuscita o parzialmente riuscita) o a ignorare la capacità dei tessuti della ghiandola lacrimale residui per compensare con la sovrapproduzione di lacrime. Per coloro che desiderano padroneggiare la tecnica di iniezione, l'iniezione di blu di metilene seguita da dissezione anatomica pronta può essere utile; la visualizzazione si ottiene se raggiunge la ghiandola lacrimale o si riversa sui tessuti vicini. Ad oggi, questo metodo di iniezione è stato eseguito più di 270 volte dagli autori senza una singola complicazione.
Sodire che i cinque parametri del DED presentati sopra possono essere difficili come è la loro determinazione nella pratica clinica. Anche se le variazioni circadiane non sono ancora state formalmente documentate in nessuno di essi, ci sono prove di base di tali fenomeni nell'occhio28 che dovrebbero essere annotati nello stesso momento del giorno (1 h), specialmente quando i saggi ripetuti devono essere eseguiti e confrontati tra loro. La coerenza nell'esecuzione di questi saggi è essenziale. È necessaria una squadra di due persone. Quattro o più investigatori nella stessa stanza che partecipano ai saggi possono essere dirompenti, dato che alcuni passaggi richiedono tempi rigidi. È importante una documentazione fotografica adeguata e di alta qualità, ove indicata.
Questo modello è ideale per gli studi di sviluppo di farmaci. La padronanza del modello animale e le tecniche di saggia hanno garantito un'eccellente riproducibilità19 degli studi di efficacia e sicurezza.
Si tratta di un potente approccio sperimentale perché elimina la variabilità confusa dei modelli precedenti, ha semplificato il modello animale ed essenzialmente standardizzato analizzando i cinque parametri del DED. Il successo dell'applicazione di questo modello allo studio di un agente terapeutico candidato ha affermato la sua utilità pratica come modello animale informativo per una malattia che ha un disperato bisogno di nuovi agenti e di una comprensione più profonda della sua patogenesi.

La malattia dell'occhio secco (DED) è una condizione cronica con elevata prevalenza e morbilità1,2,3,4. L'infiammazione svolge un ruolo chiave nella sua patogenesi5,6. La fisiofisiologia del DED è concettualizzata come derivante dalla sottoproduzione o dall'eccessiva evaporazione delle lacrime; il primo è anche conosciuto come Aqueous-carente DED7. La sindrome di Sjàgren, una causa prototipodica di DED, ampiamente studiata, colpisce principalmente le ghiandole lacrimali (LG) ed è un esempio lampante della loro importanza nella patogenesi del DED. Il DED è spesso trattato con lacrime artificiali che forniscono sollievo temporaneo, o con ciclosporina o lifitegrast, entrambi i quali sopprimono l'infiammazione oculare. Nessuno dei trattamenti disponibili per il DED è ottimale, rendendo necessario lo sviluppo di nuovi agenti8,9.
La ricerca di nuovi agenti terapeutici per il DED è ostacolata da tre grandi sfide: la mancanza di un bersaglio molecolare farmaco dedrugabile riconosciuto, che può essere sfuggente data la complessità patologica del DED; la svanitità di agenti promettenti; e la mancanza di modelli animali che ricapitolano le caratteristiche chiave del DED.
Come per la maggior parte degli sforzi di sviluppo di farmaci, i modelli animali informativi del DED sono uno strumento investigativo cruciale, nonostante la dichiarazione assiomatica che nessun modello animale riassume completamente una malattia umana. I modelli di topo, ratto e coniglio di DED sono i più comunemente utilizzati mentre cani e primati sono usati raramente10,11. La maggior parte degli oltre 12 modelli di coniglio DED segnalati fino ad oggi tentano di ridurre la produzione di strappi rimuovendo Gli LG o impedendo loro funzione12,13,14,15,16. Tali approcci includono la resezione chirurgica dell'ILG; chiusura del condotto escretorio; e compromettendo la funzione LG per irradiazione o iniezione di uno dei seguenti: linfociti attivati, mitogeni, tossina botulinica, atropina o benzalklonium. Le principali limitazioni di questi metodi sono la loro incoerenza e la frequente soppressione parziale della produzione di strappi.
Concanavalin A (Con A), una lectin di origine vegetale, è un potente stimolatore di sottoinsiemi di cellule T ed è stato utilizzato in modelli sperimentali di epatite17 e DED18. Il modello originale basato su Con A è stato segnalato per offrire vantaggi significativi, tra cui la sua relativa semplicità; l'afflusso di cellule infiammatorie negli Ng, imitando malattie come quella di Sjogren; stimolazione delle citochine infiammatorie IL-1, IL-8 e TGF-1; funzione di strappo ridotta monitorata misurando la distanza della fluoresceina lacrimale e il tempo di rottura dello strappo (TBUT); e la reattività dei farmaci indicati per un corticosteroide antinfiammatorio.
Quando è stato applicato questo promettente metodo, oltre ai suoi vantaggi, sono state identificate limitazioni che hanno reso necessaria la sua revisione complessiva e drastici miglioramenti. Sono documentate tre carenze critiche del metodo. In primo luogo, il modello era acuto; il DED indotto si è abbassato dopo circa 1 settimana. In secondo luogo, la risposta degli animali era incoerente. Come dimostrato, nelle iniezioni trascutanee "cieche" all'Inferior LG (ILG), La Con A è stata consegnata solo casualmente alla ghiandola mirata. Uno studio dettagliato dell'anatomia dell'ILG ha rivelato che le sue dimensioni potrebbero variare fino a 4 volte19 facendo tali iniezioni "hit-or-miss" sforzi. Infine, anche quando l'ILG è stato iniettato, il Superiore LG (SLG) spesso compensato per il flusso di strappo ridotto, rendendo il modello problematico.
Queste limitazioni chiave sono state superate introducendo tre modifiche al metodo, generando un modello animale superiore di DED. In primo luogo, l'iniezione di Con A nell'ILG è stata eseguita sotto guida ad ultrasuoni (US), assicurando che La Con A entrasse nella ghiandola. Il successo dell'iniezione è stato confermato ottenendo un'immagine statunitense post-iniezione, come mostrato nella Figura 1. In secondo luogo, per rimuovere il contributo lacrimale compensativo del SLG, sia il palpebrale che le parti orbitali di questa ghiandola sono state iniettate con Con A. Infine, questo modello acuto di DED è stato convertito in uno cronico da ripetute iniezioni di Con A ogni 7-10 giorni. DED della durata di 2 mesi è facilmente raggiungibile in questi conigli. Il successo di questo approccio è stato ampiamente documentato19.
Come già accennato, un'importante applicazione dei modelli animali di DED è quella di determinare l'efficacia e la sicurezza degli agenti terapeutici candidati. L'utilità di questo modello è stata dimostrata dallo studio del fosforopiccolo (OXT-328), una nuova piccola molecola antinfiammatoria20,21 somministrata come colliri. La sua efficacia è stata dimostrata sulla base di un pannello di parametri di DED19. La relativa semplicità e la natura informativa di questo modello ha anche permesso di confrontare fianco a fianco il fosforinininine con i due farmaci approvati dalla FDA per DED, ciclosporina e lifitegrast, dimostrando la sua forte superiorità preclinica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm macro lens</td>
			<td>Canon EF 100mm f/2.8L IS USM</td>
			<td>3554B002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needles (5/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305115</td>
			<td>Needles for injecting ConA into the lacrimal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles (5/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305921</td>
			<td>Needles for injecting ConA into the lacrimal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aceproinj (acepromazine)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health, Dublin, OH</td>
			<td>NDC11695-0079-8</td>
			<td>0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>VetEquip, Pleasanton, CA</td>
			<td>Item #911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bishop Harmon Forceps</td>
			<td>Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ</td>
			<td>E1500-C</td>
			<td>Tissue forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ</td>
			<td>E-2404</td>
			<td>Caliper used to measure length of needle during ConA injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR camera</td>
			<td>Canon EOS 7D DSLR</td>
			<td>3814B004</td>
			<td>Digital single lens reflex camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein</td>
			<td>AKRON, Lake Forest, IL</td>
			<td>NDC17478-253</td>
			<td>Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein, Melville, NY</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactoferrin ELISA kit</td>
			<td>MyBiosource, San Diego, CA</td>
			<td>MBS032049</td>
			<td>Measure tear lactoferrin level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>L5647</td>
			<td>1% in PBS for anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macro/ring flash</td>
			<td>Canon Macro Ring Lite MR-14EXII</td>
			<td>9389B002AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmolarity tips</td>
			<td>TearLab Corp., San Diego, CA</td>
			<td>#100003 REV R</td>
			<td>Measure tear osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Mediatech, Inc. Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text)</td>
			<td>Charles River Labs, Waltham, MA</td>
			<td>2-3 kg</td>
			<td>Research animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO</td>
			<td>NDC51801-004-40</td>
			<td>1% in PBS, stain the ocular surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schirmer strips</td>
			<td>Eaglevision, Katena products. Denville, NJ</td>
			<td>AX13613</td>
			<td>Measure tear production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Loupes +1.50</td>
			<td>Designs for Vision, Bohemia, NY</td>
			<td>Specialty item</td>
			<td>Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TearLab Osmometer</td>
			<td>TearLab Corp., San Diego, CA</td>
			<td>Model #200000W REV A</td>
			<td>Measure tear osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe</td>
			<td>VisualSonics Toronto, Ont</td>
			<td>MX 550 S</td>
			<td>Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rabbit model of aqueous-deficient dry eye disease induced by concanavalin a injection into the lacrimal glands: application to drug efficacy studies

La malattia dell'occhio secco (DED), una malattia infiammatoria multifattoriale della superficie oculare, colpisce 1 essere umano su 6 in tutto il mondo con implicazioni impressionanti per la qualità della vita e i costi sanitari. La mancanza di modelli animali informativi che ricapitolano le sue caratteristiche chiave ostacola la ricerca di nuovi agenti terapeutici per il DED. I modelli animali DED disponibili hanno una riproducibilità e un'efficacia limitate. Qui viene presentato un modello in cui il DED viene indotto iniettando il concanavalin mitogenA (Con A) nelle ghiandole lacrimali orbitali dei conigli. Gli aspetti innovativi di questo modello sono l'uso di indicazioni a ultrasuoni (US) per garantire un'iniezione ottimale e riproducibile della Con A nella ghiandola lacrimale inferiore; iniezione di Con A in tutte le ghiandole lacrimali orbitali che limitala produzione compensativa delle lacrime; e l'uso di iniezioni periodiche di ripetizione di Con A che prolungano lo stato di DED a volontà. DED e la sua risposta agli agenti di prova sono monitorati con un pannello di parametri che valutano la produzione di strappi, la stabilità della pellicola lacrimale e lo stato della mucosa corneale e congiuntivale. Includono osmolarità lacrimale, tempo di rottura della lacrima, test di strappo di Schirmer, colorazione bengala rosa, e livelli di lactorina lacrimale. L'induzione del DED e il monitoraggio dei suoi parametri sono descritti in dettaglio. Questo modello è semplice, robusto, riproducibile e informativo. Questo modello animale è adatto per lo studio della fisiologia lacrimale e della fisiopatologia del DED, nonché per la valutazione dell'efficacia e della sicurezza degli agenti candidati per il trattamento del DED.

Le iniezioni di A hanno indotto una forte risposta infiammatoria nelle ghiandole lacrimali caratterizzata da un denso infiltrato linfocitico (Figura 13), accompagnato da una diminuzione della produzione di strappi. Tutti i parametri di strappo sono stati notevolmente modificati(tabella 1 e tabella 2). Inoltre, i livelli di lactoferina lacrimale sono stati soppressi (controllo 3,1-0,45 contro La Proteina Con iniettata è 2,7-0,02 ng/mg (media - SEM); p<0,03). Il risultato finale fu un epitelio corneale e congiuntivale compromesso, evidenziato da una maggiore colorazione bengala di rosa (Figura 6).
L'iniezione dei tre tessuti Orbitali LG ha prodotto uno stato DED coerente e uniforme a differenza degli stati ottenuti con i metodi precedenti18,27. I principali contributori a questo risultato sono stati l'iniezione guidata dagli Stati Uniti dell'ILG e l'iniezione dell'OSLG. Nella tabella 1 sono riepilogati i risultati salienti di questo metodo. Tutte le modifiche sono coerenti con il DED grave.
Un singolo set di iniezioni Con A produce DED della durata di circa 1 settimana; tutti i parametri clinici si normalizzano entro il giorno 10(tabella 2). Sequenziali Con A iniezioni di circa 1 settimana di distanza estendere la durata del DED di conseguenza. Per esempio, il secondo set di iniezioni Con A il giorno 7 mantiene DED per 2 settimane e così via. Dopo circa 5 serie di iniezioni, lo stato DED diventa spesso permanente senza la necessità di ulteriori iniezioni.
Quando i conigli con DED indotto da Con A sono stati trattati con il nuovo agente fossforsulindac, ha soppresso notevolmente la malattia. Ad esempio, dopo una settimana di trattamento con questo agente TBUT è aumentato notevolmente rispetto agli animali trattati con veicoli (43,6 ,4,0 contro. 12,2-2,8 s; p<0.001; media - SEM rispettivamente, per questi e successivi valori) mentre l'osmolarità strappo è stata normalizzata (294-4,6 contro 311-2,0 mOsm/L, p<0.002). Meccanicamente, il fosfosulindac ha diminuito i livelli di due interleucelli cruciali, IL-1, (8,4 x 1,2 vs 21,2-6,6 proteine pg/mg; p<0.03) e IL-8 (4,9-1,7 contro 13,5,5,0 proteine pg/mg; p<0.05)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig1a.jpg"> Figura 1: Immagine ad ultrasuoni della ghiandola lacrimale inferiore. Pannello superiore: L'ILG mentre si muove più in profondità in orbita per giacere sotto l'arco zigomatico. La linea tratteggiata rappresenta la linea sulla pelle attraverso la quale viene spazzata la sonda statunitense. Pannelli centrali: Mentre il pezzo di mano viene spazzato attraverso questa linea, l'esaminatore cerca la perdita dell'eco ossea zigomatica presente nell'immagine a sinistra (freccia) e scompare a destra. Pannelli inferiori: Immagini dell'ILG scattate prima (a sinistra) e dopo(a destra) iniezione di Con A. Sviluppo di un grande spazio cistico all'interno della ghiandola conferma la corretta consegna. Ristampato con permesso19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig1alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig02.jpg"> Figura 2: Sedazione maschera antigas. Questa fotografia mostra la maschera antigas che fornisce una breve sedazione moderata con isoflurane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig3a.jpg"> Figura 3: Rimozione della membrana nictitante. (A) Iniezione di lidocaina/epinefrina. (B) Troncamento della membrana nictitante alla sua base con forbici Westcott. (C) La superficie oculare visualizzata più facilmente dopo la rimozione della membrana nictitante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig03.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig4a.jpg"> Figura 4: Misurazione del tempo di rottura della strappo. (A) Aspetto uniforme della pellicola a strappo verde della superficie corneale sotto la luce blu immediatamente successiva all'applicazione di gocce di fluoresceina. (B) Superficie corneale che ha già subito una marcata rottura evidenziata da più occhiaie e striature lineari nella fluoresceina. Il tempo di rottura viene registrato non appena si sviluppa la prima macchia o linea scura. I due cerchi azzurri sono riflessi della sorgente luminosa fuori della cornea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig5a.jpg"> Figura 5: Test lacrimogeni di Schirmer. (A) Il corretto posizionamento della spugna Weck-Cel nella fornix inferiore per rimuovere qualsiasi soluzione lidocaina topica residua e lacrime di base. Posizionando il bordo posteriore della spugna triangolare sotto il margine inferiore del coperchio, si può mantenere una tecnica molto uniforme per asciugare la superficie oculare prima del posizionamento delle strisce di strappo. (B) Una striscia di strappo opportunamente posizionata nella posizione centrale del coperchio inferiore tra il globo e il coperchio inferiore (palpebral conjunctiva). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig06.jpg"> Figura 6: Colorazione bengala Rosa. Superiore: Fotografie della superficie corneale. Sinistra: Non è presente alcuna colorazione bengala di rosa prima del trattamento con la Con A. A destra: la colorazione corneale e congiuntivale diffusa è osservata nel quadrante nasale superiore dopo l'iniezione (in alto a destra). Inferiore: Cattuale cattualelogo congiunzione delle impressioni della congiunzione congiunzione. Sinistra: Numerose cellule di calice sono presenti prima del trattamento. A destra: le cellule epiteliali sono presenti, ma le cellule di calice sono assenti dopo il trattamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig7a.jpg"> Figura 7: Preparazione del coniglio per il concanavalin iniezioni A. (A) Piccole cesoie sono utilizzate per rimuovere la pelliccia, consentendo una più facile visualizzazione dei punti di riferimento per identificare la ghiandola lacrimale superiore orbitale. (B) Nair viene utilizzato per rimuovere i capelli che rimangono dopo la tosatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig07.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig8a.jpg"> Figura 8: Iniezione della ghiandola lacrimale palpebrale. (A) La ghiandola lacrimale palpebrale, che appare come un'elevazione bulbosa nella porzione temporale posteriore del coperchio superiore. Le lacrime vengono osservate scorrere dalla superficie di questa ghiandola dopo l'applicazione di una goccia di 2% fluoresceina. (B) La ghiandola lacrimale palpebrale viene iniettata mentre il coniglio riceve una sedazione moderata. Un investigatore ritrae la palpebra, ottimizza l'esposizione della ghiandola e fissa la maschera mentre il secondo sperimentatore inietta la ghiandola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig09.jpg"> Figura 9: Localizzazione della ghiandola lacrimale superiore orbitale. I cambiamenti nei contorni della pelle indicano la posizione dell'OSLG mentre sporge attraverso l'incisure posteriore. La pressione mediale alternata sul globo(grande freccia) provoca la prolasssione della ghiandola orbitale superiore, che è vista come una piccola elevazione nella pelle. Questa quota altimetrica aumenterà di dimensioni ogni volta che viene applicata la pressione (piccole frecce). La posizione di questa ghiandola è di solito in linea con il bordo orbitale posteriore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig10a.jpg"> Figura 10: Iniezione della ghiandola lacrimale superiore orbitale. (A) Applicazione di una leggera pressione al cranio con pinze dai denti fini nell'area prolassato come nella Figura 9. Una sottile apertura a slit-like nel cranio può essere palpata. Lasciare un piccolo segno di rientro con le pinze aiuta notevolmente il posizionamento dell'ago durante l'iniezione. (B) L'ago viene inserito perpendicolarmente attraverso l'incisure. Se posizionato in modo errato, il suo passaggio viene fermato dal cranio osseo. (C) L'ago è in posizione finale inclinato verso il canto laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig10.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig11a.jpg"> Figura 11: Localizzazione della ghiandola lacrimale inferiore. (A) La prominenza della parte superficiale dell'ILG vista attraverso il coperchio inferiore. Il segno di penna curvilineale indica la posizione inferiore della ghiandola. La linea verticale, sotto il limbo nasale, indica la posizione approssimativa in cui l'ILG passa in una posizione più profonda all'interno dell'orbita e funge da riferimento visivo per gli Stati Uniti. (B) Us mano-pezzo spazzare attraverso l'area della linea verticale; il monitor statunitense mostrerà dove finisce l'osso zigomatico, dove l'ILG si transizioni e dove dovrebbe essere somministrata l'iniezione Di A ("sito di iniezione"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig12.jpg"> Figura 12: Iniezione della ghiandola lacrimale inferiore. L'iniezione dell'ILG viene effettuata nel luogo identificato dagli Stati Uniti. La profondità dell'iniezione viene calcolata come descritto nel testo (passaggio 5.8.6). Le pinze (viste dietro l'ago) assicurano che l'ago sia posizionato alla profondità corretta prima dell'iniezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig12large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig13.jpg"> Figura 13: Istologia delle ghiandole lacrimali. Sezioni tissutali di una normale ghiandola lacrimale inferiore con tipica struttura tubulo-alveolare (A) e successiva iniezione di Con A (B), mostrando un marcato infiltrato linfocitico con effatura della struttura. Infiltrati infiammatori simili sono osservati nelle ghiandole lacrimali superiori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig13large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="3">Metodo di iniezione</td>
			<td colspan="2">TMA, sec</td>
			<td colspan="2">Osmolalità lacrimale, Osm/L</td>
			<td colspan="2">STT, mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Linea</td>
			<td>Post-iniezione</td>
			<td>Linea</td>
			<td>Post-iniezione</td>
			<td>Linea</td>
			<td>Post-iniezione</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">media : SEM, variazione percentuale</td>
		</tr>
<tr>
<td>ILG senza guida usa gli Stati Uniti</td>
			<td rowspan="3">58,5 x 1,5</td>
			<td>44,5 x 7,7</td>
			<td rowspan="3">297 x 4,9</td>
			<td>300 x 3,8</td>
			<td rowspan="3">15,2 - 0,9</td>
			<td>12,9 x 2,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>%modifica</td>
			<td>-23%</td>
			<td>1%</td>
			<td>-15%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>P:0,05</td>
			<td>0,36 USD</td>
			<td>n. 0,21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Guida titolato dall'US - PSLG</td>
			<td rowspan="3">59,4 x 0,6</td>
			<td>11,4 x 4,2</td>
			<td rowspan="3">296 x 4,7</td>
			<td>326 x 3,7</td>
			<td rowspan="3">15,1 - 1,3</td>
			<td>10,7 - 1,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variazione percentuale</td>
			<td>-81%</td>
			<td>10%</td>
			<td>-29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p<0.0001</td>
			<td>p<0.0001</td>
			<td>p<0,03</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUIDAti dall'Stati Uniti ILG - PSLG - OSLG</td>
			<td rowspan="3">60 x 0,0</td>
			<td>6,2 - 1,3</td>
			<td rowspan="3">299 x 2,9</td>
			<td>309 x 2,8</td>
			<td rowspan="3">14,6 x 0,9</td>
			<td>9,9 x 1,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variazione percentuale</td>
			<td>-90%</td>
			<td>3%</td>
			<td>-32%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p<0.0001</td>
			<td>p<0.008</td>
			<td>p<0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">Tutti i valori sono stati misurati il giorno 6 dopo una singola iniezione di Con A nelle ghiandole elencate. Tutti i confronti sono stati effettuati con la linea di base. ILG, ghiandola lacrimale inferiore; PSLG, porzione palpebrale della ghiandola lacrimale superiore; OSLG, porzione orbitale della ghiandola lacrimale superiore; Stati Uniti, ultrasuoni.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Effetto della tecnica di iniezione e del numero di siti di iniezione sulla gravità dell'occhio secco.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Linea</td>
			<td>Giorno 6</td>
			<td>Giorno 13</td>
			<td>Giorno 21</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 iniezione</td>
			<td>2 iniezioni</td>
			<td>3 iniezioni</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMA, sec</td>
			<td rowspan="3">58,5 x 1,5</td>
			<td>44,5 x 7,7</td>
			<td>29,2 e 7,8</td>
			<td>12,8 - 3,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variazione percentuale</td>
			<td>-24%</td>
			<td>-50%</td>
			<td>-78%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,17 USD</td>
			<td>N.a. 0,001</td>
			<td>p<0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>TOsmo, Osm/L</td>
			<td rowspan="3">297 x 4,9</td>
			<td>300 x 3,9</td>
			<td>308 x 4,9</td>
			<td>313 x 2,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variazione percentuale</td>
			<td>1%</td>
			<td>4%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,36 USD</td>
			<td>P:0,04</td>
			<td>P.003</td>
		</tr>
<tr>
<td>STT, mm</td>
			<td rowspan="3">15,2 - 0,9</td>
			<td>9.3 - 1,6</td>
			<td>12,9 x 1,6</td>
			<td>7.4 - 1,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variazione percentuale</td>
			<td>-39%</td>
			<td>-15%</td>
			<td>-51%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,17 USD</td>
			<td>n. 0,13</td>
			<td>IMPOSSIBILe utilizzare il valore p.008</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Sono stati effettuati confronti con la linea di base.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Effetto delle ripetute iniezioni Di A in ILG sulla durata del DED.

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A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo per indurre la malattia dell'occhio secco acuta o cronica nei conigli iniettando il concavenavalin A a tutte le porzioni del sistema di ghiandola lacrimale orbitale. Questo metodo, superiore a quelli già segnalati, genera un modello riproducibile e stabile di occhio secco adatto allo studio degli agenti farmacologici.

Un modello di coniglio di malattia dell'occhio secco acquosa-decisa indotta da Concanavalin Un'iniezione nelle ghiandole lacrimali: applicazione agli studi sull'efficacia dei farmaci

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Il nostro metodo fornisce il modello animale affidabile mancante di malattia dell'occhio secco che può essere acuta o cronica grazie al nostro metodo di iniezione di tutte le ghiandole lacrimali e iniezioni ripetute. Questa tecnica fornisce in modo affidabile concanavalina A alla ghiandola lacrimale inferiore utilizzando una guida ecografica alle ghiandole di dimensioni ampiamente variabili e fino a ghiandole lacrimali superiori rendendo questo metodo un approccio completo. Questo modello fornisce un mezzo semplice, ottimizzato e non chirurgico per indurre malattie dell'occhio secco carenti di acque.È adatto per studiare l'efficacia del farmaco e la fisiopatologia della malattia. Identificare l'incisure posteriore e utilizzare la localizzazione degli ultrasuoni può essere difficile all'inizio. Rimuovere tutta la pelliccia è fondamentale per aiutare nella localizzazione degli ultrasuoni per entrambi questi passaggi.A dimostrare la procedura sarà Wei Huang, una studentessa laureata del mio laboratorio. Dopo aver confermato una lieve sedazione osservando una posizione della testa rilassata con i lobi dell'orecchio non più completamente eretti, utilizzare una micropipetta per applicare 25 microlitri di lidocaina priva di conservanti al primo occhio e posizionare uno speculum flessibile del coperchio del filo tra le palpebre. Usando 0,3 forcep, afferrare la membrana nictating al suo apice ed estenderla sulla cornea.Utilizzando un ago affilato calibro 26, iniettare lidocaina 1% con 1:100,000° epinefrina soggiogativamente nella base della membrana nictating. Un bleb moderato dovrebbe formarsi sulla membrana. Quindi rimuovere lo speculum e fare un'iniezione identica nella membrana nictating sinistra.Dopo circa cinque minuti, riposizionare lo speculum del coperchio nell'occhio e utilizzare 0,3 forcep per ritrarre la membrana nictating all'apice. Usando le forbici Westcott, tagliare la membrana nictating alla sua base e rimuovere lo speculum. Quindi mettere un unguento antibiotico topico sull'occhio.Per la porzionatura palpebrale dell'iniezione di ghiandola lacrimale superiore, dopo aver confermato la sedazione, tosare la pelliccia nell'area pre-orbitale e del cuoio capelluto e utilizzare la crema depilatoria per rimuovere completamente qualsiasi pelliccia residua. Dopo due minuti rimuovere la crema e applicare 25 microlitri di lidocaina priva di conservanti all'occhio appropriato. Esvertire la palpebra superiore e applicare una leggera pressione mediale sul bordo orbitale posteriore fino a quando non si vede la protuberanza che segna la porzione palpebrale della ghiandola.Utilizzando pinzette a denti fini e una siringa tubercolina dotata di un ago calibro 27, penetrare direttamente nella ghiandola attraverso un approccio transcongiuntivale che avanza l'ago di due millimetri nel tessuto e iniettare 100 microlitri di una soluzione da 500 microgrammi di Concanavalin A o Con A.Immediatamente dopo l'iniezione, applicare la pressione mediale sul globo per far sporgere la ghiandola lacrimale superiore orbitale dall'incisure posteriore. Utilizzando pini curvi chiusi, indentare l'area fino a quando l'apertura ossea nel cranio è sentita e applicare un'ulteriore pressione modesta con pini per lasciare un'indentazione nella pelle per fungere da punto di riferimento per il posizionamento dell'ago. Inserire una siringa tubercocina dotata di un ago da 27 calibro perpendicolare alla pelle sopra il segno di indentazione di circa un quarto di pollice nell'incisione e reindirizzare l'ago posteriormente ed esternamente verso il canthus laterale mirando al punto medio tra il sito di iniezione e il bordo orbitale osseo.Una volta raggiunto il mozzo dell'ago, iniettare lentamente 0,2 millilitri di una soluzione da 1.000 microgrammi di Con A.Per l'iniezione ILG, visualizzare l'animale dal lato per individuare la prominenza dell'ILG lungo la parte anteriore inferiore dell'orbita. Utilizzare una penna di marcatura chirurgica per disegnare una linea verticale sulla pelle in cui la parte superficiale della ghiandola ILG passa dal suo luogo di riposo superficiale sull'osso zigomatico alla sua posizione più mediale nell'orbita. Spazzare una sonda ad ultrasuoni tenuta verticalmente attraverso la linea sulla pelle per identificare l'estremità dell'osso zigomatico.La transizione ILG si verifica quando l'immagine della ghiandola passa da una linea iperecoica circoscritta a una senza un bordo mediale riconoscibile. La posizione relativa del manipolo rispetto alla linea tracciata sulla pelle quando si osserva questo cambiamento sarà il sito di iniezione. Per posizionare Con A in una ghiandola in un punto appena mediale all'osso dell'arco zigomatico, impostare la profondità di iniezione desiderata come profondità del segnale iperecoico osseo zigomatico più un millimetro meno la lunghezza nota dell'ago.Inserire l'ago di circa 12 millimetri nella ghiandola nel sito di iniezione prima di ritirarsi lentamente fino a quando la lunghezza dell'ago esposto all'esterno del corpo è uguale alla differenza calcolata. Quindi iniettare 0,2 millilitri di una soluzione Con A da 1.000 microgrammi e confermare il successo dell'iniezione tramite ultrasuoni. L'ILG dovrebbe mostrare uno spazio iperecoico caratteristico.Le iniezioni di Con A inducono una forte risposta infiammatoria nella ghiandola lacrimale caratterizzata da un denso infiltrato linfocitico che è accompagnato da una diminuzione della produzione lacrimale. I livelli di lattoferrina lacrimale vengono soppressi con conseguente epitelio corneale e congiuntivale compromesso e una maggiore colorazione del Bengala rosa. L'iniezione dei tre tessuti orbitali LG produce uno stato di malattia dell'occhio secco coerente e uniforme.Un singolo set di iniezioni di Con A produce malattie dell'occhio secco della durata di circa una settimana con tutti i parametri clinici che si normalizzano entro il giorno 10. Le iniezioni sequenziali di Con A a circa una settimana di distanza l'una dall'altra prolungano di conseguenza la durata della malattia dell'occhio secco. Dopo circa cinque serie di iniezioni, lo stato della malattia dell'occhio secco diventa spesso permanente senza la necessità di ulteriori iniezioni.La localizzazione ottimale delle strutture lacrimali delle ghiandole è la cosa più importante. La familiarità con l'anatomia cranale e l'attenzione ai dettagli fini, inclusa la rimozione della pelliccia insieme all'abilità con l'ecografia, migliorano tutti i risultati. Poiché questa tecnica semplice richiede l'uso di taglienti, l'indagine dovrebbe prendere le precauzioni appropriate per prevenire lesioni da puntura d'ago.

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