Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

يتم تمويل الدكتور بينتو من منحة البذور من كلية الطب بجامعة سانت لويس وصناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة سانت لويس. يتم تمويل الدكتور برين من قبل K22AI104794 جائزة المحقق المبكر من NIAID NIH، فضلا عن منحة البذور من مدرسة جامعة سانت لويس. وبالنسبة لجميع الأفراد الممولين، لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها.

وتتفق جميع إجراءات هذه الدراسة مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة سانت لويس. SLU معتمدة بالكامل من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبرات الدولية لرعاية الحيوانات (AAALAC).
1. عزل الأعضاء
ملاحظة: الفيروس غير مستقر في درجة...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

عدوى ZIKV يمكن أن يسبب مرض عصبي وبالتالي فإن النماذج الحيوانية الحالية لدراسة مسببات الأمراض، والاستجابات المناعية والفعالية الوقائية من اللقاحات ومضادات الفيروسات تحتاج إلى التركيز على السيطرة الفيروسية داخل الجهاز العصبي الوطني. أحد التحديات في التركيز على مرض الجهاز العصبي المركزي ه?...

فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس أربو ينتمي إلى عائلة فلافيريدي، والذي يتضمن مسببات الأمراض البشرية العصبية الغازية الهامة مثل فيروس بواسان (POWV)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)، وفيروس غرب النيل (WNV)1. بعد عزلها وتحديدها، كانت هناك تقارير دورية عن العدوىالبشرية ZIKV في أفريقيا وآسيا 2،3،4،5،والأوبئة داخل أمريكا الوسطى والجنوبية (استعرضت في المرجع6). ومع ذلك، لم يكن حتى وقت قريب أن ZIKV كان يعتقد أن يسبب مرض شديد7. الآن هناك الآلاف من حالات الأمراض العصبية والعيوب الخلقية المرتبطة بعدوى ZIKV. وقد أثار الظهور السريع لـ ZIKV العديد من الأسئلة المتعلقة بما يلي: لماذا هناك زيادة في شدة المرض، وما هي الاستجابة المناعية للعدوى ZIKV، وهناك أمراض فيروسية و/أو مناعية مرتبطة بزيادة في العصبية المظاهر والعيوب الخلقية. هناك الآن الاندفاع لفهم الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض ذات الصلة المرتبطة ZIKV، فضلا عن الحاجة إلى اختبار سريع لفعالية مضادات الفيروسات واللقاحات ضد ZIKV. وفي ظل هذه الخلفية، قمنا بتطوير أساليب للتحليل السريع لأجهزة التتيكون ZIKV في كل من المحيط والجهاز العصبي الكندي باستخدام تركيز خاص بـ ZIKV يشكل اختبارًا (FFA).
النماذج الحيوانية الصغيرة مهمة لفهم تطور المرض وللتقييم المبكر لللقاحات والعلاج ومضادات الفيروسات. لقد أنشأنا نماذج حيوانية صغيرة لدراسة مرض arbovirus باستخدام سلالات الماوس المختلفة لنموذج العدوى البشرية والحماية من مسببات الأمراض الفيروسية8،9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22. باستخدام هذه التجربة السابقة، بدأنا في تعديل التقنيات المستخدمة لتقييم فيروس WNV وحمى الضنك، وهو فيروس فلافي ذات الصلة لتقييم تيتر ZIKV في كل من الأجهزة الطرفية، فضلا عن الجهاز العصبي المركزي21،23، 24- ومزايا هذه الأساليب على الاختبارات الأخرى هي: (1) أنها تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء لأغراض التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل. 2) الطرق قابلة للتكيف لتدفق قياس الخلايا، لقياسات الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، جنبا إلى جنب مع titers الفيروسية على نفس الحيوان في نفس الجهاز؛ 3) تقنية الحصاد قابلة للتكيف للتحليل النسيجي؛ 4) وFFA ZIKV هو طريقة سرعة الإنتاجية عالية لتحليل التتر الفيروسية؛ و5) يمكن تطبيق هذه الأساليب على تقييم التيتفيات الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

وتبين الأساليب المعروضة الإجراءات المختبرية لعزل الأعضاء عن الحيوانات المصابة بفيروس زيكا والتحديد الكمي للحمولة الفيروسية. والغرض من هذا الإجراء هو قياس التلكرات الفيروسية في المناطق الطرفية والجهاز العصبي المركزي للماوس في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى أو في ظل ظروف تجريبية مختلفة لتحديد العوامل الفيرولوجية والمناعية التي تنظم عدوى فيروس زيكا. تسمح إجراءات عزل الأعضاء التي تم إظهارها لكل من التركيز على تشكيل القياس الكمي والتقييم الكمي لـ PCR للأجهزة التيتريافية. تم تصميم تقنيات عزل الأعضاء السريعة للحفاظ على جهاز نقل الفيروس. يسمح التحديد الكمي للبنفسمن من خلال التركيز على تشكيل اختبار تقييم الإنتاجية السريع لفيروس زيكا. وفائدة التركيز على تشكيل التقييم هي تقييم الفيروس المعدي، والحد من هذا التقييم هو احتمال سمية الأعضاء مما يقلل من حد الكشف. يتم الجمع بين تقييم التتر فيروسي مع PCR الكمي، ويتم تقييم استخدام نسخة الحمض النووي الريبي المؤتلف التحكم في عدد الجينوم الفيروسي داخل الجهاز مع الحد المنخفض للكشف. عموما هذه التقنيات توفر طريقة سرعة سرعة سرعة الإنتاجية لتحليل التوتير الفيروسية زيكا في محيط والجهاز العصبي المركزي للالحيوانات المصابة بفيروس زيكا ويمكن تطبيقها على تقييم titers الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس حمى الضنك.

لتقييم titers ZIKV باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه Ifnar1-/- تم إصابة الفئران مع ZIKV (PRVABC59) عن طريق حقن تحت الجلد (SC) إلى لوحة القدم. هنا، فإن إدارة 1 × 105 FFU من ZIKV إلى 8-12 أسبوع من العمر Ifnar1-/- الفئران SC ليست قاتلة ولكن الفيروس يمكن تكرارها في كل من محيط والج?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس

والهدف من البروتوكول هو إظهار التقنيات المستخدمة للتحقيق في الأمراض الفيروسية عن طريق عزل وقياس فيروس زيكا، من أجهزة متعددة في فأر ة بعد العدوى.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

في هذا الفيديو، نتصف مجموعة من الإجراءات المصممة لاستجواب تأثير العدوى الفيروسية والاستجابة المناعية الناتجة عن ذلك باستخدام نموذج مورين لعدوى زيكا. هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لنا بتطوير فهم ميكانيكي للعدوى والمناعة من خلال تحديد مدى انتشار الفيروس في جميع أنحاء الجسم ، والوصول إلى الحواجز المادية والوصول إلى الأنسجة. وتتيح هذه التقنيات فهماً مفصلاً للأمراض الفيروسية وتوفر القدرة على تشريح آلية الحماية التي توفرها اللقاحات أو العلاجات.هنا نبرهن على هذه الطريقة باستخدام فيروس زيكا عدوى الفئران، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة من العدوى الفيروسية بما في ذلك الفيروسات الفلافية الأخرى مثل فيروس حمى الضنك وفيروس ألفا مثل فيروس شيكونغونيا. حصاد أعضاء الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون تحديا، لذلك من المهم للشخص أن يخطط لتجربة صغيرة، وتكون على استعداد لممارسة التقنيات مسبقا. يسمح هذا البروتوكول بالتشريح السريع للانتشار الفيروسي داخل نماذج الحيوانات الصغيرة مع القدرة على تصور البيانات التجريبية والتقاطها وتخزينها.من المهم أن تظهر بصريا هذه الطريقة للسماح للمجرب لفهم كيفية حصاد أجهزة الجهاز العصبي المركزي. من المهم أيضًا رؤية مستوى التقاء الخلايا وشدة البؤر الفيروسية. للبدء، استخدم ملقط لإزالة قذف الماوس المصاب.قطع رأس الماوس مع مقص، تليها إزالة الذراعين والساقين. لحصاد الدماغ، استخدم مقص لا غرانج المسننة لقطع الجمجمة من خلال ماغنوم الهدّان. قشر قبالة الجمجمة مع ملقط، مغرفة من الدماغ مع ملعقة.باستخدام مقص حاد قوي، وإزالة العظام المحيطة العمود الفقري، ثم قطع عبر عظم الحوض لفضح الفقارية في مستوى القطنية. ثم، إزالة أكبر قدر ممكن من العضلات المحيطة العمود الفقري. بعناية، ضع طرف مشط من الإبرة داخل التجويف الفقري، وتجنب الضغط المفرط لمنع إبرة التعدي على الجسم الفقري.عقد بقوة لممارسة الضغط على الجسم الفقري والإبرة، واضغط على المكبس حقنة لطرد الحبل في طبق بتري. قم بنقل الحبل الشوكي في الأنبوب المسمى على الفور، ثم ضعه في حمام الثلج الجاف لمزيد من التجانس. من أجل التجانس، إضافة ملليلتر واحد من DMEM وتجانس العينة في BeadBeater.بعد التأكد من أن الأجهزة متجانسة، وأجهزة الطرد المركزي وعينات aliquot على الجليد وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الحاجة. في يوم الفحص ، قم بإزالة العينات المتجانسة من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية ، والسماح لهم بالذوبان. مع العينات على الجليد، وتمييع فيروس زيكا عشرة أضعاف في البئر الأولى من لوحة التخفيف واستخدام ماصة متعددة القنوات للقيام بتخفيفات المسلسل عشرة أضعاف أسفل لوحة، وتغيير النصائح في كل مرة.عن طريق إضافة 20 ميكرولترات من عينة إلى 180 ميكرولترات من وسائل الإعلام النمو، وتغيير نصائح ماصة بين كل تخفيف. إعداد لوحة تشكيل التركيز عن طريق إزالة وسائل الإعلام من أسفل مسطحة أعدت 96-جيدا لوحة تغطي فيروسيلس. لمنع monolayer من الجفاف ، على الفور إضافة 100 ميكرولترات من الفيروس تخفيف إلى كل بئر في viroplate.استخدم نفس مجموعة النصائح التي تضيفها من أدنى مستوى إلى أعلى تركيز. صخرة لوحة جانب إلى جانب مرتين إلى أربع مرات واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين. الاحماء 2٪ methylcellulose إلى درجة حرارة الغرفة.ثم، تمييع حل 2٪ ميثيلسيللوز في وسائل الإعلام النمو بنسبة 2 إلى واحد تقريبا. بعد الحضانة، إضافة 125 ميكرولترات من وسائط النمو ميثيل سيلولوز إلى كل بئر من لوحات 96-آبار. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 32 إلى 40 ساعة.لإصلاح فيروسيلس، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية إضافة 50 ميكرولترات من 5٪ شبهformaldehyde على الجزء العلوي من طبقة ميثيلسيلولوزي في كل بئر من لوحات 96-جيدا. احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، تغطية لوحات مع بارا فيلم ووضعها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة تراكب والوسائط قبالة الخلايا في حاوية المتاح داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. غسل بلطف مع 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني في البئر. إزالة برنامج تلفزيوني من لوحات وإزالة لوحة من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.كرر غسل PBS مرتين، ثم إضافة 150 ميكرولترات في بئر مرة واحدة غسل FFA العازلة وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق ل Permeabilize الخلايا الثابتة. بعد ذلك، استخدم الأجسام المضادة الأولية لزيكا للكشف عن العدوى. إعداد الأجسام المضادة الأولية 4G2 بتركيز من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في FFA تلطيخ العازلة.فليك FFA غسل العازلة من لوحات، وإضافة 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية في FFA تلطيخ العازلة إلى كل بئر. ثم ختم لوحات مع Parafilm، أو فيلم من البلاستيك، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إعداد الثانوية الذهاب المضادة للماوس HRP المسمى الأجسام المضادة بتركيز من واحد إلى 5،000 في FFA تلطيخ العازلة.بعد إزالة حل الأجسام المضادة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 150 microliters FFA غسل العازلة في بئر. إزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق الخفقان في بالوعة في كل مرة. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية في FFA تلطيخ العازلة في 50 ميكرولترات في البئر واحتضان ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع تخزين مؤقت غسل FFA، مرة أخرى، وإزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق الخفق في الحوض في كل مرة. إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة تروبلو في كل بئر. انتظر دقيقتين إلى 15 دقيقة حتى يتم تعريف البقع بشكل كامل مع الحد الأدنى من الخلفية.بعد البقع مرئية، وغسل بلطف بالماء باستخدام يد لحماية monolayer من قوة المياه الجارية. انقر فوق الجافة على المناشف الورقية. بعد فترة وجيزة، استخدم نطاق تشريح لحساب يدويا البقع في كل بئر، أو استخدام عداد بقعة الآلي.في برنامج "مناعي كابتور"، حدد تخفيف مع بؤر مميزة بسهولة بين 20 إلى 200 لكل بئر لكل عينة وحساب تيتر في وحدات تشكيل التركيز لكل ملليمتر باستخدام متوسط الآبار المكررة. في هذه التجربة، تم عرض العبء الفيروسي في أنسجة الجهاز العصبي المحيطي والمركزي بعد أن أعطيت فئران إيفنار فيروس زيكا تحت الجلد. وكان حد الكشف بين 100 إلى 500 FFU لكل غرام، على أساس الجهاز.عند إجراء فحص التركيز على تشكيل، يمكن أن تؤدي الأخطاء الفنية إلى نتائج دون المستوى الأمثل. سمية الأعضاء، مدفوعة بتركيز عال من الكبد، غيرت حساسية الفحص. عندما كان titer الفيروسية في الجهاز أقل من السمية، وFFA لا يمكن أن تسجل بدقة titers الفيروسية.أظهرت خلايا الكلى السمية مع تركيز عال للأعضاء ولكن تم التغلب عليها من قبل titer الفيروسية في تركيزات الأعضاء المنخفضة. يمكن أن يؤدي الخفقان القوي أو الغسيل إلى إزالة الطبقة الأحادية ، مما يؤدي إلى فقدان البيانات غير الدقيقة في الإبلاغ عن نتائج titer. الألياف أو الشعر الموجودة في ورقة ماصة مقاعد البدلاء المختبر، يمكن أن تلوث الآبار الفردية وتسبب أخطاء كبيرة إذا باستخدام برنامج العد الآلي.كثافة الخلية هي قضية أخرى ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نجاح فحص التركيز على تشكيل. وأظهرت الخلايا في ما يقرب من 60٪ التقاء في بداية الفحص، مقارنة بالخلايا مطلية في 90٪، فرق كبير يؤثر على فحص التركيز تشكيل. تخطيط حجم ونطاق التجربة بحيث يتم الانتهاء من حصاد الأعضاء بكفاءة، هو الجزء الأكثر أهمية من الإجراء، يليها بدء اختبار التركيز مع خلايا ذات جودة عالية.وقد استخدم هذا الإجراء لتحديد كمية الفيروس للأسر الفيروسية المتعددة. ويمكن أيضا أن تتكيف مع هذا البروتوكول لفحص المركبات العلاجية وتحديد الإبطال الأجسام المضادة. وتستخدم هذه التقنيات في كميات الفيروس الحي وينبغي اتخاذ خطوات السلامة المناسبة وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...