Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Dr. Pinto er finansieret af et frø tilskud fra Saint Louis University School of Medicine og Startup midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansieret af en K22AI104794 tidlig investigator Award fra NIH NIAID samt et frø Grant fra Saint Louis University School. For alle finansierede individer havde finansieringskilderne ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om offentliggørelse eller forberedelse af manuskriptet.

Alle procedurer i denne undersøgelse er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af St. Louis University Animal Care og use udvalget. SLU er fuldt akkrediteret af foreningen for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. organ isolation
Bemærk: Virusset er ikke stabilt ved stuetemperatur (RT), så antallet af dyr, der høstes på én gang, skal planlægges omhyggeligt for at bevare viral titre.<...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV infektion kan forårsage en neurologisk sygdom derfor de nuværende dyremodeller til at studere patogenesen, immunrespons og beskyttende effekt af vacciner og antivirale lægemidler skal fokusere på viral kontrol inden for CNS. En af udfordringerne i at fokusere på CNS sygdom er, at det ofte kommer på bekostning af at studere perifer infektion. De organ isolations metoder, der foreslås her, fokuserer på behovet for hurtigt at evaluere ZIKV-infektion i både periferien og CNS med henblik på at vurdere CNS-medie...

Zika virus (ZIKV) er en arbovirus, der tilhører Flaviviridae familien, som omfatter vigtige Neuroinvasive humane patogener såsom Powassan virus (POWV), japansk encephalitis virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Efter isolering og identifikation har der været periodiske rapporter om humane zikv-infektioner i Afrika og Asien2,3,4,5og epidemier i Central-og Sydamerika (gennemgået i reference6). Men, det var først for nylig, at ZIKV blev anset for at forårsage svær sygdom7. Nu er der tusindvis af tilfælde af neurologiske sygdomme og fødselsdefekter forbundet med ZIKV infektioner. Den hurtige opståen af ZIKV har foranlediget mange spørgsmål vedrørende: hvorfor der er en stigning i sygdommens sværhedsgrad, hvad er den immunologiske reaktion på ZIKV infektion og er der virale og/eller immunmedierede patologier forbundet med stigningen i neurologiske manifestationer og fødselsdefekter. Der er nu et kapløb om at forstå det centrale nervesystem (CNS) relaterede sygdom forbundet med ZIKV samt behovet for hurtigt at teste effekten af antivirale lægemidler og vacciner mod ZIKV. Det er på denne baggrund, at vi har udviklet metoder til hurtig analyse af ZIKV titre i både periferien og CNS ved hjælp af en ZIKV-specifikke fokus danner assays (FFA).
Små dyremodeller er vigtige for at forstå sygdomsprogression og for tidlig evaluering af vacciner, terapi og antivirale lægemidler. Vi har etableret små dyremodeller til studiet af arbovirus sygdom ved hjælp af forskellige muse stammer til at modellere menneskelig infektion og beskyttelse mod virale patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjælp af denne tidligere erfaring, vi begyndte at ændre teknikker, der anvendes til vurdering af wnv og dengue virus, en beslægtet flavivirus til vurdering af zikv titer i begge perifere organer samt CNS21,23, 24. fordelene ved disse metoder frem for andre assays er: 1) at de kombinerer evnen til at høste både perifere og CNS organer til analysen; 2) metoderne er tilpasningsdygtige for strømnings cytometri, for målinger af medfødte og adaptive immunrespons, sammen med virale titre på samme dyr i samme organ; 3) høst teknikken er tilpasningsdygtig til histologisk analyse; 4) ZIKV FFA er en hurtig høj gennemløb metode til viral titer analyse; og 5) disse metoder kan anvendes til vurdering af viral titre i organerne af dyr inficeret med de fleste patogener25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

De metoder, der fremlægges, viser laboratorieprocedurer for isolering af organer fra Zikavirus inficerede dyr og kvantificering af virusbelastningen. Formålet med proceduren er at kvantificere virale titre i perifere og CNS-områder af musen på forskellige tidspunkter efter infektion eller under forskellige eksperimentelle betingelser for at identificere virologiske og immunologiske faktorer, der regulerer Zikavirus infektion. De viste organ isolations procedurer muliggør både kvantificering af fokus dannelse og kvantitativ PCR-vurdering af virale titre. De hurtige organ isolering teknikker er designet til bevarelse af virus titer. Viral titer kvantificering af fokus danner assay giver mulighed for hurtig gennemstrømning vurdering af Zikavirus. Fordelen ved den fokus dannende analyse er vurderingen af infektiøs virus, begrænsningen af denne analyse er potentialet for organtoksicitet, der nedsætter detektionsgrænsen. Viral titer vurdering kombineres med kvantitativ PCR, og ved hjælp af en rekombinant RNA kopi kontrol viral genom kopi nummer i organet er vurderet med lav detektionsgrænse. Samlet set giver disse teknikker en nøjagtig hurtig høj gennemløbs metode til analyse af zikaviviral titre i periferien og CNS hos zikavirus inficerede dyr og kan anvendes til vurdering af virale titre i organerne hos dyr, der er inficeret med de fleste patogener, herunder Denguevirus.

For at evaluere zikv titre ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor Ifnar1-/- mus blev inficeret med zikv (PRVABC59) via subkutan (SC) injektion til fodpuden. Her administration af 1 x 105 FFU af zikv til 8-12 uge gamle Ifnar1-/- mus SC er ikke dødelig, men virussen kan replikere i både periferien og CNS. Denne dosis og rute anvendes til at studere vært patogen immunrespons og patogenicitet. Administration af 1 x 105 FFU...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering og kvantificering af Zikavirus fra flere organer i en mus

Målet med protokollen er at demonstrere de teknikker, der anvendes til at undersøge virussygdom ved at isolere og kvantificere Zikavirus, fra flere organer i en mus efter infektion.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

I denne video beskriver vi et sæt procedurer designet til at afhøre virkningen af en virusinfektion og den deraf følgende immunologiske respons ved hjælp af en Murine model af Zika infektion. Denne protokol er vigtig, fordi den giver os mulighed for at udvikle en mekanistisk forståelse af infektion og immunitet ved at identificere, i hvilket omfang en virus har spredt sig over hele kroppen, tværgående fysiske barrierer og adgang til væv. Disse teknikker giver mulighed for en detaljeret forståelse af viral patogenese og giver mulighed for at dissekere mekanismen for beskyttelse, som vacciner eller terapi.Her demonstrerer vi denne metode ved hjælp af Zika virus infektion af mus, men denne metode kan anvendes på en række virusinfektioner, herunder andre flaviviruses som Dengue virus og alfavira som Chikungunya virus. Høst organer i centralnervesystemet kan være udfordrende, så det er vigtigt for en person at planlægge et lille eksperiment, og være parat til at praktisere de teknikker på forhånd. Denne protokol giver mulighed for hurtig dissektion af viral spredning i små dyremodeller med evnen til at visualisere, fange og lagre eksperimentelle data.Det er vigtigt visuelt at demonstrere denne metode for at give eksperimentatoren mulighed for at forstå, hvordan man høster centralnervesystemets organer. Det er også vigtigt at se niveauet af celle sammenløb og intensiteten af den virale foci. Til at begynde, skal du bruge krafterne til at fjerne pelsen af den inficerede mus.Halshugge hovedet af musen med en saks, efterfulgt af fjernelse af arme og ben. At høste hjernen, bruge savtakkede La Grange saks til at skære kraniet gennem foramen magnum. Skræl kraniet med kraftvuk, og scoop ud hjernen med en spatel.Ved hjælp af stærk afstumpet saks, fjerne knoglen omkring rygsøjlen, derefter skæres over bækkenbenet at udsætte vertebrale foramen på lændeniveau. Derefter fjerne så meget muskel som muligt omkring rygsøjlen. Forsigtigt, placere den affasede spids af nålen inde i vertebrale foramen, undgå overdrevent tryk for at forhindre nålen indtrængen rygsøjlen kroppen.Hold kraftigt nede for at lægge pres på rygsøjlen og nålen, og tryk sprøjtestempelet for at udvise ledningen i petriskålen. Straks overføre rygmarven i det mærkede rør, og sted i tørisbad for yderligere homogenisering. Til homogenisering tilsættes en milliliter DMEM, og prøven homogeniseres i en BeadBeater.Efter at have sikret organer er homogeniseret, centrifuge og aliquot prøver på is og opbevares i minus 80 grader Celsius indtil det er nødvendigt. På analysedagen fjernes de homogeniserede prøver fra minus 80 grader Celsius-fryseren, og de kan tø op. Med prøverne på is fortyndes Zika-virus tigange i fortyndingspladens første brønd, og brug en flerkanalpipette til at udføre tifolde serielle fortyndinger ned ad pladen og skifte spidser hver gang.Ved at tilføje 20 mikroliter af prøven i 180 mikroliter af vækstmedier, skal du ændre pipettespidserne mellem hver fortynding. Forbered fokusdannende plade ved at fjerne medierne fra den forberedte flade bund 96-brønd plade, der dækker virocells. For at forhindre monolaget i at tørre ud, straks tilføje 100 mikroliter af virus fortynding til hver brønd i viroplate.Brug det samme sæt tips til at tilføje fra den laveste til den højeste koncentration. Rock plade side til side to til fire gange og inkubere ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i en til to timer. Varm op 2% methylcellulose til stuetemperatur.Derefter fortyndes 2%methylcellulose opløsning i vækstmedier med et forhold på ca. to til en. Efter inkubation, tilsæt 125 mikroliter af methylcellulose vækstmedier til hver brønd af de 96-brønd plader. Inkubere igen ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 32 til 40 timer.For at fastsætte virocells, i en biosikkerhed kabinet tilføje 50 mikroliter af 5% paraformaldehyd over toppen af methylcellulose lag i hver brønd af 96-brønd plader. Inkuber i 60 minutter ved stuetemperatur. Alternativt kan du dække pladerne med Parafilm og placere dem på fire grader Celsius natten over.Derefter skal du bruge en pipette til at fjerne overlejring og medier fra celler i en engangsbeholder inde i biosikkerhedsskabet. Vask forsigtigt med 150 mikroliter PBS pr. brønd. Fjern PBS fra pladerne, og fjern pladen fra biosikkerhedsskabet.Gentag PBS vask to gange, derefter tilføje 150 mikroliter pr godt en gange FFA vask buffer og lad ved stuetemperatur i fem til 10 minutter at permeabilize de faste celler. Dernæst skal du bruge primært Zika antistof til at opdage infektion. Forbered det primære antistof 4G2 ved en koncentration på et mikrogram pr. milliliter i FFA-farvningsbufferen.Flick FFA vask buffer fra pladerne, og tilsæt 50 mikroliter af det primære antistof i FFA farvning buffer til hver brønd. Derefter forsegle pladerne med Parafilm, eller plastfilm, og inkubere natten over ved fire grader Celsius. Forbered den sekundære gå anti-mus HRP mærket antistof ved en koncentration på en til 5, 000 i FFA farvning buffer.Efter fjernelse af antistofopløsningen vaskes cellerne tre gange med 150 mikroliter FFA vaskebuffer pr. brønd. Fjern vaskebufferen ved at svippe ind i vasken hver gang. Plet cellerne med det sekundære antistof i FFA farvning buffer på 50 mikroliter pr brønd og inkubere en til to timer ved stuetemperatur.Efter at vaske celler tre gange med FFA vask buffer, igen, fjerne vask buffer ved at svippe ind i vasken hver gang. Tilføj 50 mikroliter af TrueBlue-substratet i hver brønd. Vent to til 15 minutter, indtil pletterne er fuldt defineret med minimal baggrund.Når pletterne er synlige, vaskes forsigtigt med vand ved hjælp af en hånd for at beskytte monolaget mod kraften i vandet, der løber. Tryk tør på papirservietter. Kort tid efter skal du bruge et dissekereområde til manuelt at tælle pletterne i hver brønd eller bruge en automatiseret spottæller.I ImmunoCapture software, skal du vælge en fortynding med let skelnes foci mellem 20 til 200 per brønd for hver prøve og beregne titer i fokusdannende enheder per millimeter ved hjælp af gennemsnittet af dublerede brønde. I dette eksperiment blev virusbyrden vist i det perifere væv og væv i centralnervesystemet, efter at Ifnar-mus fik zikavirus subkutaneligt. Grænsen for påvisning var mellem 100 til 500 FFU pr. gram, baseret på orgel.Når du udfører fokusdannende analyse, kan tekniske fejl resultere i suboptimale resultater. Organtoksicitet, drevet af høj koncentration af leveren, ændrede følsomheden af analysen. Når den virale titer i orglet var lavere end toksiciteten, kunne FFA ikke præcist registrere de virale titere.Nyreceller illustreret toksicitet med høj organkoncentration, men blev overvundet af den virale titer ved lave organkoncentrationer. Kraftig pipettering eller vask kan fjerne monolaget, hvilket fører til mistede data unøjagtig rapportering af titer resultater. Fibre eller hår, der er til stede i lab bænk absorberende papir, kan forurene individuelle brønde og forårsage betydelige fejl, hvis du bruger en automatiseret optælling program.Celletæthed er et andet spørgsmål, som dramatisk kan påvirke succesen af en fokusdannende analyse. Celler ved ca 60% sammenløb i starten af analysen, sammenlignet med celler belagt med 90% sammenløb, viste dramatisk forskel påvirker fokusdannende analyse. Planlægning af eksperimentets størrelse og omfang, således at organhøsten gennemføres effektivt, er den vigtigste del af proceduren, efterfulgt af at starte den fokusdannende analyse med celler af høj kvalitet.Denne procedure er blevet brugt til at kvantificere virus for flere virale familier. Denne protokol kan også tilpasses til skærmen for terapeutiske forbindelser og kvantificere neutraliserende antistof titere. Disse teknikker anvendes til at kvantere levende virus, og der bør træffes passende sikkerhedsforanstaltninger i overensstemmelse med retningslinjerne i BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering af lymfocytter fra Mouse Genital Tract mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influenza A-virus Detection og Isolering fra svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og<em&gt; In vitro</em&gt; Profylaktiske virkning af interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redning og karakterisering af rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus infektiøs klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus specifikke diagnostiske epitop opdagelse

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En simpel flowcytometri baseret analyse for at bestemme In Vitro antistof afhængig af forbedring af Dengue Virus ved hjælp af Zika Virus rekreationshjem Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluering af Zika Virus-specifikke T-celle respons i Immunoprivileged organer af inficerede Ifnar1- / - mus

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantificeringen af antistof-afhængige Enhancement Zika virus i primære humane celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...