Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Dr. Pinto wordt gefinancierd door een Seed Grant van de Saint Louis University School of Medicine en Startup funds van de Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien wordt gefinancierd door een K22AI104794 Early Investigator Award van de NIH NIAID en een Seed Grant van de University School van Saint Louis. Voor alle gefinancierde individuen hadden de financiers geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

Alle procedures van de huidige studie zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Dierenzorg-en gebruiks Comité van de St. Louis University. SLU is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. orgaan isolatie
Opmerking: Het virus is niet stabiel bij kamertemperatuur (RT), dus het aantal dieren dat in één keer is geoogst, moet zorgvuld...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV infectie kan leiden tot een neurologische aandoening dus de huidige diermodellen om pathogenese te bestuderen, immuunresponsen en beschermende werkzaamheid van vaccins en antivirale middelen moeten zich richten op virale controle binnen het CZS. Een van de uitdagingen bij het concentreren op de ziekte van CNS is dat het vaak ten koste gaat van het bestuderen van perifere infectie. De orgel isolatie methoden die hier worden voorgesteld, zijn gericht op de noodzaak om de ZIKV-infectie in zowel de periferie als het CZS...

Zika virus (zikv) is een Arbovirus dat behoort tot de familie van de virussen, die belangrijke neuroinvasieve menselijke pathogenen zoals Powassan virus (powv), Japanse encefalitis virus (JEV) en West Nile Virus (WNV)1bevat. Na de isolatie en identificatie zijn er periodieke meldingen geweest van menselijke zikv-infecties in Afrika en Azië2,3,4,5en epidemieën in Midden-en Zuid-Amerika (beoordeeld in Referentie6). Echter, het was niet tot voor kort dat ZIKV werd gedacht te veroorzaken ernstige ziekte7. Nu zijn er duizenden gevallen van neurologische aandoeningen en aangeboren afwijkingen gekoppeld aan ZIKV infecties. De snelle opkomst van ZIKV heeft veel vragen met betrekking tot: Waarom is er een toename van de ernst van de ziekte, wat is de immunologische respons op ZIKV infectie en zijn er virale en/of immuun gemedieerde pathologieën gekoppeld aan de toename van neurologische manifestaties en aangeboren afwijkingen. Er is nu een haast om te begrijpen het centraal zenuwstelsel (CNS) gerelateerde ziekte geassocieerd met ZIKV, alsmede de noodzaak om snel de werkzaamheid van de antivirale middelen en vaccins tegen ZIKV testen. Tegen deze achtergrond hebben we methoden ontwikkeld voor de snelle analyse van ZIKV-Antilichaamtiters in zowel de periferie als het CZS met behulp van een ZIKV-specifieke focus vormende assays (FFA).
Kleine diermodellen zijn belangrijk voor het begrijpen van ziekteprogressie en voor de vroege evaluatie van vaccins, Therapeutics en anti-Virals. We hebben kleine diermodellen vastgesteld voor de studie van de ziekte van Arbovirus door het gebruik van verschillende muis stammen om menselijke infectie te modelleren en bescherming tegen virale pathogenen8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Met behulp van deze eerdere ervaring, begonnen we met het wijzigen van technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van WNV en Denguevirus, een verwant Flavivirus voor de beoordeling van zikv titer in zowel perifere organen als de CNS21,23, 24. de voordelen van deze methoden ten opzichte van andere assays zijn: 1) dat zij het vermogen om zowel perifere als CNS organen te oogsten voor de analyse combineren; 2) de methoden zijn aanpasbaar voor flow cytometrie, voor metingen van aangeboren en adaptieve immuunresponsen, samen met virale Antilichaamtiters op hetzelfde dier in hetzelfde orgaan; 3) de oogsttechniek is aanpasbaar voor histologische analyse; 4) de ZIKV FFA is een snelle hoge doorvoer methode voor virale titer analyse; en 5) deze methoden kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die besmet zijn met de meeste pathogenen25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

De gepresenteerde methoden tonen laboratorium procedures voor de isolatie van organen van besmette dieren van het Zikavirus en de kwantificering van de virale belasting. Het doel van de procedure is het kwantificeren van virale Antilichaamtiters in perifere en CZS-gebieden van de muis op verschillende tijdstippen na infectie of onder verschillende experimentele omstandigheden om virologische en immunologische factoren te identificeren die de Zikavirus infectie reguleren. De orgel isolatie procedures laten zien dat zowel de bepaling van de focus vormende assay als de kwantitatieve PCR-beoordeling van virale titers mogelijk is. De snelle orgel isolatietechnieken zijn ontworpen voor het behoud van de virus titer. Virale titer kwantificering door focus vormende assay zorgt voor de snelle doorvoer beoordeling van het Zikavirus. Het voordeel van de focus vormende assay is de beoordeling van infectieuze virus, de beperking van deze test is het potentieel voor orgaantoxiciteit vermindering van de aantoonbaarheidsgrens. Virale titer beoordeling wordt gecombineerd met kwantitatieve PCR, en met behulp van een recombinant RNA kopie controle virale genoom kopie nummer binnen het orgel wordt beoordeeld met lage aantoonbaarheidsgrens. Over het algemeen bieden deze technieken een nauwkeurige snelle hoge doorvoer methode voor de analyse van Zika-virale Antilichaamtiters in de periferie en CNS van besmette dieren van het zikavirus en kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die zijn geïnfecteerd met de meeste pathogenen, waaronder Denguevirus.

Om zikv Antilichaamtiters te evalueren met behulp van het hierboven beschreven protocol Ifnar1-/- muizen zijn geïnfecteerd met zikv (PRVABC59) via subcutane (SC) injectie op het voetpad. Hier, de administratie van 1 x 105 FFU van zikv tot 8-12 week oude Ifnar1-/- muizen SC is niet dodelijk, maar het virus kan repliceren in zowel de periferie en CNS. Deze dosis en route worden gebruikt om gastheer pathogeen immuunresponsen en pathogenite...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In deze video beschrijven we een reeks procedures die zijn ontworpen om de impact van een virale infectie en de daaruit voortvloeiende immunologische respons te ondervragen met behulp van een Murine-model van Zika-infectie. Dit protocol is belangrijk omdat het ons in staat stelt om een mechanistisch begrip van infectie en immuniteit te ontwikkelen door te bepalen in hoeverre een virus zich door het hele lichaam heeft verspreid, fysieke barrières omvormt en toegang heeft tot weefsels. Deze technieken maken een gedetailleerd begrip van virale pathogenese mogelijk en bieden de mogelijkheid om het beschermingsmechanisme van vaccins of therapieën te ontleden.Hier tonen we deze methode met behulp van Zika virus infectie van muizen, maar deze methode kan worden toegepast op een scala van virale infecties, waaronder andere flavivirussen zoals Dengue virus en alfavirussen zoals Chikungunya virus. Het oogsten van de organen van het centrale zenuwstelsel kan een uitdaging zijn, dus het is belangrijk voor een persoon om een klein experiment te plannen en bereid te zijn om de technieken vooraf te oefenen. Dit protocol zorgt voor de snelle dissectie van virale verspreiding binnen kleine diermodellen met de mogelijkheid om experimentele gegevens te visualiseren, vast te leggen en op te slaan.Het is belangrijk om deze methode visueel aan te tonen, zodat de onderzoeker kan begrijpen hoe de organen van het centrale zenuwstelsel te oogsten. Het is ook belangrijk om het niveau van cel samenvloeiing en de intensiteit van de virale foci te zien. Gebruik om te beginnen met tangen om de pels van de geïnfecteerde muis te verwijderen.Onthoofd het hoofd van de muis met een schaar, gevolgd door het verwijderen van de armen en benen. Om de hersenen te oogsten, gebruik gekartelde La Grange schaar om de schedel door de foramen magnum te snijden. Pel de schedel af met tangen en schep de hersenen eruit met een spatel.Met behulp van sterke afgestompte schaar, verwijder het bot rond de wervelkolom, dan snijd over het bekken om de wervel foramen bloot op het niveau van de lendenen. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk spieren rond de wervelkolom. Plaats voorzichtig de schuine punt van de naald in de wervelstipamen, vermijd overmatige druk om te voorkomen dat de naald het wervellichaam overtreedt.Houd sterk om druk uit te oefenen op het wervellichaam en de naald, en druk op de spuitzuiger om het koord in de petrischaal te verdrijven. Breng het ruggenmerg onmiddellijk over in de gelabelde buis en plaats in het droogijsbad voor verdere homogenisatie. Voor homogenisatie, voeg een milliliter DMEM en homogeniseren het monster in een BeadBeater.Na ervoor te zorgen organen worden gehomogeniseerd, centrifuge en aliquot monsters op ijs en op te slaan in de min 80 graden Celsius totdat dat nodig is. Op de dag van de test, verwijder de gehomogeniseerde monsters uit de min 80 graden Celsius vriezer, en laat ze ontdooien. Met de monsters op ijs verdunnen Zika virus vertienvoudigd in de eerste put van de verdunningsplaat en gebruik een multichannel pipet om tienvoudige seriële verdunningen van de plaat te doen, waarbij telkens tips worden gewijzigd.Door het toevoegen van 20 microliter van het monster in 180 microliters van groeimedia, veranderen pipet tips tussen elke verdunning. Bereid de focusvormingsplaat voor door de media uit de voorbereide platte bodem 96-putplaat te verwijderen die virocells bedekt. Om te voorkomen dat de monolaag uitdroogt, voegt u onmiddellijk 100 microliter van de virusverdunning toe aan elke put in de viroplate.Gebruik dezelfde set tips om toe te voegen van de laagste naar de hoogste concentratie. Rotsplaat van links naar rechts twee tot vier keer en incubeer bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende een tot twee uur. Warm 2%methylcellulose op tot kamertemperatuur.Verdun vervolgens de 2%methylcelluloseoplossing in groeimedia bij een verhouding van ongeveer twee tegen één. Voeg na incubatie 125 microliter van de methylcellulose groeimedia toe aan elke put van de 96-putplaten. Incubeer opnieuw bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 32 tot 40 uur.Om de virocells te repareren, voeg in een bioveiligheidskast 50 microliter van 5% paraformaldehyde toe over de bovenkant van de methylcelluloselaag in elke put van de 96-putplaten. Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. U ook de platen bedekken met Parafilm en ze 's nachts op vier graden Celsius plaatsen.Gebruik daarna een pipet om overlay en media uit cellen te verwijderen in een wegwerpcontainer in de bioveiligheidskast. Was voorzichtig met 150 microliter PBS per put. Haal PBS van de platen en verwijder de plaat uit de bioveiligheidskast.Herhaal de PBS wassen tweemaal, voeg dan 150 microliters per put een keer FFA wasbuffer en laat op kamertemperatuur gedurende vijf tot 10 minuten om de vaste cellen te permeabiliseren. Gebruik vervolgens primair Zika-antilichaam om infectie op te sporen. Bereid het primaire antilichaam 4G2 voor met een concentratie van één microgram per milliliter in FFA-kleuringsbuffer.Flick FFA wasbuffer van de platen, en voeg 50 microliters van het primaire antilichaam in FFA kleuring buffer aan elke put. Sluit vervolgens de platen af met Parafilm, of plastic folie, en broed 's nachts uit op vier graden Celsius. Bereid de secundaire go anti-muis HRP gelabeld antilichaam bij een concentratie van een tot 5.000 in FFA kleuring buffer.Na het verwijderen van de antilichaamoplossing, was cellen drie keer met 150 microliters FFA wasbuffer per put. Verwijder de wasbuffer door telkens in de gootsteen te vegen. Bevlek de cellen met het secundaire antilichaam in FFA-kleuringsbuffer bij 50 microliters per put en broed één tot twee uur bij kamertemperatuur uit.Daarna, cellen wassen drie keer met FFA wasbuffer, nogmaals, het verwijderen van de wasbuffer door flicking in de gootsteen elke keer. Voeg 50 microliter van het TrueBlue Substraat toe aan elke put. Wacht twee tot 15 minuten tot de vlekken volledig zijn gedefinieerd met een minimale achtergrond.Nadat de vlekken zichtbaar zijn, was voorzichtig met water met behulp van een hand om de monolaag te beschermen tegen de kracht van het stromende water. Tik droog op papieren handdoeken. Kort daarna, gebruik maken van een ontleden bereik om handmatig te tellen van de vlekken in elke put, of gebruik een geautomatiseerde spot teller.Selecteer in de ImmunoCapture-software een verdunning met gemakkelijk te onderscheiden foci tussen 20 tot 200 per put voor elk monster en bereken titer in focusvormende eenheden per millimeter met behulp van het gemiddelde van dubbele putten. In dit experiment, virale last werd getoond in de perifere en centrale zenuwstelsel weefsels na Ifnar muizen werden gegeven Zika virus onderhuids. De detectiegrens lag tussen de 100 en 500 FFU per gram, gebaseerd op orgel.Bij het uitvoeren van de focusvormende test kunnen technische fouten leiden tot suboptimale resultaten. Orgaantoxiciteit, gedreven door een hoge concentratie van de lever, veranderde de gevoeligheid van de test. Toen de virale titer in het orgaan lager was dan de toxiciteit, kon de FFA de virale titers niet nauwkeurig registreren.Niercellen illustreerden toxiciteit met een hoge orgaanconcentratie, maar werden overwonnen door de virale titer bij lage orgaanconcentraties. Krachtige pipetting of wassen kan de monolaag verwijderen, wat leidt tot verloren gegevens onjuiste rapportage van titer resultaten. Vezels of haren die aanwezig zijn in lab bank absorberend papier, kan besmetten individuele putten en veroorzaken aanzienlijke fouten bij het gebruik van een geautomatiseerd tellen programma.Celdichtheid is een ander probleem, dat het succes van een focusvormende test drastisch kan beïnvloeden. Cellen bij ongeveer 60%-samenvloeiing aan het begin van de test, vergeleken met cellen verguld met 90%-samenvloeiing, vertoonden een dramatisch verschil dat van invloed was op de focusvormingstest. Het plannen van de omvang en omvang van het experiment, zodat de orgaanoogst efficiënt wordt voltooid, is het belangrijkste onderdeel van de procedure, gevolgd door het starten van de focusvormende test met cellen van hoge kwaliteit.Deze procedure is gebruikt om het virus te kwantificeren voor meerdere virale families. Dit protocol kan ook worden aangepast aan het scherm voor therapeutische verbindingen en neutraliseren neutraliseren antilichaam titers. Deze technieken worden gebruikt om levend virus te kwantificeren en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen volgens de richtlijnen van de BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...