Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

ד ר פינטו ממומנת על ידי מענק זרע מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה וכספים אתחול מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה. ד ר Brien ממומן על ידי פרס החוקר המוקדם K22AI104794 מ-NIH NIAID כמו גם מענק זרע מבית הספר סנט לואיס אוניברסיטת. לכל האנשים הממומנים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

כל ההליכים של המחקר הנוכחי הם בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סנט לואיס. מחש הוא מוכר לחלוטין על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים המעבדה הבינלאומי (AAALAC).
1. בידוד איברים
הערה: הווירוס אינו יציב בטמפרטורת ה?...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

זיהום zikv יכול לגרום למחלה נוירולוגית ולכן מודלים בעלי חיים הנוכחי כדי ללמוד פתוגנזה, תגובות החיסון ויעילות הגנה של חיסונים נוגדנים צריך להתמקד בשליטה ויראלי בתוך ה-cn. אחד האתגרים בהתמקדות במחלת ה-CN הוא כי לעתים קרובות מגיע על חשבון לימוד זיהום היקפי. שיטות בידוד האיברים המוצעים כאן מתמקד ?...

וירוס zika (zika) הוא מועבר השייכת המשפחה הפלחיות, אשר כולל פתוגנים אנושיים האנושית חשוב כגון powassan וירוס (powv), וירוס המוח היפני (jev), ומערב הנילוס וירוס (wnv)1. בעקבות בידוד וזיהוי, היו דיווחים תקופתיים על זיהומים zikv האדם באפריקה ואסיה2,3,4,5, ו מגיפות בתוך מרכז ודרום אמריקה (נבדקו ב הפניה6). עם זאת, לא היה עד לאחרונה כי ZIKV נחשב לגרום למחלה חמורה7. עכשיו יש אלפי מקרים של מחלות נוירולוגיות ופגמים בלידה מקושרים עם זיהומים ZIKV. הופעתה המהירה של ZIKV הונחה שאלות רבות הנוגעות: מדוע יש עלייה בחומרת המחלה, מהי התגובה החיסונית לזיהום ZIKV והם שם נגיפי ו/או הפתווגיות החיסונית מקושרים לעלייה נוירולוגית ביטויים ופגמים בלידה. עכשיו יש למהר להבין את מערכת העצבים המרכזית (cn) מחלה קשורה הקשורים ל-zikv, כמו גם את הצורך לבדוק במהירות את היעילות של נוגדנים וחיסונים נגד zikv. זה נגד הרקע הזה שפיתחנו שיטות לניתוח מהיר של zikv מגדל בפריפריה ו-cn באמצעות המוקד הספציפי zikv ליצור באמצעות בחני (ffa).
מודלים בעלי חיים קטנים חשובים להבנת התקדמות המחלה ולהערכה מוקדמת של חיסונים, therapeutics ואנטי ויראליים. הקמנו מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות מועבר באמצעות זנים שונים של העכבר כדי לדגמן זיהום האדם הגנה מפני פתוגנים נגיפי8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. באמצעות הניסיון הקודם הזה, התחלנו לשנות טכניקות המשמשות להערכת של wnv ו דנגה וירוס, flavivirus הקשורים להערכת zikv סיכוייו בשני איברים היקפיים, כמו גם את ה-cn21,23, 24. היתרונות של שיטות אלה בעלי האמצעים האחרים הם: 1) שהם משלבים את היכולת לקצור הן את אברי הפריפריה והן את איברי ה-cn לניתוח; 2) השיטות הן להתאמה עבור cy, להזרים לזרום, עבור מדידות של תגובות החיסונית מולדים מסתגלת, יחד עם מגדל נגיפי על אותה חיה באותו איבר; 3) טכניקת הקציר ניתנת להתאמה לניתוח היסטולוגית; 4) zikv ffa היא שיטת תפוקה גבוהה מהירה עבור ניתוח סיכוייו ויראלי; ו-5) שיטות אלה ניתן להחיל על הערכה של מגדל נגיפי באברי בעלי חיים נגועים ברוב פתוגנים25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

השיטות המוצגות להפגין נוהלי מעבדה לבידוד איברים מבעלי חיים נגועים בנגיף Zika והקוונפיקציה של עומס ויראלי. מטרת ההליך היא לכמת מגדל נגיפי באזורים היקפיים ו-cn של העכבר בנקודות זמן שונות לכתוב זיהום או בתנאים ניסיוניים שונים כדי לזהות virologic גורמים אימונולוגיים המסדירים זיהום וירוס zika. הליכי בידוד האיברים הפגינו לאפשר שני מיקוד היווצרות הקוונפיקציה והערכת ה-PCR הכמותי של titers ויראלי. טכניקות בידוד איברים מהירה נועדו לשימור titer וירוס. כימות ויראלי על ידי מיקוד היווצרות היכולת מאפשר הערכה תפוקה מהירה של וירוס Zika. היתרון של ההתמקדות ביצירת מיקוד הוא הערכה של וירוס זיהומיות, המגבלה של היכולת הזאת היא הפוטנציאל רעילות איברים לצמצם את מגבלת הזיהוי. הערכת סיכוייו ויראלי משולב עם PCR כמותי, באמצעות רקומביננטי RNA העתק שליטה הגנום ויראלי מספר בתוך האיבר מוערך עם מגבלה נמוכה של זיהוי. באופן כללי טכניקות אלה מספקים שיטת תפוקה מדויקת במהירות גבוהה לניתוח של מגדל ויראלי בפריפריה ו-cn של בעלי חיים נגועים בווירוס zika והוא יכול להיות מיושם על הערכה של מגדל נגיפי באיברים של בעלי חיים נגועים ביותר פתוגנים, כולל נגיף דנגה.

כדי להעריך את zikv מגדל באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל Ifnar1-/- עכברים נדבקו zikv (PRVABC59) באמצעות תת עורית (SC) הזרקה כדי footpad. כאן, המינהל של 1 x 105 ffu של zikv כדי 8-12 בן שבוע Ifnar1-/- עכברים SC הוא לא קטלני, אבל הווירוס יכול לשכפל הן בפריפריה והן ב-cn. מינון זה ותוואי מ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

בסרטון זה אנו מתארים קבוצה של הליכים שנועדו לחקור את ההשפעה של זיהום ויראלי ואת התגובה החיסונית וכתוצאה מכך באמצעות מודל מורין של זיהום זיקה. פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר לנו לפתח הבנה מכנית של זיהום וחסינות על ידי זיהוי המידה שבה וירוס התפשט בכל הגוף, חוצה מחסומים פיזיים וגישה לרקמות. טכניקות אלה מאפשרות הבנה מפורטת של פתוגנזה ויראלית ומספקות את היכולת לנתח את מנגנון ההגנה המסופק על ידי חיסונים או טיפולים.כאן אנו מדגימים שיטה זו באמצעות זיהום וירוס זיקה של עכברים, אבל שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של זיהומים ויראליים כולל flaviviruses אחרים כמו וירוס דנגי ו alphaviruses כמו וירוס Chikungunya. קצירת האיברים של מערכת העצבים המרכזית יכולה להיות מאתגרת, ולכן חשוב לאדם לתכנן ניסוי קטן, ויהיה מוכן לתרגל את הטכניקות מראש. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר של התפשטות נגיפית במודלים של בעלי חיים קטנים עם היכולת לדמיין, ללכוד ולאחסן נתונים ניסיוניים.חשוב להדגים באופן ויזואלי שיטה זו כדי לאפשר לנסיין להבין כיצד לקצור את איברי מערכת העצבים המרכזית. חשוב גם לראות את רמת הקונפדרציה התאית ואת עוצמת המוקד הנגיפי. כדי להתחיל, להשתמש במדפים כדי להסיר את פרווה של העכבר הנגוע.לערוף את ראשו של העכבר עם מספריים, ואחריו הסרת הידיים והרגליים. כדי לקצור את המוח, השתמש במספריים משוננים של לה גראנג' כדי לחתוך את הגולגולת דרך מגנום הקם. לקלף את הגולגולת עם מדפים, ולסקופ את המוח עם מרית.באמצעות מספריים קהה חזק, להסיר את העצם המקיפה את עמוד השדרה, ולאחר מכן לחתוך על פני עצם האגן כדי לחשוף את אבות החוליות ברמה המותנית. לאחר מכן, להסיר שריר רב ככל האפשר סביב עמוד השדרה. בזהירות, מניחים את הקצה משופע של המחט בתוך אבות החוליות, הימנעות לחץ מוגזם כדי למנוע את המחט הסגת גבול גוף החוליות.החזק בחוזקה כדי להפעיל לחץ על גוף החוליות והמחט, ולחץ על בוכנה מזרק לגרש את חבל הטבור לתוך צלחת פטרי. מעבירים מיד את חוט השדרה בצינור המסוקרן, ומעבירים לאמבט הקרח היבש להומוגניזציה נוספת. להומוגניזציה, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM והומוגניזציה של הדגימה ב-BeadBeater.לאחר הבטחת האיברים הם הומוגניים, דגימות צנטריפוגה ו aliquot על קרח ולאחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך. ביום ההקפאה, הסר את הדגימות ההומוגניות מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס, ואפשר להן להפשיר. עם הדגימות על הקרח, לדלל וירוס זיקה פי עשרה לתוך הטוב הראשון של צלחת הדילול ולהשתמש פיפטה רב ערוצי לעשות דילול סדרתי פי עשרה במורד הצלחת, שינוי טיפים בכל פעם.על ידי הוספת 20 microliters של מדגם לתוך 180 microliters של מדיה צמיחה, לשנות טיפים פיפטה בין כל דילול. הכן את הלוח להרכיב את המוקד על ידי הסרת התקשורת מן צלחת שטוחה מוכנה 96 באר כיסוי virocells. כדי למנוע מהמונולייטר להתייבש, הוסיפו מיד 100 מיקרוליטרים של דילול הנגיף לכל באר בווירופלט.השתמש באותה קבוצה של טיפים כדי להוסיף מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר. צלחת סלע מצד לצד פעמיים עד ארבע פעמים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה עד שעתיים. מחממים 2% מתיילקולוז לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לדלל את הפתרון 2%methylcellulose במדיה צמיחה ביחס של כ 2-1. לאחר הדגירה, הוסיפו 125 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה של מתילקלולוז לכל באר של צלחות 96 בארות. דגירה שוב ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך 32 עד 40 שעות.כדי לתקן את הווירוצלים, בארון biosafety להוסיף 50 microliters של 5% paraformaldehyde מעל החלק העליון של שכבת methylcellulose בכל באר של 96 צלחות היטב. דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, מכסים את הצלחות עם Parafilm וממקמים אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה.לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר שכבת-על ומדיה את התאים לתוך מיכל חד פעמי בתוך ארון biosafety. יש לשטוף בעדינות עם 150 מיקרוליטרים של PBS ל-150 מיקרו-גרם להיטב. הסר PBS מהצלחות ולהסיר את הצלחת מן הארון biosafety.חזור על לשטוף PBS פעמיים, ולאחר מכן להוסיף 150 microliters לבא פעם אחת FFA לשטוף חיץ ולהשאיר בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות כדי לחלחל את התאים הקבועים. לאחר מכן, השתמש בנוגדן זיקה ראשוני כדי לזהות זיהום. הכינו את הנוגדן העיקרי 4G2 בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר במאגר הכתמים של FFA.פליק FFA לשטוף חיץ מן הצלחות, ולהוסיף 50 microliters של הנוגדן העיקרי במאגר הכתמים FFA לכל באר. לאחר מכן לאטום את הצלחות עם Parafilm, או סרט פלסטיק, ותידגר לילה בארבע מעלות צלזיוס. הכן את המשני ללכת נגד עכבר HRP שכותרתו נוגדן בריכוז של אחד עד 5, 000 במאגר כתמים FFA.לאחר הסרת פתרון הנוגדנים, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 150 microliters FFA לשטוף מאגר לגם. הסר את מאגר הכביסה על-ידי החלקה לתוך הכיור בכל פעם. הכתם את התאים בנוגדן המשני במאגר הכתמים של FFA ב-50 מיקרוליטרים ל-100 מיקרוליטרים ל-1 עד 2 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לשטוף תאים שלוש פעמים עם מאגר לשטוף FFA, שוב, הסרת מאגר לשטוף על ידי מהבהב לתוך הכיור בכל פעם. הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע TrueBlue לתוך כל באר. המתן 2 עד 15 דקות עד שהנקודות מוגדרות במלואן עם רקע מינימלי.לאחר כתמים גלויים, לשטוף בעדינות עם מים באמצעות יד כדי להגן על monolayer מ כוחו של המים זורמים. הקש על יבש על מגבות נייר. זמן קצר לאחר מכן, השתמש בטווח ניתוח כדי לספור באופן ידני את הנקודות בכל באר, או השתמש ב מונה ספוט אוטומטי.בתוכנת ImmunoCapture, בחר דילול עם מוקדים מכובדים בקלות בין 20 ל -200 ל באר עבור כל מדגם וחשב טיטר ביחידות יוצרות מיקוד למילימטר באמצעות הממוצע של בארות כפולות. בניסוי זה, נטל ויראלי הוצג ברקמות ההיקפיות והמרכזיות של מערכת העצבים לאחר שעכברי Ifnar קיבלו נגיף זיקה תת עורית. מגבלת הזיהוי הייתה בין 100 ל-500 FFU לגרם, בהתבסס על איבר.בעת ביצוע הבדיקה יוצרת המוקד, טעויות טכניות עלולות לגרום לתוצאות תת-אופטימליות. רעילות איברים, מונעת על ידי ריכוז גבוה של כבד, שינה את הרגישות של ההתרכך. כאשר הטיטר הוויראלי באיבר היה נמוך מהרעילות, ה-FFA לא יכול היה לתעד במדויק את הטיטרים הנגיפיים.תאי כליות המחיש רעילות עם ריכוז איברים גבוה אבל היה להתגבר על ידי טיטר ויראלי בריכוזי איברים נמוכים. צינורות נמרצים או כביסה יכולים להסיר את המונו-קוטל, מה שמוביל לדיווח לא מדויק של נתונים אבודים על תוצאות טיטר. סיבים או שערות הקיימים בנייר סופג ספסל מעבדה, יכול לזהם בארות בודדות ולגרום לשגיאות משמעותיות אם באמצעות תוכנית ספירה אוטומטית.צפיפות תאים היא בעיה נוספת, אשר יכולה להשפיע באופן דרמטי על ההצלחה של הסתערות יוצרת מיקוד. תאים בעוצמה של כ-60% בתחילת ההקדמה, בהשוואה לתאים מצופים ב-90%, הראו הבדל דרמטי המשפיע על ההקדמה המתגבשת. תכנון גודלו והיקפו של הניסוי כך שקציר האיברים יושלם ביעילות, הוא החלק החשוב ביותר בהליך, ואחריו התחלת הבדיקה יוצרת המיקוד עם תאים באיכות גבוהה.הליך זה שימש לכימות וירוס עבור משפחות ויראליות מרובות. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם למסך עבור תרכובות טיפוליות לכמת נטרול טיטרים נוגדנים. טכניקות אלה משמשות לכמת וירוס חי ויש לנקוט בצעדי בטיחות מתאימים בהתאם להנחיות המפורטות ב- BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...