Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

핀토 박사는 세인트 루이스 의과 대학의 종자 보조금과 세인트 루이스 의과 대학의 창업 기금으로 자금을 지원받습니다. Brien 박사는 NIH NIAID의 K22AI104794 초기 조사자 상과 세인트 루이스 대학 학교의 종자 보조금으로 자금을 지원받습니다. 모든 기금이 투자된 개인의 경우, 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.

본 연구의 모든 절차는 세인트 루이스 대학 동물 관리 및 사용 위원회가 정한 지침에 따라 처리됩니다. SLU는 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증됩니다.
1. 장기 격리
참고: 바이러스는 실온 (RT)에서 안정되지 않으므로 한 번에 수확 된 동물의 수는 바이러스 성가를 보존하기 위해 신중하게 계획해야합니다....

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV 감염은 신경 질환을 일으킬 수 있으므로 현재 동물 모델은 병인, 면역 반응 및 백신 및 항 바이러스의 보호 효능을 연구하기 위해 CNS 내의 바이러스 제어에 집중할 필요가 있다. CNS 질병에 초점에 있는 도전의 한가지는 말초 감염을 공부하는 비용으로 수시로 온다입니다. 여기에 제안된 기관 격리 방법은 CNS 중재ZIKV 관련 질병을 평가하고 항바이러스제, 치료 및 전임상 시험을 위한 모형을 확립...

지카바이러스(ZIKV)는 플라비리대 패밀리에 속하는 아보바이러스로, 포와산 바이러스(POWV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 1과 같은 중요한신경침형 인간 병원체를 포함한다. 그것의 고립 및 확인에 따라, 아프리카와 아시아에 있는 인간 ZIKV 감염의 정기적인 보고가 있었다 2, 3,4,5,및 중남미 내의 전염병 (검토에서 참조6). 그러나, ZIKV가 심각한 질병을 일으키는 것으로 생각되었다 최근까지아니었다7. 지금 ZIKV 감염에 연결된 신경질병 및 출생 결함의 케이스의 수천이 있습니다. ZIKV의 급속한 출현은 관련있는 많은 질문을 자극했습니다: 왜 질병 엄격에 있는 증가가, ZIKV 감염에 면역학적인 반응은 무엇이고 신경학상에 있는 증가에 연결되는 바이러스성 및/또는 면역 중재한 병리학이 있습니다 증상 및 출생 결함. 이제 ZIKV와 관련된 중추 신경계 (CNS) 관련 질병뿐만 아니라 ZIKV에 대한 항 바이러스 및 백신의 효능을 신속하게 테스트 할 필요성을 이해하기 위해 서두르고 있습니다. 이러한 배경에서 우리는 ZIKV 특이적 초점 성형 분석법(FFA)을 사용하여 주변및 CNS 모두에서 ZIKV 적규자를 신속하게 분석하는 방법을 개발했습니다.
작은 동물 모형은 질병 진행을 이해하고 백신, 치료및 항바이러스제의 초기 평가를 위해 중요합니다. 우리는 바이러스 성 병원체에 대한 인간의 감염과 보호를 모델링하기 위해 다양한 마우스 균주를 사용하여arbovirus 질병의 연구를위한 작은 동물 모델을 설립했다 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. 이러한 사전 경험을 사용하여, 우리는 WNV 및 뎅기열 바이러스, 두 말초 기관뿐만 아니라 CNS21,23에서 ZIKV 이터의 평가를위한 관련 플라비 바이러스의 평가에 사용되는 기술을 수정하기시작했다. 24. 다른 분석에 비해 이러한 방법의 장점은 다음과 같습니다 : 1) 분석을 위해 말초 및 CNS 장기를 모두 수확하는 능력을 결합하는 것; 2) 방법은 같은 기관에서 동일한 동물에 바이러스 역가와 함께, 선천적 및 적응 면역 반응의 측정을위한 유세포 분석에 적응; 3) 수확 기술은 조직학적 분석에 적응할 수 있다; 4) ZIKV FFA는 바이러스 성가자 분석을위한 빠른 높은 처리량 방법입니다; 및 5) 이들 방법은 대부분의 병원체에 감염된 동물의 장기에서 바이러스 성 적수의평가에 적용될 수 있다(25).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

제시되는 방법은 Zika 바이러스 감염 동물에서 기관의 격리 및 바이러스 부하의 정량화를 위한 실험실 절차를 보여줍니다. 절차의 목적은 Zika 바이러스 감염을 통제하는 선인장 및 면역학 요인을 확인하기 위하여 감염 후 또는 다른 시험 조건 의 밑에 다른 시점 에서 마우스의 말초 및 CNS 지역에 있는 바이러스 성 역가를 정량화하는 것입니다. 입증된 기관 격리 절차는 바이러스 성 적기의 초점 형성 분석 정량화 및 정량적 PCR 평가를 모두 허용합니다. 급속한 기관 격리 기술은 바이러스 적기의 보존을 위해 디자인됩니다. 포커스 형성 분석에 의한 바이러스 성 적정정화는 Zika 바이러스의 신속한 처리량 평가를 허용합니다. 초점 형성 분석법의 이점은 전염성 바이러스의 평가이며, 이 분석법의 한계는 검출의 한계를 감소시키는 장기 독성에 대한 잠재력이다. 바이러스 적대자 평가는 정량적 PCR과 결합되고, 재조합 RNA 카피 대조군 바이러스 게놈 카피 번호를 사용하여 기관 내의 검출한계가 낮아 평가된다. 전반적으로 이러한 기술은 Zika 바이러스 감염 동물의 주변 및 CNS에서 Zika 바이러스 적시의 분석을 위한 정확한 빠른 높은 처리량 방법을 제공하고 대부분의 감염된 동물의 장기에서 바이러스 적기의 평가에 적용될 수 있습니다. 뎅기열 바이러스를 포함한 병원체.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 ZIKV 역가를 평가하기 위해 Ifnar1-/-마우스는 풋패드에 피하(SC) 주사를 통해 ZIKV(PRVABC59)에 감염되었다. 여기서, ZIKV의 1 x 105 FFU를 8-12주 령 Ifnar1-/-마우스 SC의 투여는 치명적이지 않지만 바이러스는 주변및 CNS 모두에서 복제할 수 있다. 이 복용량 및 경로 호스트 병원 체 면역 반응 및 병원 성을 연구 ?...

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Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

이 비디오에서 우리는 바이러스 감염의 충격 및 Zika 감염의 Murine 모형을 사용하여 결과 면역 반응을 심문하기 위하여 디자인된 절차의 세트를 기술합니다. 이 프로토콜은 바이러스가 신체 전체에 퍼진 정도를 식별하고 물리적 장벽을 변형시키고 조직에 액세스하여 감염과 면역에 대한 기계적 이해를 개발할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 바이러스 성 병인의 상세한 이해를 허용하고 백신 또는 치료에 의해 제공되는 보호 메커니즘을 해부 할 수있는 능력을 제공합니다.여기서 우리는 마우스의 Zika 바이러스 감염을 사용하여 이 방법을 보여줍니다, 그러나 이 방법은 뎅기열 바이러스 와 Chikungunya 바이러스 같이 그밖 flaviviruses를 포함하여 바이러스 감염의 범위에 적용될 수 있습니다. 중추 신경계의 장기를 수확하는 것은 어려울 수 있으므로 작은 실험을 계획하고 사전에 기술을 연습할 준비를하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하면 실험 데이터를 시각화, 캡처 및 저장할 수 있는 기능을 갖춘 작은 동물 모델 내에서 바이러스 확산의 신속한 해부를 허용합니다.실험자가 중추 신경계 장기를 수확하는 방법을 이해할 수 있도록 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 또한 세포 의 합류 수준과 바이러스 성 초점의 강도를 보는 것이 중요합니다. 먼저 집게를 사용하여 감염된 마우스의 펠트를 제거합니다.가위로 마우스의 머리를 참수하고 팔과 다리를 제거합니다. 뇌를 수확하려면 톱니 모양의 라 그레인지 가위를 사용하여 포멘 매그넘을 통해 두개골을 자른다. 집게로 두개골을 벗겨 내고 주걱으로 뇌를 떠냅니다.강한 무딘 가위를 사용하여 척추를 둘러싼 뼈를 제거한 다음 골반 뼈를 가로질러 길루 를 잘라 요추 수준에서 척추 포먼을 노출시하십시오. 그런 다음 척추를 둘러싼 가능한 한 많은 근육을 제거하십시오. 조심스럽게, 척추 포맨 내부에 바늘의 경부 팁을 배치, 척추 몸을 침입 바늘을 방지하기 위해 과도한 압력을 피.척추 몸과 바늘에 압력을 가하기 위해 강하게 잡고 주사기 플런저를 눌러 코드를 페트리 접시에 추방합니다. 즉시 표시된 튜브에 척수를 옮기고, 더 균일화를 위해 드라이 아이스 욕조에 놓습니다. 균질화의 경우 DMEM 1 밀리리터를 추가하고 비드비터에서 샘플을 균질화합니다.장기가 균질화되도록 한 후, 원심분리기와 알리쿼트 샘플을 얼음에 보관하고 필요할 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 분석 당일, 영하 80도 냉동고에서 균질화된 샘플을 제거하고 해동할 수 있도록 합니다. 얼음 에 샘플로, 희석 플레이트의 첫 번째 우물에 Zika 바이러스 열 배를 희석하고 플레이트 아래로 열 배 연속 희석을 할 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 팁을 매번 변경합니다.20 마이크로리터의 샘플을 180마이크로리터의 성장 매체에 추가하면 각 희석 사이에 파이펫 팁을 변경합니다. 제조된 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 생체세포를 덮는 중점 성형 플레이트를 준비한다. 단층이 건조되는 것을 방지하기 위해, 즉시 viroplate에 있는 각 우물에 바이러스 희석의 100 마이크로리터를 추가합니다.동일한 팁 세트를 사용하여 가장 낮은 위치에서 가장 높은 농도로 추가합니다. 바위 판은 2~4회 나란히 있고 1~2시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양합니다. 실온에 2%의 메틸셀룰로오스를 데우기.이어서, 성장 매체에서 2%메틸셀룰로오스 용액을 약 2대 1의 비율로 희석한다. 인큐베이션 후, 메틸셀룰로오스 성장 매체의 125 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 32~40시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 다시 배양합니다.비로세포를 고치려면 생물 안전 캐비닛에서 50 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 메틸셀룰로오스 층 위에 추가합니다. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 또는 파라필름으로 접시를 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 놓습니다.그 후, 파이펫을 사용하여 오버레이를 제거하고 세포를 생물 안전 캐비닛 내부의 일회용 용기로 매체로 넣습니다. 150 마이크로리터의 PBS로 부드럽게 씻으십시오. 플레이트에서 PBS를 제거하고 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 제거합니다.PBS 세척을 두 번 반복한 다음, FFA 세척 버퍼의 1회 당 150 마이크로리터를 추가하고 고정 된 세포를 충진하기 위해 실온에서 5 ~ 10 분 동안 둡니다. 다음으로, 감염을 검출하기 위하여 1 차적인 Zika 항체를 이용합니다. 1 차적인 항체 4G2를 FFA 염색 완충제에서 밀리리터 당 1 마이크로그램의 농도로 준비한다.Flick FFA는 플레이트에서 버퍼를 세척하고, 각 우물에 FFA 염색 버퍼에 1 차 항체의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 파라필름 또는 플라스틱 필름으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. FFA 염색 버퍼에서 1-5, 000의 농도로 이차 이동 항마우스 HRP 표지 항체를 준비한다.항체 용액을 제거한 후, 150마이크로리터 의 FFA 워시 버퍼로 세 번 세척할 수 있다. 매번 싱크대에 깜박여 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 버퍼에서 이차 항체를 가진 세포를 잘 당 50 마이크로리터로 염색하고 실온에서 1~2시간 배양한다.그 후, FFA 세척 버퍼로 세 번 세척, 다시, 싱크대에 매번 플릭하여 세척 버퍼를 제거. TrueBlue 기판의 50 마이크로리터를 각 우물에 추가합니다. 반점이 최소한의 배경으로 완전히 정의될 때까지 2~15분 정도 기다립니다.반점이 보이면 손으로 물로 부드럽게 씻어 서 모노레이어를 흐르는 물의 힘으로부터 보호합니다. 종이 타월에 마른 것을 두드려 주세요. 얼마 지나지 않아 해부 범위를 사용하여 각 우물의 반점을 수동으로 계산하거나 자동화된 스팟 카운터를 사용합니다.ImmunoCapture 소프트웨어에서 각 샘플당 20~200개의 쉽게 구별할 수 있는 희석을 선택하고 복제 된 우물의 평균을 사용하여 밀리미터당 초점 형성 단위로 티터를 계산합니다. 이 실험에서, 이프나르 마우스가 지카 바이러스를 피하로 투여한 후 말초 및 중추 신경계 조직에서 바이러스 부담이 나타났다. 검출의 한계는 기관에 근거를 둔 그램 당 100에서 500 FFU 사이이었습니다.포커스 형성 분석서를 수행할 때 기술적 실수는 최적이 아닌 결과를 초래할 수 있습니다. 간 독성, 간 고농도에 의해 구동, 분석의 감도 변경. 기관의 바이러스 성 티터가 독성보다 낮았을 때, FFA는 바이러스 성 티터를 정확하게 기록 할 수 없었습니다.신장 세포는 높은 기관 농도로 독성을 도시했지만 낮은 장기 농도에서 바이러스 성 티터에 의해 극복되었다. 격렬한 파이펫팅 이나 세척은 단층을 제거 할 수 있습니다, 티터 결과의 잘못된 데이터보고로 이어지는. 실험실 벤치 흡수 성 용지에 존재하는 섬유 또는 머리카락은 개별 우물을 오염시키고 자동화 된 카운팅 프로그램을 사용하는 경우 상당한 오류를 일으킬 수 있습니다.세포 밀도는 초점 형성 분석의 성공에 극적으로 영향을 미칠 수있는 또 다른 문제입니다. 분석의 시작 시 약 60%의 수렴성에서 세포는 90%의 수렴성으로 도금된 세포에 비해, 초점 형성 분석서에 영향을 미치는 극적인 차이를 보였다. 장기 수확이 효율적으로 완료되도록 실험의 크기와 범위를 계획하는 것은 절차의 가장 중요한 부분이며, 이어서 고품질 의 세포로 초점 형성 분석서를 시작합니다.이 절차는 여러 바이러스 가족에 대 한 바이러스를 정량화 하는 데 사용 되었습니다. 이 프로토콜은 또한 치료 화합물을 위한 스크린에 적응하고 중화 항체 titers를 정량화할 수 있습니다. 이러한 기술은 살아있는 바이러스를 양수하는 데 사용되며 BMBL에 명시된 지침에 따라 적절한 안전 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

연구

면역학 및 감염병학

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...