Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Dr. Pinto er finansiert av et frø stipend fra Saint Louis University School of Medicine og oppstart midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansiert av en K22AI104794 tidlig etterforsker Award fra NIH NIAID samt et frø stipend fra Saint Louis University School. For alle finansierte individer hadde Oppdragsgivers ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Alle prosedyrer i denne studien er i samsvar med retningslinjene fastsatt av St. Louis University Animal Care og use Committee. SLU er fullt akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. organ isolasjon
Merk: Viruset er ikke stabilt ved romtemperatur (RT), slik at antall dyr høstes på en gang må planlegges nøye for å bevare viral titers.
<ol><li>Infisere mus ved hjelp a...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV infeksjon kan føre til en nevrologisk sykdom derfor gjeldende dyremodeller å studere patogenesen, immunresponser og beskyttende effekt av vaksiner og antivirale midler må fokusere på viral kontroll i CNS. En av utfordringene med å fokusere på CNS sykdom er at det ofte kommer på bekostning av å studere perifer infeksjon. Orgelet isolasjon metoder foreslått her fokuserer på behovet for å raskt evaluere ZIKV infeksjon i både periferien og CNS for å vurdere CNS mediert ZIKV assosiert sykdom og etablere en m...

Zika virus (ZIKV) er en arbovirus som tilhører den hvilken familien, som inkluderer viktige neuroinvasive menneskelige patogener som Woodstock virus (POWV), japansk encefalitt virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Etter sin isolasjon og identifisering, har det vært periodiske rapporter om menneskelige ZIKV infeksjoner i Afrika og Asia2,3,4,5, og epidemier i Sentral-og Sør-Amerika (omtalt i Referanse6). Men det var ikke før nylig at ZIKV ble antatt å forårsake alvorlig sykdom7. Nå er det tusenvis av tilfeller av nevrologiske sykdommer og fødselsskader knyttet til ZIKV infeksjoner. Den raske fremveksten av ZIKV har bedt om mange spørsmål knyttet til: hvorfor det er en økning i sykdoms alvorlighetsgrad, hva er det immunologiske svaret på ZIKV infeksjon og er det viral og/eller immune mediert patologi knyttet til økningen i nevrologiske manifestasjoner og fødselsskader. Det er nå et rush å forstå sentralnervesystemet (CNS) relatert sykdom forbundet med ZIKV samt behovet for å raskt teste effekten av antivirale midler og vaksiner mot ZIKV. Det er mot denne bakgrunnen at vi har utviklet metoder for rask analyse av ZIKV titers i både periferien og CNS ved hjelp av en ZIKV-spesifikk fokus forming analyser (FFA).
Små dyremodeller er viktige for å forstå sykdomsprogresjon og for tidlig evaluering av vaksiner, legemiddel, og anti-Virals. Vi har etablert små dyremodeller for studiet av arbovirus sykdom ved hjelp av ulike mus belastninger for å modellere menneskelig infeksjon og beskyttelse mot viral patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjelp av denne tidligere erfaring, begynte vi å endre teknikker som brukes for vurdering av WNV og Dengue virus, en relatert Flavivirus for vurdering av ZIKV titer i både perifere organer, samt CNS21,23, 24. fordelene med disse metodene fremfor andre analyser er: 1) at de kombinerer evnen til å høste både PERIFERE og CNS organer for analysen; 2) metodene er tilpasningsdyktige for Flow flowcytometri, for målinger av medfødte og adaptive immunresponser, sammen med viral titers på samme dyret i samme organ; 3) innhøstingen teknikken er tilpasningsdyktig for histologiske analyse; 4) ZIKV FFA er en rask høy gjennomstrømning metode for viral titer analyse; og 5) disse metodene kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

Metodene blir presentert demonstrere laboratorie prosedyrer for isolering av organer fra Zika virusinfiserte dyr og kvantifisering av viral belastning. Formålet med prosedyren er å kvantifisere viral titers i perifere og CNS områder av musen på ulike tidspunkt poeng etter smitte eller under ulike eksperimentelle forhold for å identifisere virologisk og immunologiske faktorer som regulerer Zika virus infeksjon. Organ isolasjons prosedyrene viste gir mulighet for både fokus forming av analyse kvantifisering og kvantitativ PCR-vurdering av viral titers. De raske organ isolasjons teknikkene er utviklet for å bevare virus titer. Viral titer kvantifisering av fokus forming analysen gjør det mulig for rask gjennomstrømming vurdering av Zika virus. Fordelen med fokus forming analysen er vurderingen av smittsomme virus, er begrensningen av denne analysen potensialet for organ toksisitet redusere grensen for deteksjon. Viral titer vurdering er kombinert med kvantitativ PCR, og ved hjelp av et rekombinant RNA kopi kontroll viral Genova kopi nummer innenfor orgelet er vurdert med lav grense for påvisning. Samlet disse teknikkene gir en nøyaktig rask høy gjennomstrømning metode for analyse av Zika viral titers i periferien og CNS av Zika virusinfiserte dyr og kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener, inkludert Dengue virus.

For å evaluere ZIKV-titers ved hjelp av protokollen beskrevet over Ifnar1-/- mus ble infisert med ZIKV (PRVABC59) via subkutan (SC) injeksjon til footpad. Her er administrasjonen av 1 x 105 FFU av ZIKV til 8-12 uke gamle Ifnar1-/- mus SC ikke dødelig, men viruset kan replikere i både periferien og CNS. Denne dose og rute brukes til å studere verten patogen immunresponser og patogenitet. Administrasjon av 1 x 105 FFU av ZIK...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering og kvantifisering av Zika virus fra flere organer i en mus

Målet med protokollen er å demonstrere teknikker som brukes til å undersøke viral sykdom ved å isolere og kvantifisere Zika virus, fra flere organer i en mus etter infeksjon.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

I denne videoen beskriver vi et sett med prosedyrer designet for å avhøre virkningen av en virusinfeksjon og den resulterende immunologiske responsen ved hjelp av en Murine-modell av Zika-infeksjon. Denne protokollen er betydelig fordi den tillater oss å utvikle en mekanistisk forståelse av infeksjon og immunitet ved å identifisere i hvilken grad et virus har spredt seg over hele kroppen, transversing av fysiske barrierer og tilgang til vev. Disse teknikkene tillater en detaljert forståelse av viral patogenese og gir evnen til å dissekere beskyttelsesmekanismen gitt av vaksiner eller terapeutiske midler.Her demonstrerer vi denne metoden ved hjelp av Zika-virusinfeksjon av mus, men denne metoden kan brukes på en rekke virusinfeksjoner, inkludert andre flavivirus som Dengue-virus og alfavirus som Chikungunya-virus. Høsting av organene i sentralnervesystemet kan være utfordrende, så det er viktig for en person å planlegge et lite eksperiment, og være forberedt på å øve teknikkene på forhånd. Denne protokollen gjør det mulig å raskt disseksjon av viral spredning i små dyremodeller med evnen til å visualisere, fange og lagre eksperimentelle data.Det er viktig å visuelt demonstrere denne metoden for å tillate eksperimentereren å forstå hvordan man høster sentralnervesystemets organer. Det er også viktig å se nivået av celle samløpet og intensiteten av viral foci. For å begynne, bruk tang for å fjerne skinnet til den infiserte musen.Decapitate musens hode med saks, etterfulgt av fjerning av armer og ben. For å høste hjernen, bruk taggete La Grange saks for å kutte skallen gjennom foramen magnum. Skrell av skallen med tang, og øse ut hjernen med en slikkepott.Ved hjelp av sterk stump saks, fjern beinet rundt ryggraden, og kutt deretter over bekkenbenet for å eksponere vertebral foramen på lumbalnivå. Deretter fjerner du så mye muskler som mulig rundt ryggraden. Plasser forsiktig den skråspissen av nålen inne i vertebral foramen, unngår overdrevent trykk for å hindre at nålen inntrenger vertebralkroppen.Hold sterkt for å utøve press på vertebralkroppen og nålen, og trykk sprøytestempelet for å utvise ledningen inn i petriskålen. Overfør umiddelbart ryggmargen i det merkede røret, og legg i det tørre isbadet for videre homogenisering. For homogenisering, legg til en milliliter DMEM og homogeniser prøven i en BeadBeater.Etter å ha sikret organer er homogenisert, sentrifuge og aliquot prøver på is og lagre i minus 80 grader Celsius til nødvendig. På analysedagen fjerner du de homogeniserte prøvene fra minus 80 grader Celsius fryser, og la dem tine. Med prøvene på is, fortynne Zika virus tidoblet inn i den første brønnen av fortynningsplaten og bruke en flerkanals pipette for å gjøre tidoblet seriefortynninger ned platen, skiftende tips hver gang.Ved å legge til 20 mikroliter prøve i 180 mikroliter vekstmedier, bytt pipettespisser mellom hver fortynning. Forbered fokusformingsplaten ved å fjerne mediet fra den tilberedte flate bunnplaten på 96 brønner som dekker virocells. For å hindre at monolayeren tørker ut, legg umiddelbart til 100 mikroliter av virusfortynningen til hver brønn i viroplaten.Bruk samme sett med tips for å legge til fra den laveste til høyeste konsentrasjonen. Bunnplate side til side to til fire ganger og inkubere ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i en til to timer. Varm opp 2% metylcellulose til romtemperatur.Deretter fortynner du 2% metylcelluloseløsning i vekstmedier i forholdet mellom omtrent to og en. Etter inkubasjon, tilsett 125 mikroliter av metylcellulosevekstmediet til hver brønn av de 96-brønnplatene. Inkuber igjen ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i 32 til 40 timer.For å fikse virocellene, legg i et biosikkerhetsskap til 50 mikroliter på 5% paraformaldehyd over toppen av metylcelluloselaget i hver brønn av de 96-brønnplatene. Inkuber i 60 minutter ved romtemperatur. Alternativt kan du dekke platene med Parafilm og plassere dem på fire grader Celsius over natten.Deretter bruker du en pipette til å fjerne overlegg og medier av celler i en engangsbeholder inne i biosikkerhetsskapet. Vask forsiktig med 150 mikroliter PBS per brønn. Fjern PBS fra platene og fjern platen fra biosikkerhetsskapet.Gjenta PBS vask to ganger, og legg deretter til 150 mikroliter per brønn en gang FFA vaskebuffer og la ved romtemperatur i fem til 10 minutter for å gjennomsyre de faste cellene. Deretter bruker du primært Zika-antistoff for å oppdage infeksjon. Forbered det primære antistoffet 4G2 ved en konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter i FFA farging buffer.Flick FFA vaskebuffer fra platene, og legg til 50 mikroliter av det primære antistoffet i FFA farging buffer til hver brønn. Deretter forsegle platene med Parafilm, eller plastfilm, og inkuber over natten på fire grader Celsius. Forbered den sekundære gå anti-mus HRP merket antistoff i en konsentrasjon av en til 5,000 i FFA farging buffer.Etter å ha fjernet antistoffløsningen, vask celler tre ganger med 150 mikroliter FFA vaskebuffer per brønn. Fjern vaskebufferen ved å sveipe inn i vasken hver gang. Beis cellene med det sekundære antistoffet i FFA farging buffer på 50 mikroliter per brønn og inkubere en til to timer ved romtemperatur.Deretter vasker du celler tre ganger med FFA-vaskebuffer, igjen, og fjerner vaskebufferen ved å sveipe inn i vasken hver gang. Legg til 50 mikroliter av TrueBlue-substratet i hver brønn. Vent to til 15 minutter til flekkene er fullt definert med minimal bakgrunn.Etter at flekkene er synlige, vask forsiktig med vann ved hjelp av en hånd for å skjerme monolayeren fra kraften av vannet som går. Trykk tørr på papirhåndklær. Kort tid etter bruker du et disseksjonsomt omfang til å telle manuelt stedene i hver brønn, eller bruk en automatisert spotteller.I ImmunoCapture-programvaren velger du en fortynning med lett skillede foci mellom 20 og 200 per brønn for hver prøve og beregner titer i fokusdannende enheter per millimeter ved hjelp av gjennomsnittet av dupliserte brønner. I dette eksperimentet ble virusbyrde vist i perifert og sentralnervesystemet vev etter at Ifnar mus ble gitt Zika virus subkutant. Grensen for deteksjon var mellom 100 og 500 FFU per gram, basert på organ.Når du utfører den fokusdannende analysen, kan tekniske feil føre til suboptimale resultater. Organtoksisitet, drevet av høy konsentrasjon av lever, endret følsomheten til analysen. Når den virale titeren i orgelet var lavere enn toksisiteten, kunne FFA ikke nøyaktig registrere viraltitere.Nyreceller illustrerte toksisitet med høy organkonsentrasjon, men ble overvunnet av viral titer ved lave organkonsentrasjoner. Kraftig pipettering eller vasking kan fjerne monolayeren, noe som fører til tapt data unøyaktig rapportering av titer resultater. Fibre eller hår som finnes i lab benk absorberende papir, kan forurense individuelle brønner og forårsake betydelige feil hvis du bruker et automatisert telleprogram.Celletetthet er et annet problem, noe som dramatisk kan påvirke suksessen til en fokusdannende analyse. Celler ved omtrent 60 % samløpet ved starten av analysen, sammenlignet med celler belagt med 90 % samløpet, viste dramatisk forskjell som påvirket den fokusdannende analysen. Planlegging av størrelsen og omfanget av eksperimentet slik at organinnhøsting fullføres effektivt, er den viktigste delen av prosedyren, etterfulgt av å starte den fokusdannende analysen med celler av høy kvalitet.Denne prosedyren har blitt brukt til å kvantifisere virus for flere virale familier. Denne protokollen kan også tilpasses skjermen for terapeutiske forbindelser og kvantifisere nøytraliserende antistofftere. Disse teknikkene brukes til å kvantate levende virus og passende sikkerhetstiltak bør tas i henhold til retningslinjene fastsatt i BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redning og karakterisering av rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus smittsom klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus spesifikke diagnostiske Epitope oppdagelsen

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flowcytometri basert analyse for å fastslå In Vitro antistoff avhengige forbedring av Dengue Virus benytter Zika Virus rekonvalesent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluering av Zika Virus-spesifikke T-celle svar i Immunoprivileged organer av infiserte Ifnar1- / - mus

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifisering av antistoff avhengige forsterkning av Zika viruset i primære menneskelige celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...