Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

O Dr. pinto é financiado por uma bolsa de sementes da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis e fundos de arranque da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis. O Dr. Brien é financiado por um K22AI104794 prêmio de investigador precoce do NIH NIAID, bem como uma concessão de sementes da escola Saint Louis University. Para todos os indivíduos financiados, os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de St. Louis. A SLU é totalmente credenciada pela Associação de avaliação e credenciamento do laboratório de cuidados com animais internacionais (AAALAC).
1. isolamento de órgãos
Nota: O vírus não é estável à temperatura ambiente (RT), de modo que o número de animais colhidos ao mesmo tempo ...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

A infecção por ZIKV pode causar uma doença neurológica, portanto, os modelos animais atuais para estudar a patogênese, respostas imunes e eficácia protetora de vacinas e antivirais precisam se concentrar no controle viral dentro do SNC. Um dos desafios em focar na doença do SNC é que muitas vezes vem à custa de estudar a infecção periférica. Os métodos de isolamento de órgãos propostos aqui se centram na necessidade de avaliar rapidamente a infecção pelo ZIKV tanto na periferia quanto no SNC, a fim de av...

O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, que inclui importantes patógenos humanos neuroinvasivos, como o vírus Powassan (POWV), o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus do Nilo Ocidental (WNV)1. Após seu isolamento e identificação, houve relatos periódicos de infecções humanas de zikv na África e na Ásia2,3,4,5e epidemias dentro da América Central e do Sul (revisada em referência6). Entretanto, não era até recentemente que o ZIKV estêve pensado para causar a doença severa7. Agora há milhares de casos de doença neurológica e defeitos congênitos ligados a infecções por ZIKV. A rápida emergência do ZIKV tem alertado para muitas questões relacionadas com: por que há um aumento na severidade da doença, qual é a resposta imunológica à infecção por ZIKV e existem patologias virais e/ou imunes mediadas ligadas ao aumento da manifestações e defeitos congênitos. Há agora uma pressa para compreender a doença relacionada do sistema nervoso central (CNS) associada com o ZIKV assim como a necessidade de testar ràpida a eficácia dos antivirais e das vacinas de encontro a ZIKV. É contra este pano de fundo que desenvolvemos métodos para a rápida análise dos títulos de ZIKV tanto na periferia como no SNC, utilizando um foco específico de ZIKV formando ensaios (FFA).
Os modelos animais pequenos são importantes para compreender a progressão da doença e para a avaliação adiantada das vacinas, da terapêutica, e dos anti-Virals. Nós estabelecemos modelos animais pequenos para o estudo da doença do arbovírus usando várias tensões do rato para modelar a infecção humana e a proteção de encontro aos micróbios patogénicos virais8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Usando essa experiência prévia, começamos a modificar as técnicas utilizadas para a avaliação do vírus da WNV e da dengue, um Flavivirus relacionado para a avaliação do titer de zikv em ambos os órgãos periféricos, bem como o SNC21,23, as vantagens 24. The destes métodos sobre outros ensaios são: 1) que combinam a habilidade de colher órgãos periféricos e do CNS para a análise; 2) os métodos são adaptáveis para a citometria de fluxo, para medições de respostas imunes inatas e adaptativas, juntamente com títulos virais no mesmo animal no mesmo órgão; 3) a técnica de colheita é adaptável para análise histológica; 4) o ZIKV FFA é um método rápido da taxa de transferência elevada para a análise viral do Titer; e 5) esses métodos podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patógenos25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

Os métodos apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para o isolamento de órgãos de animais infectados pelo vírus Zika e a quantificação da carga viral. O objetivo do procedimento é quantificar os títulos virais em áreas periféricas e do SNC do camundongo em diferentes pontos temporais pós-infecção ou diferentes condições experimentais para identificar fatores virológicos e imunológicos que regulam a infecção pelo vírus Zika. Os procedimentos da isolação do órgão demonstraram permitem a quantificação do ensaio da formação do foco e a avaliação quantitativa do PCR de Titers virais. As técnicas rápidas da isolação do órgão são projetadas para a preservação do Titer do vírus. A quantificação do Titer viral pelo ensaio de conformação de foco permite a avaliação rápida da taxa de transferência do vírus Zika. O benefício do ensaio de formação de foco é a avaliação do vírus infeccioso, a limitação deste ensaio é o potencial para toxicidade de órgãos reduzindo o limite de detecção. A avaliação do Titer viral é combinada com o PCR quantitativo, e usar um número de cópia do genoma viral do controle da cópia do RNA recombinante dentro do órgão é avaliado com baixo limite de deteção. No geral, essas técnicas fornecem um método de alta taxa de transferência rápida e precisa para a análise dos títulos virais da Zika na periferia e no SNC dos animais infectados pelo vírus Zika e podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patogénicos, incluindo o vírus da dengue.

Para avaliar títulos de zikv usando o protocolo descrito acima Ifnar1-/- os ratos foram contaminados com o zikv (PRVABC59) através da injeção subcutaneous (SC) ao footpad. Aqui, a administração de 1 x 105 FFU de zikv para 8-12 semana de idade Ifnar1-/- MICE SC não é letal, mas o vírus pode replicar na periferia e CNS. Esta dose e rota são usadas para estudar as respostas imunes do patógeno hospedeiro e a patogenicidade. Admini...

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Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Neste vídeo descrevemos um conjunto de procedimentos projetados para interrogar o impacto de uma infecção viral e a resposta imunológica resultante usando um modelo murino de infecção pelo Zika. Este protocolo é significativo porque nos permite desenvolver uma compreensão mecanicista da infecção e imunidade, identificando até que ponto um vírus se espalhou pelo corpo, transversando barreiras físicas e acessando tecidos. Essas técnicas permitem uma compreensão detalhada da patogênese viral e proporcionam a capacidade de dissecar o mecanismo de proteção fornecido por vacinas ou terapêuticas.Aqui demonstramos este método usando a infecção pelo vírus Zika em camundongos, mas este método pode ser aplicado a uma série de infecções virais, incluindo outros flavivírus, como o vírus da Dengue e alfavírus como o vírus Chikungunya. Colher os órgãos do sistema nervoso central pode ser um desafio, por isso é importante para uma pessoa planejar um pequeno experimento, e estar preparada para praticar as técnicas de antemão. Este protocolo permite a dissecação rápida da propagação viral dentro de pequenos modelos animais com a capacidade de visualizar, capturar e armazenar dados experimentais.É importante demonstrar visualmente esse método para permitir que o experimentador entenda como colher os órgãos do sistema nervoso central. Também é importante ver o nível de confluência celular e a intensidade dos focos virais. Para começar, use fórceps para remover a pele do rato infectado.Decapitar a cabeça do rato com uma tesoura, seguida da remoção dos braços e pernas. Para colher o cérebro, use uma tesoura serrilhada de La Grange para cortar o crânio através do foien magnum. Retire o crânio com fórceps, e retire o cérebro com uma espátula.Usando uma tesoura forte e sem cortes, remova o osso ao redor da coluna vertebral, depois corte o osso pélvico para expor o forame vertebral ao nível lombar. Em seguida, remova o máximo de músculos possível em torno da coluna vertebral. Cuidadosamente, coloque a ponta chanfrada da agulha dentro do forames vertebral, evitando pressão excessiva para evitar que a agulha invada o corpo vertebral.Segure fortemente para exercer pressão sobre o corpo vertebral e a agulha, e pressione o êmbolo da seringa para expulsar o cordão para dentro da placa de petri. Transfira imediatamente a medula espinhal no tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco para maior homogeneização. Para homogeneização, adicione um mililitro de DMEM e homogeneize a amostra em um BeadBeater.Depois de garantir que os órgãos sejam homogeneizados, centrífugas e amostras de alíquota no gelo e armazenem menos 80 graus Celsius até que seja necessário. No dia do ensaio, remova as amostras homogeneizadas do congelador menos 80 graus Celsius e deixe-as descongelar. Com as amostras no gelo, dilui o vírus Zika dez vezes no primeiro poço da placa de diluição e use uma pipeta multicanal para fazer diluições seriais dez vezes na placa, mudando as pontas cada vez.Adicionando 20 microlitadores de amostra em 180 microliters de mídia de crescimento, mude as pontas de pipeta entre cada diluição. Prepare a placa de formação de foco removendo a mídia da placa de 96 poços de fundo preparada cobrindo virocélulas. Para evitar que a monocamado seque, adicione imediatamente 100 microliters da diluição do vírus a cada poço no viroplate.Use o mesmo conjunto de pontas para adicionar da menor à maior concentração. Placa de rocha lado a lado duas a quatro vezes e incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas. Aqueça 2% de metilcelulose à temperatura ambiente.Em seguida, diluir a solução de 2% de metilcelulose em meios de crescimento em uma proporção de aproximadamente dois para um. Após a incubação, adicione 125 microliters da mídia de crescimento de metilcelulose a cada poço das placas de 96 poços. Incubar novamente a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 32 a 40 horas.Para corrigir as virocélulas, em um armário de biossegurança adicione 50 microliters de 5% paraformaldeído sobre a parte superior da camada de metilcelulose em cada poço das placas de 96 poços. Incubar por 60 minutos em temperatura ambiente. Alternativamente, cubra as placas com Parafilm e coloque-as em quatro graus Celsius durante a noite.Depois disso, use uma pipeta para remover a sobreposição e a mídia das células em um recipiente descartável dentro do armário de biossegurança. Lave suavemente com 150 microliters de PBS por poço. Remova o PBS das placas e remova a placa do armário de biossegurança.Repita a lavagem pbs duas vezes, depois adicione 150 microliters por poço uma vez o tampão de lavagem FFA e deixe à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos para permeabiliizar as células fixas. Em seguida, use o anticorpo zika primário para detectar infecção. Prepare o anticorpo primário 4G2 a uma concentração de um micrograma por mililitro no tampão de coloração ffa.Flick FFA lavar tampão das placas, e adicionar 50 microliters do anticorpo primário no tampão de coloração FFA para cada poço. Em seguida, sele as placas com Parafilm, ou filme plástico, e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare o anticorpo cdh de tinta anti-rato secundário com uma concentração de 1 a 5.000 em tampão de coloração DA FFA.Depois de remover a solução de anticorpos, lave as células três vezes com 150 microliters FFA wash buffer por poço. Remova o tampão de lavagem mexendo na pia cada vez. Manche as células com o anticorpo secundário no tampão de coloração FFA a 50 microliters por poço e incubar de uma a duas horas à temperatura ambiente.Depois disso, lave as células três vezes com o tampão de lavagem FFA, novamente, removendo o tampão de lavagem, movendo-se para a pia cada vez. Adicione 50 microliters do Substrato TrueBlue em cada poço. Aguarde de dois a 15 minutos até que as manchas estejam totalmente definidas com o mínimo de fundo.Depois que as manchas estiverem visíveis, lave delicadamente com água usando uma mão para proteger a monocamada da força da água que corre. Bata em toalhas de papel. Pouco depois, use um escopo de dissecação para contar manualmente as manchas em cada poço ou usar um contador de ponto automatizado.No software ImmunoCapture, selecione uma diluição com focos facilmente distintos entre 20 e 200 por poço para cada amostra e calcule o título em unidades de formação de foco por milímetro usando a média de poços duplicados. Neste experimento, a carga viral foi mostrada nos tecidos do sistema nervoso periférico e central após os camundongos Ifnar receberem o vírus Zika subcutâneamente. O limite de detecção foi entre 100 a 500 FFU por grama, com base no órgão.Ao realizar o ensaio de formação de foco, erros técnicos podem resultar em resultados subótimos. A toxicidade dos órgãos, impulsionada pela alta concentração hepática, alterou a sensibilidade do ensaio. Quando o título viral no órgão era menor que a toxicidade, a FFA não conseguia registrar com precisão os títulos virais.As células renais ilustraram a toxicidade com alta concentração de órgãos, mas foram superadas pelo título viral em baixas concentrações de órgãos. Tubulação vigorosa ou lavagem pode remover a monocamadas, levando a relatórios imprecisos de dados perdidos de resultados de titer. Fibras ou cabelos presentes em papel absorvente de banco de laboratório, podem contaminar poços individuais e causar erros significativos se usar um programa de contagem automatizada.A densidade celular é outra questão, que pode impactar drasticamente o sucesso de um ensaio de formação de foco. As células com aproximadamente 60% de confluência no início do ensaio, em comparação com as células banhadas em 90% de confluência, mostraram diferença dramática impactando o ensaio de formação de foco. Planejar o tamanho e o escopo do experimento para que a colheita de órgãos seja concluída de forma eficiente, é a parte mais importante do procedimento, seguido pelo início do ensaio de formação de foco com células de alta qualidade.Este procedimento tem sido usado para quantificar o vírus para múltiplas famílias virais. Este protocolo também pode ser adaptado para tela para compostos terapêuticos e quantificar titulações de anticorpos neutralizantes. Essas técnicas são utilizadas para quantificar o vírus vivo e as medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas de acordo com as diretrizes estabelecidas no BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

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Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Imunologia e Infecção

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Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

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Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

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Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

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Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...