Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Д-р Пинто финансируется за счет семенного гранта от Университета Сент-Луиса школы медицины и запуска средств из Университета Сент-Луиса школы медицины. Д-р Бриен финансируется K22AI104794 раннего следователя награду от NIH NIAID, а также семян грант от школы Университета Сент-Луиса. Для всех финансируемых лиц спонсоры не имели никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сент-Луиса. SLU полностью аккредитованАссоциацией Ассоциации по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными International (AAALAC).
<...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

Инфекция ЗИКВ может вызвать неврологическое заболевание, поэтому нынешние модели животных для изучения патогенеза, иммунных реакций и защитной эффективности вакцин и противовирусных препаратов должны сосредоточиться на вирусном контроле в рамках ЦНС. Одна из проблем в фокусировке н...

Вирус Зика (ЗИКВ) является арбовирус, который принадлежит к семейство flaviviridae, который включает в себя важные нейроинвазивные человеческие патогены, такие как вирус Powassan (POWV), японский вирус энцефалита (JEV), и вирус Западного Нила (WNV)1. После его изоляции и идентификации, периодически поступают сообщения оинфекциях, инфекциях, инфицированных людьми в Африке и Азии 2,3,4,5,и эпидемиях в Центральной и ссылка6). Тем не менее, он не был до недавнего времени, что ЗИКВ считалось причиной тяжелой болезни7. В настоящее время существуют тысячи случаев неврологических заболеваний и врожденных дефектов, связанных с инфекциями ЗИКВ. Быстрое появление ЗИКВ вызвало много вопросов, связанных с: почему наблюдается увеличение тяжести заболевания, какова иммунологическая реакция на инфекцию ЗИКВ и существуют вирусные и/или иммунные опосредованные патологии, связанные с увеличением неврологических проявления и врожденные дефекты. В настоящее время существует спешка, чтобы понять, центральной нервной системы (ЦНС), связанных с болезнью, связанной с ЗИКВ, а также необходимость быстрого тестирования эффективности противовирусных препаратов и вакцин против ЗИКВ. Именно на этом фоне мы разработали методы быстрого анализа титров ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС с использованием анализа фокус-образующих фокусов (FFA) с помощью анализа, формирующего фокусы ,IKV).
Малые модели животных важны для понимания прогрессирования заболевания и для ранней оценки вакцин, терапевтических препаратов и противовирусных препаратов. Мы создали небольшие модели животных для изучения арбовирусной болезни с помощью различных штаммов мыши для моделирования инфекции человека и защиты от вирусных патогенов8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Используя этот предыдущий опыт, мы начали изменять методы, используемые для оценки WNV и денге вирус, связанный флавивирус для оценки ЗИКВ титер в обоих периферических органов, а также ЦНС21,23, 24. Преимущества этих методов по сравнению с другими анализами: 1) что они сочетают в себе способность собирать как периферийные, так и cnS органов для анализа; 2) методы адаптируются для цитометрии потока, для измерения врожденных и адаптивных иммунных реакций, наряду с вирусными титерами на одном животном в том же органе; 3) техника сбора урожая адаптируется для гистологического анализа; 4) FFA зиКВ является быстрым методом высокой пропускной их возможности для анализа вирусного титра; и 5) эти методы могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенов25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

Представленные методы демонстрируют лабораторные процедуры для изоляции органов от инфицированных вирусом Зика животных и количественную оценку вирусной нагрузки. Целью процедуры является количественная оценка вирусных титрав в периферических и ЦНС областях мыши в разных точках времени после инфекции или в различных экспериментальных условиях для выявления вирусологических и иммунологических факторов, которые регулируют вирусную инфекцию зика. Продемонстрированные процедуры изоляции органов позволяют как формировать фокус-формировать количественную оценку, так и количественную оценку ПЦР вирусных титров. Методы быстрой изоляции органов предназначены для сохранения вируса титра. Вирусная количественная оценка титра путем проведения спомощьи фокус-формирования позволяет быстро оценить пропускную стоимость вируса Зика. Преимуществом фокусобразующего ассса является оценка инфекционного вируса, ограничение этого анализа является потенциалом токсичности органов, уменьшающей предел обнаружения. Вирусная оценка титра сочетается с количественным ПЦР, а с помощью рекомбинантного РНК-копировальный контроль вирусного генома в органе оценивается с низким пределом обнаружения. В целом эти методы обеспечивают точный быстрый метод высокой пропускной связи для анализа вирусных титеров Зика на периферии и ЦНС инфицированных животных вирусом Зика и могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенных микроорганизмов, включая вирус Денге.

Для оценки титеров ЗИКВ с помощью протокола, описанного выше Ifnar1-/- мыши были инфицированы ЗИКВ (PRVABC59) с помощью подкожной (SC) инъекции в подножку. Здесь, администрация 1 х 105 FFU из ЗИКВ до 8-12 недель Ifnar1-/- мышей SC не является смертельным, но вирус ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Изоляция и количественная оценка вируса Зика из нескольких органов в мыши

Цель протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для исследования вирусных заболеваний путем изоляции и количественной оценки вируса Зика, от нескольких органов в мыши после инфекции.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

В этом видео мы описываем набор процедур, предназначенных для допроса воздействия вирусной инфекции и в результате иммунологической реакции с использованием муриной модели инфекции Зика. Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нам развивать механистическое понимание инфекции и иммунитета путем выявления степени распространения вируса по всему организму, поперечных физических барьеров и доступа к тканям. Эти методы позволяют детально понять вирусный патогенез и обеспечивают возможность вскрытия механизма защиты, предоставляемого вакцинами или терапевтическими средствами.Здесь мы демонстрируем этот метод с использованием вирусной инфекции Зика мышей, но этот метод может быть применен к ряду вирусных инфекций, включая другие флавивирусы, такие как вирус Денге и альфавирусы, такие как вирус Чикунгунья. Сбор органов центральной нервной системы может быть сложной задачей, поэтому важно для человека, чтобы спланировать небольшой эксперимент, и быть готовым к практике методы заранее. Этот протокол позволяет быстро рассечение вирусного распространения в малых животных моделей с возможностью визуализировать, захвата и хранения экспериментальных данных.Важно визуально продемонстрировать этот метод, чтобы позволить экспериментатору понять, как собрать органы центральной нервной системы. Также важно видеть уровень клеточного слияния и интенсивность вирусных очагов. Для начала используйте типсы, чтобы удалить шкуру зараженной мыши.Обезглавить голову мыши ножницами, а затем удаление рук и ног. Чтобы собрать мозг, используйте зубчатые ножницы La Grange, чтобы прорезать череп через foramen magnum. Очистите череп типсами и вычерпыв мозг шпателем.Используя сильные притупленные ножницы, удалить кости, окружающие позвоночник, а затем сократить через тазовую кость, чтобы разоблачить позвонков foramen на поясничном уровне. Затем удалите как можно больше мышц, окружающих позвоночник. Тщательно поместите скошенный кончик иглы внутри позвоночных foramen, избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить проникновение иглы позвонков тела.Держите сильно, чтобы оказать давление на тело позвонка и иглы, и нажмите шприц поршень, чтобы изгнать шнур в чашку Петри. Немедленно перенесите спинной мозг в помеченную трубку и поместите в сухую ледяную ванну для дальнейшей гомогенизации. Для гомогенизации добавьте один миллилитр DMEM и гомогенизируйте образец в BeadBeater.После обеспечения органов гомогенизации, центрифуги и aliquot образцов на льду и хранить в минус 80 градусов по Цельсию, пока это необходимо. В день анализа удалите гомогенизированные образцы из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию и дайте им оттаять. С образцами на льду, разбавить вирус Зика в десять раз в первый колодец разбавленной пластины и использовать многоканальный пипетку, чтобы сделать десятикратное последовательное разбавления вниз пластины, меняя советы каждый раз.Добавив 20 микролитров образца в 180 микролитров средств роста, измените советы пипетки между каждым разбавлением. Подготовьте плиту формирования фокуса путем извлекать средства от подготовленного плоского дна 96-наилучшим образом плиты покрывая virocells. Чтобы монослой не высыхал, немедленно добавьте 100 микролитров разбавления вируса к каждой хорошо в вироплате.Используйте тот же набор советов, чтобы добавить от самой низкой до самой высокой концентрации. Рок пластины из стороны в сторону два-четыре раза и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного-двух часов. Разогреть 2%метилцеллюлоза до комнатной температуры.Затем разбавьте 2%-метилцеллюлозный раствор в средствах роста в соотношении примерно два к одному. После инкубации добавьте 125 микролитров метилцеллюлозы к каждому колодец из 96-х пластин. Инкубировать снова при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 32 до 40 часов.Чтобы исправить вироцелли, в шкаф биобезопасности добавить 50 микролитров 5%paraformaldehyde поверх слоя метилцеллюлозы в каждой хорошо из 96-хорошо пластин. Инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. Кроме того, покрыть пластины с Parafilm и поместить их на четыре градуса по Цельсию на ночь.После этого используйте пипетки для удаления наложения и смеся ячеек в одноразовый контейнер внутри шкафа биобезопасности. Аккуратно вымойте 150 микролитров PBS на колодец. Снимите PBS с пластин и удалите пластину из шкафа биобезопасности.Повторите PBS мыть дважды, затем добавить 150 микролитров на хорошо один раз FFA мыть буфер и оставить при комнатной температуре в течение пяти до 10 минут, чтобы проницать фиксированные клетки. Далее, используйте первичные антитела Зика для обнаружения инфекции. Подготовка первичного антитела 4G2 при концентрации одного микрограмма на миллилитр в буфере окрашивания FFA.Флик FFA мыть буфер из пластин, и добавить 50 микролитров первичного антитела в FFA окрашивания буфера для каждой хорошо. Затем запечатать пластины с Parafilm, или пластиковой пленкой, и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Подготовка вторичного идти анти-мышь HRP помечены антитела в концентрации от одного до 5000 в FFA окрашивания буфера.После удаления раствора антител, мыть клетки три раза с 150 микролитров FFA мыть буфер на колодец. Удалите буфер мытья, щелкивая в раковину каждый раз. Пятно клеток со вторичным антителом в буфере окрашивания FFA на 50 микролитров на колодец и инкубировать один-два часа при комнатной температуре.После этого, мыть клетки три раза с FFA мыть буфер, опять же, удаление мыть буфера, щелкивая в раковину каждый раз. Добавьте 50 микролитров субстрата TrueBlue в каждую колодец. Подождите от двух до 15 минут, пока пятна полностью определены с минимальным фоном.После того, как пятна видны, мыть осторожно с водой, используя руку, чтобы оградить монослой от силы воды работает. Нажмите сухой на бумажные полотенца. Вскоре после этого используйте область вскрытия для ручного подсчета пятен в каждой из них или с использованием автоматизированного точечного счетчика.В программном обеспечении ImmunoCapture выберите разбавление с легко различимым очагом от 20 до 200 на скважину для каждого образца и вычислите титер в фокус-образующих единицах на миллиметр, используя среднее значение дублирующих скважин. В этом эксперименте вирусная нагрузка была показана в тканях периферической и центральной нервной систем после того, как мышам Ифнара подкожно дали вирус Зика. Предел обнаружения был от 100 до 500 ФФУ на грамм, на основе органа.При выполнении фокус-образного анализа технические ошибки могут привести к неоптимальным результатам. Токсичность органов, обусловленная высокой концентрацией печени, изменила чувствительность анализа. Когда вирусный титр в органе был ниже, чем токсичность, FFA не может точно записывать вирусные титры.Клетки почек иллюстрировали токсичность с высокой концентрацией органов, но были преодолены вирусным титером при низких концентрациях органов. Энергичный пипетки или стирки может удалить монослой, что приводит к потерянным данным неточной отчетности titer результатов. Волокна или волосы, которые присутствуют в лаборатории скамейке абсорбентной бумаги, может загрязнять отдельные скважины и вызвать значительные ошибки при использовании автоматизированной программы подсчета.Плотность клеток является еще одной проблемой, которая может существенно повлиять на успех фокус-формы анализа. Клетки с примерно 60%-ным слиянием в начале анализа, по сравнению с клетками, потрохающимися при 90%-м слиянии, показали драматическую разницу, влияя на фокус-формируя анализ. Планирование размера и масштабов эксперимента таким образом, чтобы сбор органов был завершен эффективно, является наиболее важной частью процедуры, а затем, начиная фокус-формы анализа с высоким качеством клеток.Эта процедура была использована для количественной оценки вируса для нескольких вирусных семейств. Этот протокол также может быть адаптирован для проверки терапевтических соединений и количественно нейтрализации титеров антител. Эти методы используются для количественной оценки живого вируса, и соответствующие меры безопасности должны быть приняты в соответствии с руководящими принципами, изложенными в BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1- / - мышей

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Количественное определение антител зависимых повышение Зика вируса в первичных клеток человека

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...