Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Dr Pinto finansieras av ett frö bidrag från Saint Louis University School of Medicine och Startup medel från Saint Louis University School of Medicine. Dr Brien finansieras av en K22AI104794 Early Investigator Award från NIH NIAID samt ett frö bidrag från Saint Louis University School. För alla finansierade individer hade finansiärer ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.

Alla procedurer i denna studie är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av St. Louis University djuromsorg och användning kommittén. SLU är fullt ackrediterad av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International (AAALAC).
1. organ isolering
Anmärkning: Viruset är inte stabilt vid rumstemperatur (RT) så antalet djur som skördas på en gång måste planeras noggrant för att bevara virala titrar.
<...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV-infektion kan orsaka en neurologisk sjukdom därför den nuvarande djurmodeller för att studera patogenes, immunsvar och skyddande effekt av vacciner och antivirala läkemedel måste fokusera på viral kontroll inom CNS. En av utmaningarna med att fokusera på CNS-sjukdom är att det ofta kommer på bekostnad av att studera perifer infektion. De organ isoleringsmetoder som föreslås här fokuserar på behovet av att snabbt utvärdera ZIKV infektion i både periferin och CNS för att bedöma CNS-medierad ZIKV assoc...

Zika virus (ZIKV) är ett arbovirus som tillhör familjen Flaviviridae, som innehåller viktiga neuroinvasiva humana patogener såsom Powassan virus (POWV), japanskt encefalit virus (JEV), och West Nile virus (WNV)1. Efter dess isolering och identifiering har det förekommit periodiska rapporter om humana zikv-infektioner i Afrika och Asien2,3,4,5och epidemier inom Central-och Sydamerika (ses över i referens6). Det var dock inte förrän nyligen som ZIKV ansågs orsaka allvarlig sjukdom7. Nu finns det tusentals fall av neurologiska sjukdomar och fosterskador kopplade till ZIKV infektioner. Den snabba uppkomsten av ZIKV har föranlett många frågor om: varför det finns en ökning av sjukdomens svårighetsgrad, vad är det immunologiska svaret på ZIKV-infektion och finns det virala och/eller immunmedierade patologier kopplade till ökningen av neurologiska manifestationer och fosterskador. Det finns nu bråttom att förstå den centralanervsystemet (CNS) relaterade sjukdom i samband med ZIKV samt behovet av att snabbt testa effekten av antivirala läkemedel och vacciner mot ZIKV. Det är mot denna bakgrund som vi har utvecklat metoder för snabb analys av ZIKV-titrar i både periferi och CNS med hjälp av en ZIKV-specifika fokus bildar analyser (FFA).
Små djurmodeller är viktiga för att förstå sjukdomsprogression och för tidig utvärdering av vacciner, Therapeutics och antivirala läkemedel. Vi har etablerat små djurmodeller för studiet av arbovirus sjukdom genom att använda olika mus stammar för att modellera mänsklig infektion och skydd mot virala patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Med denna tidigare erfarenhet började vi ändra tekniker som används för bedömning av wNv och Dengue virus, ett relaterat och för bedömning av zikv titer i både perifera organ samt CNS21,23, 24. fördelarna med dessa metoder framför andra analyser är: 1) att de kombinerar förmågan att skörda både PERIFERA och CNS-organ för analys; 2) metoderna är anpassningsbara för flödescytometri, för mätningar av medfödda och adaptiva immunsvar, tillsammans med virala titrar på samma djur i samma organ; 3) skörde tekniken är anpassningsbar för histologisk analys; 4) den ZIKV FFA är en snabb hög genomströmning metod för viral titer analys; och 5) dessa metoder kan tillämpas för bedömning av virala titrar i organ av djur infekterade med de flesta patogener25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

De metoder som presenteras visar laboratorie procedurer för isolering av organ från Zikavirusinfekterade djur och kvantifiering av virusbelastningen. Syftet med förfarandet är att kvantifiera virala titrar i perifera och CNS områden av musen vid olika tidpunkter efter infektion eller under olika experimentella förhållanden för att identifiera virologiska och immunologiska faktorer som reglerar zikavirus infektion. De organ isolerings procedurer som påvisats möjliggör både kvantifiering av fokus formning och kvantitativ PCR-bedömning av virala titrar. Teknikerna för snabb organ isolering är utformade för att bevara virus titer. Viral titer kvantifiering genom fokus formning assay möjliggör snabb genomströmning bedömning av zika virus. Fördelen med fokus bildar analysen är bedömningen av smittsamma virus, begränsningen av denna analys är potentialen för organtoxicitet minska detektionsgränsen. Viral titer-bedömning kombineras med kvantitativ PCR, och med hjälp av ett rekombinant RNA Copy-kontroll virus arvs kopienummer inom orgeln bedöms med låg detektionsgräns. Sammantaget ger dessa tekniker en exakt snabb, hög genomflödesteknik för analys av zikaviruxtitrar i periferin och CNS hos zika-virusinfekterade djur och kan appliceras på bedömningen av virala titrar i organen hos djur som infekterats med de flesta patogener, inklusive denguevirus.

För att utvärdera zikv-titrar med hjälp av protokollet som beskrivs ovan Ifnar1-/- möss var infekterade med zikv (PRVABC59) via subkutan (SC) injektion till footpad. Här, administrationen av 1 x 105 FFU av zikv till 8-12 vecka gamla Ifnar1-/- möss SC är inte dödlig men viruset kan replikera i både periferi och CNS. Denna dos och väg används för att studera värd patogen immunsvar och patogenicitet. Administrering av 1 x 10<su...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering och kvantifiering av zikavirus från flera organ i en mus

Målet med protokollet är att demonstrera de tekniker som används för att undersöka virussjukdom genom att isolera och kvantifiera zikaviruset, från flera organ i en mus efter infektion.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

I denna video beskriver vi en uppsättning förfaranden som syftar till att förhöra effekterna av en virusinfektion och den resulterande immunologiska svar med hjälp av en Murine modell av Zika infektion. Detta protokoll är betydande eftersom det tillåter oss att utveckla en mekanistisk förståelse av infektion och immunitet genom att identifiera i vilken utsträckning ett virus har spridit sig i hela kroppen, transversing fysiska hinder och tillgång till vävnader. Dessa tekniker möjliggör en detaljerad förståelse av viral patogenes och ger möjlighet att dissekera den mekanism av skydd som ges av vacciner eller therapeutics.Här visar vi denna metod med zikavirusinfektion av möss, men denna metod kan tillämpas på en rad virusinfektioner inklusive andra flavivirus som Dengue virus och alfavirus som Chikungunya virus. Skörd organ i centrala nervsystemet kan vara utmanande, så det är viktigt för en person att planera ett litet experiment, och vara beredd att öva de tekniker i förväg. Detta protokoll möjliggör snabb dissekering av viral spridning inom små djurmodeller med möjlighet att visualisera, fånga och lagra experimentella data.Det är viktigt att visuellt demonstrera denna metod för att göra det möjligt för försökskan att förstå hur man skördar centrala nervsystemet organ. Det är också viktigt att se nivån av cellkonfluensan och intensiteten i virala foci. Till att börja med använda tensor för att ta bort skinnet av den infekterade musen.Halshugga musens huvud med en sax, följt av avlägsnande av armar och ben. För att skörda hjärnan, använd tandade La Grange sax för att skära skallen genom foramen magnum. Skala av skallen med trings, och skopa ut hjärnan med en spatel.Med hjälp av stark avtrubbad sax, ta bort benet som omger ryggraden, sedan skär över bäckenbenet för att exponera kota foramen på ländryggen nivå. Sedan, ta bort så mycket muskler som möjligt kring ryggraden. Placera försiktigt nålens fasade spets inuti kotans foramen, undvik för högt tryck för att förhindra att nålen inkräktar på kotkroppen.Håll kraftigt för att utöva tryck på kotkroppen och nålen, och tryck på sprutkolven för att driva ut sladden i petriskålen. Omedelbart överföra ryggmärgen i det märkta röret, och placera i torrisbadet för ytterligare homogenisering. För homogenisering, tillsätt en milliliter av DMEM och homogenisera provet i en BeadBeater.Efter att säkerställa organ homogeniseras, centrifug och alikvot prover på is och lagra i minus 80 grader Celsius tills det behövs. På dagen för analysen, ta bort de homogeniserade proverna från minus 80 grader Celsius frys, och låt dem tina. Med proverna på is, späd Zika virus tiofaldigt i den första brunnen av utspädningsplattan och använda en flerkanalig pipett för att göra tiofaldiga serieutspädningar ner plattan, ändra tips varje gång.Genom att lägga till 20 mikroliter prov i 180 mikroliter tillväxtmedia, byt pipettspetsar mellan varje utspädning. Förbered fokusformningsplattan genom att ta bort media från den förberedda platta botten 96-brunnsplattan som täcker viroceller. För att monolayer inte ska torka ut, tillsätt omedelbart 100 mikroliter av virusutspädningen till varje brunn i viroplattan.Använd samma uppsättning tips för att lägga från den lägsta till den högsta koncentrationen. Rock platta sida till sida två till fyra gånger och inkubera vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i en till två timmar. Värm upp 2%metylcellulosa till rumstemperatur.Späd sedan ut 2%metylcellulosalösningen i tillväxtmedia vid ett förhållande av cirka två till ett. Efter inkubation, tillsätt 125 mikroliter av metylcellulosatillväxtmediet till varje brunn av 96-brunnsplattorna. Inkubera igen vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i 32 till 40 timmar.För att fixera virocellerna, i en biosäkerhet skåp lägga 50 mikroliter av 5%paraformaldehyd över toppen av metylcellulosaskiktet i varje brunn av 96-brunns plattor. Inkubera i 60 minuter i rumstemperatur. Alternativt, täck plattorna med Parafilm och placera dem på fyra grader Celsius över natten.Därefter använder du en pipett för att ta bort överlagring och media från celler till en engångsbehållare inuti biosäkerhetsskåpet. Tvätta försiktigt med 150 mikroliter PBS per brunn. Ta bort PBS från plattorna och ta bort plattan från biosäkerhetsskåpet.Upprepa PBS tvätta två gånger, tillsätt sedan 150 mikroliter per brunn en gång FFA tvätt buffert och låt i rumstemperatur i fem till 10 minuter att genomsyra de fasta cellerna. Därefter använder primära Zika antikropp för att upptäcka infektion. Förbered den primära antikroppen 4G2 vid en koncentration av ett mikrogram per milliliter i FFA-infärgningsbuffert.Flick FFA tvättbuffert från plattorna, och tillsätt 50 mikroliter av den primära antikroppen i FFA färgning buffert till varje brunn. Sedan försegla plattorna med Parafilm, eller plastfilm, och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Förbered den sekundära gå anti-mus HRP märkt antikropp vid en koncentration av en till 5, 000 i FFA färgning buffert.Efter att ha tagit bort antikroppslösningen, tvätta celler tre gånger med 150 mikroliter FFA tvätta buffert per brunn. Ta bort tvättbufferten genom att snärta i diskhon varje gång. Fläck cellerna med den sekundära antikroppen i FFA färgning buffert på 50 mikroliter per brunn och inkubera en till två timmar vid rumstemperatur.Efter det tvätta celler tre gånger med FFA tvätt buffert, igen, ta bort tvätt buffert genom att snärta i diskhon varje gång. Lägg till 50 mikroliter av TrueBlue Substrat i varje brunn. Vänta två till 15 minuter tills fläckar är helt definierade med minimal bakgrund.När fläckarna är synliga, tvätta försiktigt med vatten med hjälp av en hand för att skydda monolayer från kraften i vattnet som rinner. Knacka torrt på hushållspapper. Strax efter, använd en dissekera omfattning för att räkna manuellt fläckarna i varje brunn, eller använda en automatiserad dekorräknare.I programmet ImmunoCapture väljer du en utspädning med lättskild foci mellan 20 till 200 per brunn för varje prov och beräkna titer i fokusbildande enheter per millimeter med hjälp av medelvärdet av duplicerade brunnar. I detta experiment visades virusbördan i vävnaderna i perifera och centrala nervsystemet efter att Ifnar-mössen fick Zika-virus subkutant. Gränsen för detektion var mellan 100 till 500 FFU per gram, baserat på organ.När du utför den fokusbildande analysen kan tekniska misstag resultera i suboptimala resultat. Organtoxicitet, driven av hög koncentration av lever, förändrade analysens känslighet. När viral titer i organet var lägre än toxicitet, FFA kunde inte exakt spela in viral titers.Njure celler illustrerade toxicitet med hög organ koncentration men övervanns av den virala titer vid låga organ koncentrationer. Kraftig pipettering eller tvätt kan ta bort monolayer, vilket leder till förlorade data felaktig rapportering av titer resultat. Fibrer eller hår som finns i lab bänk absorberande papper, kan förorena enskilda brunnar och orsaka betydande fel om du använder en automatiserad räkna program.Celltäthet är en annan fråga, som dramatiskt kan påverka framgången för en fokus-formning assay. Celler vid ungefär 60%konfluency vid starten av analysen, jämfört med celler pläterade vid 90%konfluency, visade dramatisk skillnad som påverkar den fokusbildande analysen. Planering av storlek och omfattning av experimentet så att orgel skörden är klar effektivt, är den viktigaste delen av förfarandet, följt av att starta fokus-formning assay med hög kvalitet celler.Denna procedur har använts för att kvantifiera virus för flera virus familjer. Detta protokoll kan också anpassas till skärmen för terapeutiska föreningar och kvantifiera neutraliserande antikroppstiter. Dessa tekniker används för att kvantifiera levande virus och lämpliga säkerhetssteg bör vidtas enligt de riktlinjer som anges i BMBL.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zikaviruset specifika diagnostiska epitop Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flödescytometri baserat test för att bestämma In Vitro antikropp beroende förbättring av denguefeber Virus använder Zika Virus konvalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Utvärdering av Zika Virus-specifika T-cell svar i Immunoprivileged organ av infekterade Ifnar1- / - möss

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifiering av antikroppsberoende förbättring av zikaviruset i primära mänskliga celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...