Name: isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Dr. Pinto, Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden bir tohum bağışı ve Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden başlangıç fonları ile finanse edilmektedir. Dr. Brien, NIH NIAID'in K22AI104794 erken araştırmacı ödülü ve Saint Louis Üniversitesi Okulu'ndan bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir. Finanse edilen tüm bireyler için fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Bu çalışmanın tüm prosedürleri St. Louis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur. SLU, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiştir.
1. Organ İzole
NOT: Virüs oda sıcaklığında (RT) stabil değildir, bu nedenle bir seferde hasat edilen hayvan sayısı viral titreleri korumak için dikkatlice planlanma...

<ol>
	<li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus:+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere.">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li><li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Man.">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li><li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora,+Nigeria.">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li><li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda.">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li><li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda:+a+serological+survey+in+Karamoja+district,+1984.">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li><li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history+of+a+newly+emerging+arbovirus.">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas.">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li><li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection.">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li><li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus.">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1.">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-1+(IRF-1)+shapes+both+innate+and+CD8(+)+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection.">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8++T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection.">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus.">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li><li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity.">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice.">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li><li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection.">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection.">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae,+Bunyaviridae,+and+Filoviridae+Families.">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis.">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li><li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection.">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).</li><li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection.">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li><li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice.">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li></ol>

ZIKV enfeksiyonu nörolojik bir hastalığa neden olabilir bu nedenle mevcut hayvan modellerinin patogenezi, immün yanıtları ve aşıların ve antivirallerin koruyucu etkinliğini incelemesi cns içinde viral kontrole odaklanması gerekir. CNS hastalığına odaklanmanın zorluklarından biri de genellikle periferik enfeksiyonu nitreşme pahasına gelmesidir. Burada önerilen organ izolasyon yöntemleri, CNS aracılı ZIKV ilişkili hastalığı değerlendirmek ve antivirallerin preklinik test için bir model oluştur...

Zika virüsü (ZIKV) flaviviridae ailesine ait bir arbovirüstür, Powassan virüsü gibi önemli nöroinvaziv insan patojenleri içeren (POWV), Japon ensefalit virüsü (JEV), ve Batı Nil virüsü (WNV)1. İzolasyon ve tanımlamasının ardından, Afrika ve Asya'dainsan ZIKV enfeksiyonlarının periyodik raporları 2 ,3,4,5, ve Orta ve Güney Amerika'daki salgınhastalıklar ( referans6). Ancak, yakın zamana kadar ZIKV ciddihastalığaneden olduğu düşünüldü 7 değildi . Şimdi zikv enfeksiyonları ile bağlantılı nörolojik hastalık ve doğum kusurları vakaları binlerce vardır. ZIKV'nin hızlı bir şekilde ortaya çıkışı ile ilgili birçok soru yöneltti: neden hastalığın şiddetinde bir artış var, ZIKV enfeksiyonuna immünolojik yanıt nedir ve nörolojik artışa bağlı viral ve/veya immün aracılı patolojiler vardır? belirtileri ve doğum kusurları. Artık ZIKV ile ilişkili merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkili hastalığı ve antivirallerin ve aşıların ZIKV'e karşı etkinliğini hızla test etme ihtiyacının anlaşılması için acele vardır. Zikv'e özgü odak lama tahlilleri (FFA) kullanarak hem çevre de hem de CNS'de ZIKV titrelerinin hızlı analizi için yöntemler geliştirdiğimiz bu zemine aykırıdır.
Küçük hayvan modelleri hastalığın ilerlemesini anlamak ve aşıların erken değerlendirilmesi için önemlidir, terapötik, ve anti-viral. Biz arbovirüs hastalığı nın çalışması için insan enfeksiyonu ve viral patojenlere karşı koruma modellemek için çeşitli fare suşları kullanarak küçük hayvan modelleri kurduk8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Bu önceki deneyimi kullanarak, wnv ve Dang virüsü, hem periferik organlarda zikv titresinin değerlendirilmesi için ilgili bir flavivirüs değerlendirilmesi için kullanılan teknikleri değiştirmeye başladı hem de CNS21,23, 24- Bu yöntemlerin diğer tahlillere göre avantajları şunlardır: 1) analiz için hem periferik hem de CNS organlarını toplama yeteneğini birleştirdikleri; 2) yöntemleri akış sitometri için uyarlanabilir, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları ölçümleri için, aynı organda aynı hayvan üzerinde viral titreler ile birlikte; 3) hasat tekniği histolojik analiz için uyarlanabilir; 4) ZIKV FFA viral titreşme analizi için hızlı bir yüksek iş elde yöntemidir; ve 5) bu yöntemler en patojenler 25 ile enfekte hayvanlarınorganlarında viral titrelerin değerlendirilmesi için uygulanabilir .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BD 309642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-557-145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20cc syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 tube beadmill</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15 340 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm stainless steel beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9084634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C Tissue Culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96well round bottom plates</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>TP92697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basix 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Germicidal Bleach</td>
			<td>Staples</td>
			<td>30966CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Analyzer</td>
			<td>CTL</td>
			<td>CTL S6 Universal Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose With 4500 mg/L glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>e7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11036-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>537020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP-labeled antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>8924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (molecular biology-grade)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/Xylazine cocktail</td>
			<td>Comparative Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>g7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magmax RNA purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Ependorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniCollect 0.5ml EDTA tubes</td>
			<td>Bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-ring tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>one step q RT-PCR mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4392938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EMS- 15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>d8537-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline multichannel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>72230/72240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline single channel pipettes</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol BD</td>
			<td>MRC gene</td>
			<td>RB192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>s7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spoon/spatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight cutting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Blue Substrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95059-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of zika virus from multiple organs in a mouse

Sunulan yöntemler, zika virüsü bulaşmış hayvanlardan organların izole edilmesi ve viral yükün ölçülmesi için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, zika virüs enfeksiyonunu düzenleyen virolojik ve immünolojik faktörleri belirlemek için farklı zaman noktalarında veya farklı deneysel koşullar altında farenin periferik ve CNS bölgelerindeki viral titreleri ölçmektir. Organ izolasyon prosedürleri hem odak lama nın hem de viral titrelerin kantitatif PCR değerlendirmesine olanak sağladığını göstermiştir. Hızlı organ izolasyon teknikleri virüs titresinin korunması için tasarlanmıştır. Odak oluşturarak analiz ile viral titreme quantification Zika virüsünün hızlı iş lenme değerlendirmesi için izin verir. Odak oluşturan testin yararı bulaşıcı virüsün değerlendirilmesidir, bu sadenin sınırlandırılması, tespit sınırını azaltan organ toksisitesi potansiyelidir. Viral titre değerlendirmesi kantitatif PCR ile birleştirilir ve organ içinde rekombinant RNA kopya kontrol viral genom kopya numarası kullanılarak algılama düşük sınırı ile değerlendirilir. Genel olarak bu teknikler, Zika virüsü enfekte hayvanların çevre ve CNS'lerinde Zika viral titrelerinin analizi için doğru bir hızlı yüksek iş elde etme yöntemi sağlar ve en çok enfekte olmuş hayvanların organlarındaki viral titrelerin değerlendirilmesinde uygulanabilir. patojenler, Dang virüsü de dahil olmak üzere.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak ZIKV titrelerini değerlendirmek için Ifnar1-/- farelerayak altına deri altı (SC) enjeksiyonu ile ZIKV (PRVABC59) ile enfekte olmuşlardır. Burada, 8-12 haftalık Ifnar1-/- fareler SC zikv 1 x 105 FFU uygulanması öldürücü değildir ama virüs hem çevre ve CNS çoğalabilir. Bu doz ve rota konak patojen immün yanıtları ve patojenite çalışma için kullanılır. 8-12 haftalık ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse at JoVE.com

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Bu videoda, zika enfeksiyonunun Murine modelini kullanarak viral bir enfeksiyonun etkisini ve bunun sonucunda ortaya çıkan immünolojik yanıtı sorgulamak için tasarlanmış bir dizi prosedürü açıklıyoruz. Bu protokol önemli, çünkü bir virüsün vücuda ne kadar yayıldığını belirleyerek, fiziksel engelleri tersine çevirerek ve dokulara erişerek mekanik bir enfeksiyon ve bağışıklık anlayışı geliştirmemize olanak sağlar. Bu teknikler viral patogenezin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve aşılar veya terapötikler tarafından sağlanan koruma mekanizmasını inceleme olanağı sağlar.Burada farelerin Zika virüs enfeksiyonu kullanarak bu yöntemi göstermek, ancak bu yöntem Dang virüsü ve Chikungunya virüsü gibi alfavirüsler gibi diğer flaviviruses dahil viral enfeksiyonlar bir dizi uygulanabilir. Merkezi sinir sisteminin organları hasat zor olabilir, bu yüzden bir kişi için küçük bir deney planlamak için önemlidir, ve önceden teknikleri uygulamaya hazır olmak. Bu protokol, deneysel verileri görselleştirme, yakalama ve depolama yeteneği ile küçük hayvan modelleri içinde viral yayılmanın hızlı bir şekilde diseksiyonuna olanak sağlar.Deneycinin merkezi sinir sistemi organlarını nasıl hasat edineceklerini anlamasını sağlamak için bu yöntemi görsel olarak göstermek önemlidir. Ayrıca hücre biraraya gelen düzeyini ve viral foci yoğunluğunu görmek önemlidir. Başlamak için, enfekte farenin postkaldırmak için forceps kullanın.Makas ile farenin başını decapitate, kol ve bacaklar kaldırılması takip. Beyni hasat etmek için, tırtıklı La Grange makasını kullanarak kafatasını foramen magnumundan kes. Kafatasını ponplarla soyup spatulayla beyni dışarı çıkar.Güçlü körplü makas kullanarak, omurga çevreleyen kemik kaldırmak, sonra lomber düzeyde vertebrafori açığa çıkarmak için pelvik kemik boyunca kesti. Sonra, omurilik çevreleyen mümkün olduğunca çok kas çıkarın. Dikkatle, iğnenin beli ucunu vertebraforamen'in içine yerleştirin, iğnenin omur gövdesine izinsiz girmesini önlemek için aşırı basınçtan kaçınArak.Vertebral vücut ve iğne üzerinde baskı uygulamak için güçlü tutun ve petri kabına kordon uçıkarmak için şırınga piston basın. Hemen etiketli tüp omurilik transferi, ve daha fazla homojenizasyon için kuru buz banyosu yerleştirin. Homojenizasyon için, bir mililitre DMEM ekleyin ve numuneyi beadBeater'da homojenize edin.Organların homojenleştirilmesini sağladıktan sonra, santrifüj ve aliquot örnekleri buz üzerinde ve eksi 80 santigrat derece de gerekli kadar saklayın. Test günü, eksi 80 santigrat derece dondurucudan homojenize örnekleri çıkarın ve çözülmelerine izin verin. Buz daki numunelerle, Zika virüsünü seyreltme plakasının ilk kuyusuna on kat seyreltin ve her seferinde uçlarını değiştirerek plakadan on kat seri seyreltme yapmak için çok kanallı bir pipet kullanın.180 mikrolitre lik büyüme ortamına 20 mikrolitre numune ekleyerek, her seyreltme arasındaki pipet uçlarını değiştirin. Virohücreleri kaplayan hazırlanmış düz alt 96 kuyulu plakadan ortamı çıkararak odak şekillendirme plakasını hazırlayın. Tek katmanın kurumasını önlemek için viroplate'teki her kuyuya hemen 100 mikrolitre virüs seyreltme ekleyin.En düşükten en yüksek konsantrasyona eklemek için aynı ipuçları kümesini kullanın. Kaya plakası yan yana 2-4 kez ve 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca %5 karbondioksit le kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığına% 2 metilselüloz Kadar ısıtın.Daha sonra, büyüme ortamındaki %2'lik metilselüloz çözeltisini yaklaşık 2'ye bir oranında seyreltin. Kuluçkadan sonra, 96 kuyulu plakaların her kuyuya 125 mikrolitre metilselüloz büyüme ortamı ekleyin. 32-40 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede tekrar kuluçkaya yat.Virohücreleri düzeltmek için, bir biyogüvenlik kabininde 96-iyi plakalar her kuyuda metilselüloz tabakasının üstüne% 5 paraformaldehit 50 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yat. Alternatif olarak, Parafilm ile plakaları kaplayın ve bir gecede dört derece santigrat yerleştirin.Bundan sonra, bindirme kaldırmak için bir pipet kullanın ve biyogüvenlik kabini içinde tek kullanımlık bir kap içine hücreleri kapalı medya. Kuyu başına 150 mikrolitre PBS ile hafifçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı biyogüvenlik kabininden çıkarın.PBS yıkama iki kez tekrarlayın, sonra iyi bir kez FFA yıkama tampon başına 150 mikrolitre ekleyin ve sabit hücreleri permeabilize beş ila 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, enfeksiyonu tespit etmek için birincil Zika antikorkullanın. FFA boyama tamponu mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda birincil antikor 4G2 hazırlayın.Flick FFA yıkama tampon plakaları, ve her kuyuya FFA boyama tampon birincil antikor 50 mikrolitre ekleyin. Sonra Parafilm, ya da plastik film ile plakaları mühür ve dört derece santigrat gecede kuluçka. FFA boyama tampon 1-5, 000 konsantrasyonda ikincil gitmek anti-fare HRP etiketli antikor hazırlayın.Antikor çözeltisi çıkardıktan sonra, iyi başına 150 mikrolitre FFA yıkama tampon ile hücreleri üç kez yıkayın. Her seferinde lavaboya basarak yıkama tamponu çıkarın. Hücreleri FFA boyama tamponundaki ikincil antikorla iyi de 50 mikrolitre de lekelendirin ve oda sıcaklığında bir ila iki saat kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, FFA yıkama tampon ile hücreleri üç kez yıkayın, tekrar, lavaboya her zaman flicking tarafından yıkama tampon kaldırarak. Her kuyuya 50 mikrolitre TrueBlue Substrat ekleyin. Noktalar en az arka planla tam olarak tanımlanana kadar 2 ila 15 dakika bekleyin.Lekeler görünür olduktan sonra, akan suyun kuvvetinden monolayer kalkan bir el kullanarak su ile yavaşça yıkayın. Kağıt havlular üzerine kuru dokunun. Kısa bir süre sonra, her kuyudaki noktaları el ile saymak için bir kesme dürbünü kullanın veya otomatik bir nokta sayacı kullanın.ImmunoCapture yazılımında, her numune için kuyu başına 20 ila 200 arasında kolayca ayırt edilebilir bir foci ile seyreltme seçin ve yinelenen kuyuların ortalamasını kullanarak milimetre başına odak oluşturan birimlerde titreyi hesaplayın. Bu deneyde Ifnar farelere Zika virüsü deri altında verildikten sonra periferik ve merkezi sinir sistemi dokularında viral yük gösterilmiştir. Algılama sınırı organa bağlı olarak gram başına 100 ila 500 FFU arasındaydı.Odak oluşturma testini gerçekleştirirken, teknik hatalar optimal olmayan sonuçlara neden olabilir. Organ toksisitesi, karaciğer yüksek konsantrasyontarafından tahrik, töz duyarlılığını değiştirdi. Ne zaman organda viral titretoksisite daha düşüktü, FFA doğru viral titreleri kaydedemedi.Böbrek hücreleri yüksek organ konsantrasyonu ile toksisite resimli ama düşük organ konsantrasyonlarında viral titreyen tarafından üstesinden geldi. Güçlü pipetleme veya yıkama, tek katmanı kaldırarak, titresonuçlarının yanlış raporlanmasına neden olan verilerin kaybolmasına yol açabilir. Laboratuvar tezgah emici kağıt mevcut lifler veya tüyler, bireysel kuyular kontamine ve otomatik bir sayma programı kullanıyorsanız önemli hatalara neden olabilir.Hücre yoğunluğu önemli ölçüde bir odak oluşturan tsay başarısını etkileyebilir başka bir konudur. Tetkikin başlangıcında yaklaşık %60'lık bir araya gelen hücreler, %90'lık bir kesişme noktasında ki hücrelerle karşılaştırıldığında, odak oluşturan tayı etkileyen dramatik bir fark göstermiştir. Organ hasadının verimli bir şekilde tamamlanması için deneyin boyutunu ve kapsamını planlamak, işlemin en önemli parçasıdır ve ardından yüksek kaliteli hücrelerle odak oluşturma telbettei başlar.Bu prosedür birden fazla viral aileler için virüs ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol aynı zamanda terapötik bileşikler için ekrana adapte edilebilir ve nötralize antikor titreleri ölçmek. Bu teknikler canlı virüsü niçin ölçülebilir ve BMBL'de belirtilen kurallara uygun güvenlik adımları atılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...