Name: assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and F

نود أن نشكر مرفق التصوير التحليلي (AIF) في كلية ألبرت أينشتاين للطب على دعم التصوير. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من NCI (P30CA013330، CA150344، CA 100324 و CA216248)، وSIG 1S10OD019961-01، ومركز Gruss-Lipper Biophotonics وبرنامج التصوير المتكامل الخاص به، ومونتيفيوري روث L. Kirschstein T32 منحة التدريب من الجراحين لدراسة البيئة الدقيقة الورم (CA200561).

شارك GSK في كتابة المخطوطة، وأنجز التصوير للشكل 1C و3B، ووضع بروتوكول تحليل الأنسجة الثابتة، وتحليل وتفسير جميع البيانات؛ شارك JMP في كتابة المخطوطة، وأجرى الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 1B و 2C و 3A؛ أجرى LB & AC الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 2B; أجرت الملكية الأردنية الجراحة والتصوير داخل الحيوية للرقم 2A. شاركت هيئة الأوراق المالية في كتابة المخطوطة وتحليل جميع البيانات وتفسيرها؛ شاركت المنظمة في كتابة المخطوطة وتحليل جميع البيانات وتفسيرها؛ وأجرى دي الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 2D، وشارك في كتابة المخطوطة، ووضع تحليل الأنسجة الثابتة وبروتوكولات التصوير داخل الحيوية، وتحليل وتفسير جميع البيانات.

ويجب إجراء جميع التجارب التي تستخدم الحيوانات الحية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المتعلقة بالاستخدام الحيواني والرعاية. تم تنفيذ الإجراءات الموضحة في هذه الدراسة وفقا للوائح المعاهد الوطنية للصحة فيما يتعلق برعاية واستخدام الحيوانات التجريبية وبموافقة كلية ألبرت أينشتاين للطب وال...

هنا، نقوم بالخطوط العريضة لاثنين من البروتوكولات التي يمكن تطبيقها لتصور وتحديد نوع معين من نفاذية الأوعية الدموية التي هي موجودة في مداخل TMEM ويرتبط مع تعطيل الأوعية الدموية ضيق وتقاطعات adherens. هذا النوع من نفاذية الأوعية الدموية عابرة وتسيطر عليها مركبالخلايا TMEM الثلاثي، ك?...

وقد كشفت التطورات الأخيرة في فهمنا للورم الانبثاث السرطاني أن الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) وتحريض التجمعات الفرعية الخلايا السرطانية المهاجرة / الغازية ليست، في حد ذاتها، كافية لنشر الهيماتوجينية 1.في الواقع، كان يعتقد سابقا أن الخلايا السرطانية المنتشرة intravasate من خلال كامل البطانة المرتبطة بالسرطان كما يتميز الورم neovasculature في كثير من الأحيان من قبل انخفاض تغطية pericyte، وعلى هذا النحو، هو نفاذية للغاية و غير مستقر2،3،4. على الرغم من أن الإيحاء الشديد للوظائف المعيبة داخل الورم، فإن تعديلات الأوعية الدموية أثناء التسرطن لا توفر دليلاً في حد ذاته على أن الخلايا السرطانية يمكن أن تخترق الأوعية الدموية بسهولة وبطريقة غير منضبطة. الرؤى من دراسات التصوير داخل الحيوية (IVI)، التي يتم فيها تمييز الخلايا السرطانية بشكل فلورسنت وتسمية الأوعية الدموية عن طريق الحقن الوريدي لتحقيقات الفلورسنت (مثل dextran أو نقاط الكم)، تبين أنه في حين أن الأوعية الورمية هي بشكل موحد نفاذية إلى انخفاض الوزن الجزيئي dextrans (على سبيل المثال 70 كيلوD)، وارتفاع الوزن الجزيئي dextrans (155 kD) والخلايا السرطانية يمكن عبور البطانة فقط في المواقع المتخصصة من intravasation التي تقع بشكل تفضيلي في نقطة فرع الأوعية الدموية5، 6 , 7.أظهرت التحليلات المناعية الكيميائية (IHC) باستخدام النماذج الحيوانية والمواد البشرية المشتقة من المرضى أن هذه المواقع هي "المداخل" التي تتخصص في تنظيم نفاذية الأوعية الدموية، محليا وعابرا، وتوفير نافذة قصيرة من فرصة للخلايا السرطانية المهاجرة / الغازية لدخول الدورة الدموية. وتسمى هذه المداخل "الورم microenvironment من الانبثاث" أو "TMEM"، ومن المتوقع تماما، كثافتها يرتبط مع زيادة خطر الإصابة بمرض النقيلي في مرضى سرطان الثدي8،9، 10.
يتكون كل مدخل TMEM من ثلاثة أنواع متميزة من الخلايا: الضامة المحيطة بالأوعية الدموية، وخلية الورم الإفراط في التعبير عن الثدييات البروتين الأكتين التنظيمية تمكين (مينا)، وخلية بطانة الرحم، وكلها في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض1، 5،9،10،11،12،13. الحدث الرئيسي لوظيفة TMEM كمدخل intravasation هو الإفراج المحلي من عامل النمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) على السفينة الكامنة من قبل الضامة المحيطة الوعائية14. VEGF يمكن تعطيل تقاطعات متجانسة بين الخلايا البطانية15،16،17،18،19، وهي ظاهرة تؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية عابرة ، أيضا المعروفة باسم "انفجار" نفاذية كما هو موضح في دراسات IVI 5. وقد ثبت أن الضامة TMEM للتعبير عن مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وهو مطلوب لوظيفة TMEM بوساطة VEGF وتحيةمن هذه الضامة إلى محراب ما قبل الأوعية الدموية 5،20،21 , 22.بالإضافة إلى تنظيم نشر الخلايا السرطانية وورم خبيث، وقد ثبت TIE2+ الضامة لتكون المنظمين المركزيين للورم الوعائي21،22،23، 24،25،26،27،28،29،30،31. على هذا النحو، TIE2+ الضامة تمثل مكونا حاسما من البيئة الدقيقة الورم والمنظم الرئيسي للشلال النقيلي.
لتحسين تصور نفاذية الأوعية الدموية التي يتم التوصل إليها بوساطة TMEM (أي "الانفجار")، من المهم جداً تمييزها عن الأساليب الأخرى لنفاذية الأوعية الدموية التي لا ترتبط بإنحلال تقاطعات الخلايا الخلوية البطانية. في البطانة سليمة (واحد الذي لا تتعطل تقاطعات ضيق ة وملتزمة)، وهناك ثلاثة أنواع رئيسية من نفاذية الأوعية الدموية: (أ) بينوسيتوسيل، والتي قد، أو قد لا، أن يقترن بتبديل المواد التي تم تناولها. (ب) نقل المواد عن طريق الفينستري البطانية؛ (ج) نقل المواد عبر المسار شبه الخلوي، الذي تنظمه تقاطعات ضيقة بطانةالرحم 15،16،17،18،19،32 , 33 , 34.على الرغم من إلغاء الضوابط التنظيمية في العديد من الأورام، وقد وصفت وسائط المذكورة أعلاه من نفاذية الأوعية الدموية في الغالب في سياق علم وظائف الأعضاء الأنسجة الطبيعية والتوازن، والتطرف منها هي الأنسجة مع نفاذية محدودة ( على سبيل المثال، حاجز الدم في الدماغ، حاجز الخصية في الدم)، أو نفاذية وفيرة (على سبيل المثال، الشعيرات الدموية المنفوية للجهاز الكبيبي الكلى)34،35،36،37.
باستخدام التصوير متعدد الأبعاد والتنظير المجهري المتعدد الفلورة المناعية، يمكننا التمييز بين نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM ("الانفجار") وغيرها من طرق نفاذية الأوعية الدموية في أورام الثدي. لتحقيق ذلك، نقوم بإجراء حقن ة واحدة عن طريق الوريد من وزن جزيئي عالي، مسبار مسمى بفلورسنت في الفئران. ويمكن بعد ذلك التقاط أحداث الانفجار التلقائي باستخدام التصوير داخل الحيوية في الفئران الحية. أو بدلا ً من ذلك، يمكن قياس التجاوز من التحقيق عن طريق دراسات التعريب المشترك مع الأوعية الدموية (على سبيل المثال CD31+ أو Endomucin+) ومداخل TMEM باستخدام الفحص المجهري الفلورة المناعية. وتصف البروتوكولات المعروضة هنا كلا الأسلوبين اللذين يمكن استخدامهما إما بصورة مستقلة أو بالاقتران مع بعضهما البعض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Anti-rabbit IgG (Alexa 488)</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies Corporation</td>
			<td style="width:155px;">A-11034</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rat IgG (Alexa 647)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate</td>
			<td>Eng Scientific Inc</td>
			<td>9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate Adhesive</td>
			<td>Henkel Adhesive</td>
			<td>1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran-Tetramethyl-Rhodamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endomucin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-65495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enrofloxacin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>84753076 v-06/2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fish Skin Gelatin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isofluorane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle (30 G)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pulse Oximeter</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quantum Dots</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>Q21561MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1310N14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMR (primary antibody)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>MP Biologicals</td>
			<td>TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>184835</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis

السبب الأكثر شيوعا للوفيات المرتبطة بالسرطان هو الانبثاث، وهي عملية تتطلب نشر الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى المواقع الثانوية. في الآونة الأخيرة، أنشأنا أن نشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي الأولي وفي المواقع النقيلية في الرئة لا يحدث إلا عند المداخل تسمى الورم MicroEnvironment من الانبثاث (TMEM). TMEM رقم المدخل هو التكهن لتكرار بعيد من المرض النقيلي في مرضى سرطان الثدي. وتتكون مداخل TMEM من خلية السرطان التي تعبر عن البروتين التنظيمية الأكتين مينا في اتصال مباشر مع الضامة المحيطة بالأوعية الدموية، proangiogenic الذي يعبر عن مستويات عالية من TIE2 وVEGF، حيث ترتبط كل من هذه الخلايا بإحكام إلى الدم خلية بطانة السفينة. يمكن للخلايا السرطانية أن تُدخل من خلال مداخل TMEM بسبب نفاذية الأوعية الدموية العابرة التي ينظمها النشاط المشترك للماكروفيج المرتبط بـ TMEM وخلية السرطان التي تعبر عن الشرق الأوسط وشمال أفريقيا والمرتبطة بـ TMEM. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقتين لتقييم نفاذية الأوعية الدموية العابرة التي يتم الاستفادة منها بوساطة TMEM: التصوير داخل الحيوية ومناعة الأنسجة الثابتة. وعلى الرغم من أن كلا الأسلوبين لهما مزاياهما وعيوبه، فإن الجمع بين الاثنين قد يوفر التحليلات الأكثر اكتمالاً لنفاذية الأوعية الدموية التي تتوسط فيها هذه الطريقة، فضلاً عن المتطلبات البيئية الدقيقة لوظيفة TMEM. وبما أن العملية النقيلية في سرطان الثدي، وربما أنواع أخرى من السرطان، تنطوي على نشر الخلايا السرطانية عبر مداخل TMEM، فمن الضروري استخدام أساليب راسخة لتحليل نشاط مدخل TMEM. توفر الطريقتان الموصوفتان هنا نهجاً شاملاً لتحليل نشاط مدخل TMEM، سواء في الحيوانات الساذجة أو المعالجة الدوائية، والتي لها أهمية قصوى في التجارب السابقة للإكلينيكي للعوامل التي تمنع الخلايا السرطانية النشر عن طريق TMEM.

وتتلخص الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذه المادة من البروتوكول بإيجاز وتوضح في الشكل 1ألف- جيم.
لقياس نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM ("نشاط الانفجار") والحد من الضوضاء التجريبية من طرق أخرى لنفاذية الأوعية الدموية (أي عبر الخلايا وشبه الخلوية، ك?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and F

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

تقييم البيئة الدقيقة للورم من الانبثاث المدخل بوساطة الأوعية الدموية المرتبطة بنشر الخلايا السرطانية باستخدام التصوير داخل الحيوية وتحليل الأنسجة الثابتة

نحن نصف طريقتين لتقييم نفاذية الأوعية الدموية العابرة المرتبطة بالورم المجهري من ورم وظيفة المدخل (TMEM) وintravasation الخلايا السرطانية باستخدام الحقن الوريدي من الوزن الجزيئي العالي (155 kDa) dextran في الفئران. وتشمل الأساليب التصوير داخل الحيوية في الحيوانات الحية وتحليل الأنسجة الثابتة باستخدام الفلورة المناعية.

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

هذه التقنيات التكميلية تقييم وقياس نفاذية الأوعية الدموية الورم باستخدام الوزن الجزيئي العالي Dextran. يوفر بروتوكول الأنسجة الثابتة تغطية أكبر للورم، وإنتاجية عالية، ولا يتطلب معدات تصوير متعددة الصور. من ناحية أخرى، يقدم بروتوكول التصوير داخل الرحم معلومات في الوقت الحقيقي حول الحركية، وظيفة، والتفاعل الديناميكي للخلايا في البيئة الدقيقة الورم من الانبثاث أو TMEM.حتى البروتوكولات المقدمة هنا تمكين القياس المباشر للنفاذية الوعائية TMEM تعتمد والتي ترتبط بقوة مع انتشار الخلايا السرطانية، وبالتالي يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتقييم الإمكانات النقيلي للأورام. لتوليد قطع من أنسجة الورم مناسبة للزرع، تبدأ مع القتل الرحيم من الفئران الحاملة للورم كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع طبق بيتري مع استزراع خلايا DMEM/F12 المتوسط على الجليد في غطاء الدخان.جلب الماوس إلى غطاء محرك الدخان وتطهير البطن الماوس مع 70٪ من الكحول الإيثيلي. باستخدام قفازات معقمة وأدوات جراحية، وإزالة الأورام ووضعها في طبق بيتري. قطع الورم إلى قطع صغيرة، والتخلص من أي أجزاء نخرية بينما هم في طبق بيتري.لزرع قطع الورم في المضيفين المتلقين، تخدير الفئران التي تم رفعها مع الخلايا الضامة المعدلة وراثيا، المسمى الفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص. تقليل التخدير إلى ما يقرب من 3٪ isofluorane وتطبيق مرهم العيون على عيون الماوس لمنع التجفيف. إزالة الشعر من أكثر من الغدة الثديية الرابعة من الماوس.بعد تنظيف الجلد مع مطهر، واستخدام أدوات تعقيم لجعل شق صغير ما يقرب من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات فقط أقل شأنا من الحلمة الرابعة. تشريح حتى يتم الكشف عن وسادة الدهون الثديية. خذ قطعة ورم من طبق بيتري ومعطف في مصفوفة اصطناعية خارج الخلية.زرع أورام تحت وسادة الدهون ماماري الرابعة. إغلاق شق باستخدام مادة لاصقة سيانوكريل. وأخيرا، إضافة ملليلتر واحد من المضادات الحيوية enrofloxacin إلى waters'drink.تخدير الماوس وإدخال القسطرة الوريدي الذيل كما هو موضح في بروتوكول النص. جعل شق خط الوسط الطولي بدءا من أعلى على الفور إلى الأعضاء التناسلية وحمل شق يصل إلى مستوى الجانب متفوقة من الغدة الثديية الرابعة. حمل شق عرضية إلى الجانب متفوقة من الغدة الثديية الرابعة.من المهم تجنب المساس بإمدادات الدم في هذه المرحلة. تحقيق الاستقرار في رفرف الجلد عن طريق لصق قطعة صغيرة من المطاط جامدة قياس اثنين في اثنين من السنتيمتر إلى جانب الجلد من رفرف. يجب أن تكون الأورام في وسط المنطقة التي استقرت بواسطة المطاط.تطبيق فيلم صغير من سيانوكريلات على الحافة الخارجية لإطار إطار التصوير المخصص. الآن تطبيق قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني إلى وسط الزجاج الغطاء. تجنب الاتصال بين سيانوكريلات على إطار النافذة وPBS على الزجاج لتجنب البلمرة المبكرة من سيانوكريلات.جفف أنسجة الرفرف المحيطة بها بمسح مختبري. قم بلصق نافذة التصوير الصغيرة على رفرف الأنسجة مع الورم في وسط الفتحة الواضحة. نقل الماوس تخدير والقسطرة الوريد الذيل إلى مرحلة المجهر.توخى الحذر الشديد لضمان عدم سقوط قسطرة الوريد الذيل. عند هذه النقطة، قم بإجراء التصوير داخل الرحم على المدى الطويل كما هو موضح في بروتوكول النص وفي منشور JoVE السابق. لتحليل أعلى إنتاجية وتغطية أكبر للورم، استخدم الفلوروسين المناعي في الأنسجة الثابتة لتقييم نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM.لأداء تلطّخ الفلورات المناعية، قم أولاً بإعداد العينات كما هو موضح في بروتوكول النص، ثم قم باسترجاع المستضد عن طريق تسخين الأجزاء المغمورة في سيترات بالقرب من نقطة الغليان لمدة 20 دقيقة. بعد السماح للعينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة، وغسل العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة دقيقتين كل غسل. كتلة لمدة 60 إلى 90 دقيقة في سد العازلة، ثم احتضان العينات مع خليط من الفئران الأولية والأجسام المضادة السريعة التي تستهدف endomucin و tetramethylrhodamine على التوالي.بعد الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات في PBST لمدة دقيقتين لكل منهما. عينات احتضان مع خليط من الأجسام المضادة حمار الثانوية ضد IgG الجرذان وIgG السريع، ثم غسل العينات ثلاث مرات في PBST لمدة دقيقتين لكل منهما. تنفيذ الروتين DAPI تلطيخ وتركيب الشرائح باستخدام الجلسرين خالية من التصاعد المتوسط الثابت.قم بتخزين العينات في مكان مظلم حتى المسح الضوئي. للحصول على أفضل النتائج، قم بمسح الشرائح على ماسح ضوئي رقمي كامل الشريحة. لإجراء تحليل الصورة، التقط 10 حقول عالية الطاقة لكل حالة باستخدام أي برنامج مناسب لعلم الأمراض الرقمية.حفظ قنوات إندوموسين وTMR بشكل منفصل كـ TIFF. باستخدام ImageJ، قم بتحميل ملفات TIFF وتحويلها إلى صور 8 بت. الحد من الصور 8 بت إلى مستوى التحكم السلبي وتوليد صورتين binarized تظهر أقنعة إندوموسين و TMR.من الأدوات الثنائية، حدد تعبئة الثقوب على قناع إندوموسين. توليد الصورة Dextran thresholded وحفظه كما Dextran ROI. أيضا، توليد صورة endomucin thresholded وحفظها كما العائد على الاستثمار الأوعية الدموية وتوليد صورة إنتوموتشين مقلوب وحفظه كما العائد على الاستثمار الزائد.بعد ذلك توليد عائدات الاستثمار الخارجية وDextran Dextran صورة متقاطعة وحفظها كما Dextran Dextran العائد على الاستثمار. وأخيرا حفظ الصورة بأكملها كما الورم ROI. تقسيم منطقة Dextran Dextran Dextran Extravascular على منطقة أورام ROI والتكاثر في 100 لتوليد نسبة المساحة التي يغطيها Dextran البذخ في الورم بأكمله.كرر العملية من 10 إلى 20 حقلًا عالي الطاقة لكل حالة، ثم قم بإنشاء Dextran فاكرافات متوسط لكل حالة. تظهر هنا صورة غدة مامارية صحية، تتطور داخل محور جينيا. يسمى الأوعية الدموية من قبل TMR Dextran في الأحمر, يسمى ظهارة الدكتايل الثديية من قبل dendra2 البروتين الفلورسنت في الأخضر, ويتم تصنيف الضامة من قبل بروتين الفلورسنت السماوي.في المقابل، يظهر سرطان الدنيلة الغازية المزروعة المسمى dendra2 في يحمل الضامة والأوعية المسماة. تم تصور أنسجة الرئة السليمة من خلال نافذة تصوير الرئة داخل الماوس مع الأوعية الدموية المسمى. نقوش الرئة واضحة بعد حقن الخلايا السرطانية في محور جينيج مع الضامة المسمى والأوعية الدموية.تظهر هنا هي ال ستيلات من فيلم تصوير intravital من الوزن الجزيئي العالي Dextran المسمى دكستران الأوعية الأوعية الجديدة داخل سرطان dendra2 المسمى زرع الغازية من الثدي. يشير الخط الأصفر المنقط إلى المخطط التفصيلي لمنطقة التسرب الوعائي العابر قبل حدث التسرب وأثناءه وبعده. يتم التقاط مدخل TMEM في التصوير الحي.متعدد القنوات المناعية يظهر بطانة الرحم، عالية الجزيئية الوزن Dextran، صورتها المدمجة جنبا إلى جنب مع DAPI، فضلا عن الأوعية الدموية عتبة المقابلة وأقنعة ديكستران اكستران خارج vavascular. كما يظهر المقطع التسلسلي المقابل للكيمياء المناعية TMEM. يظهر ملف تعريف الأوعية الدموية بعيدًا عن TMEM كصفيف غير متسرب للأوعية ، في حين يظهر ملف تعريف الأوعية الدموية المرتبط بـ TMEM كتشكيل جانبي الأوعية الدموية المتسرب.من المهم جدا تجنب قطع الأوعية الدموية التي تزود الورم أثناء التعرض الجراحي للورم. ويمكن الجمع بين المنهجية المذكورة هنا مع العلاج من المخدرات، نفس التي تمنع وظيفة TMEM، ومنع نفاذية الأوعية الدموية، أو حتى تطبيع الأوعية الدموية الورم لقياس تأثيرها وفعاليتها. مع هذه البروتوكولات وقد أثبتنا سابقا أن العلاج الكيميائي يعزز نفاذية الأوعية الدموية ونشر الخلايا السرطانية ، وفعلا أن هذه التغييرات الموالية النقيلي يمكن التحايل عليها من خلال الإدارة المشتركة لمثبطات وظيفة TMEM.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

يرقات الزرد كنموذج لتقييم المحسسات الإشعاعية المحتملة أو الواقيات

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

فحص المخدرات العضوية متعددة المعلمات للورم باستخدام تصوير الخلايا الحية واسع المجال للتحليل السائب والعضوي الفردي

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

التألق المناعي المتعدد جنبا إلى جنب مع تحليل الصور المكانية للتقييم السريري والبيولوجي للبيئة المكروية للورم

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...