Name: assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00
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我们要感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的分析成像设施(AIF)提供成像支持。这项工作得到了NCI(P30CA0133330、CA150344、CA 100324和CA216248)、SIG 1S10OD019961-01、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合成像项目以及蒙特菲奥雷的露丝·基尔施施泰因T32外科医生培训资助项目的支持。肿瘤微环境研究(CA200561)。

葛兰素史克共同撰写稿件,对图1C和3B进行成像,开发固定组织分析协议,分析并解释所有数据;JMP共同撰写了手稿,并为图1B、2C和3A进行了手术和生命内成像;LB & AC为图 2B 进行了手术和生命内成像;RJ为图2A进行了手术和生命内成像;JSC共同撰写稿件,并分析和解释所有数据;MHO共同撰写手稿,并分析和解释所有数据;和DE为图2D进行了手术和生命内成像,共同撰写了手稿,开发了固定组织分析和生命内成像方案,并分析和解释了所有数据。

所有使用活体动物的实验必须按照动物使用和护理准则和条例进行。本研究中描述的程序是按照国家卫生研究院关于照料和使用实验动物的规定,并经阿尔伯特·爱因斯坦医学医学学院动物护理和使用学院批准进行的。委员会。
1. 利用活体动物成像评估"爆裂渗透性"
<ol><li>将合成乳腺肿瘤移植到具有荧光巨噬细胞的小鼠宿主中
	<ol>
<li>生成适合移植的肿瘤组织片段...

在这里,我们概述了两个协议,可用于可视化和量化一种特定类型的血管渗透性,这是存在于TMEM门口,并与血管紧和粘附结的中断相关。这种类型的血管渗透性是瞬态的,由三方TMEM细胞复合体控制,如上文5所述。识别和量化 TMEM 相关血管渗透性的能力对于评估亲转移性癌细胞微环境以及检查传统细胞毒性疗法对肿瘤的影响的临床前研究至关重要微环境以及靶向和非靶向疗法的抗转移潜?...

最近对癌症转移的理解的进步发现,上皮到间质过渡(EMT)和诱导迁移/侵入性癌细胞亚群本身不足以进行造血传播1.确实,以前人们认为,通过整个与癌症相关的内皮物转移癌细胞,因为肿瘤新血管学通常具有低围肠覆盖率的特点,因此具有很强的渗透性和渗透性。不稳定2,3,4。虽然肿瘤内功能缺陷的暗示性很强,但致癌过程中的血管修饰本身并不提供肿瘤细胞能够以不受控制的方式轻易穿透血管的证据。从生命内成像(IVI)研究的见解,其中肿瘤细胞荧光标记和血管标记通过静脉注射荧光探针(如dextran或量子点),表明,虽然肿瘤血管是均匀的可渗透至低分子量的extrans(例如70 kD)、高分子量的extrans(155 kD)和肿瘤细胞只能在位于血管分支点5的专门内血管内分部穿过内皮。6,7.使用动物模型和人类患者衍生材料进行的免疫组织化学(IHC)分析表明,这些部位是专门调节局部和瞬态血管渗透性的"门道",提供了一个简短的窗口。迁徙/侵入性癌细胞进入循环的机会。这些门道被称为"转移的肿瘤微环境"或"TMEM",而且,相当预料的是,它们的密度与乳腺癌患者患转移性疾病的风险增加有关8,9, 10.
每个TMEM门由三种不同类型的细胞组成:血管内大噬细胞,肿瘤细胞过度表达行为蛋白哺乳动物启用(Mena),和内皮细胞,所有直接物理接触对方1, 5,9,10,11,12,13。TMEM作为血管内门的功能的关键事件是血管内皮生长因子(VEGF)通过血管内大噬细胞14向基础血管的局部释放。VEGF 可以破坏内皮细胞 15、16、17、18、19 之间的同型结点,这种现象会导致瞬态血管泄漏,也称为"爆裂"渗透性,如IVI研究5所述。 TMEM 巨噬细胞已被证明表达酪氨酸激酶受体TIE2,这是VEGF介导的TMEM功能和这些巨噬细胞的定位到血管周围利基5,20,21,22.除了调节癌细胞传播和转移外,TIE2+巨噬细胞已被证明是肿瘤血管生成21、22、23的中央调节器, 24,25,26,27,28,29,30,31。因此,TIE2+巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,是转移级联的主要调节器。
为了更好地概念化TMEM介导的血管渗透性(即"爆裂"),将它与与内皮细胞-细胞结的溶解无关的其他血管渗透性模式区分开来非常重要。在完整的内皮内皮(其紧和粘结未中断),有三种主要类型的血管渗透性:(a) 细胞化,可能,也可能不,与摄入的物质的转细胞;(a) 细胞虫症,可以,也可能不,与摄入的物质的转细胞;((d) 细胞内渗透。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性,可能或可能不会与摄入材料的转细胞结合;(b) 通过内皮芬斯特雷运输材料;和(c) 通过副细胞通路运输材料,由内皮紧接15、16、17、18、19、32调节,33,34.虽然在许多肿瘤中解除管制,但上述血管渗透模式主要在正常组织生理学和平衡的背景下加以描述,其极端是渗透性有限的组织(例如,血脑屏障,血检屏障),或丰富的渗透性(例如,肾肾肾小球仪的芬芳毛细血管)34,35,36,37 。
使用多光子生命内成像和多路免疫荧光显微镜,我们能够区分TMEM介导的血管渗透性("爆裂")和乳腺肿瘤中其他血管渗透性模式。为此,我们在小鼠中单次静脉注射高分子量荧光标记的探针。然后,使用活小鼠的活体成像捕获自发性爆裂事件;或者,通过血脉(如CD31+或内杜木明+)和使用免疫荧光显微镜的TMEM门分,可以量化探针的外化。此处介绍的协议描述了这两种技术,这些技术可以独立使用,也可以相互结合使用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Anti-rabbit IgG (Alexa 488)</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies Corporation</td>
			<td style="width:155px;">A-11034</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rat IgG (Alexa 647)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate</td>
			<td>Eng Scientific Inc</td>
			<td>9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate Adhesive</td>
			<td>Henkel Adhesive</td>
			<td>1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran-Tetramethyl-Rhodamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endomucin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-65495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enrofloxacin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>84753076 v-06/2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fish Skin Gelatin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isofluorane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle (30 G)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pulse Oximeter</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quantum Dots</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>Q21561MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1310N14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMR (primary antibody)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>MP Biologicals</td>
			<td>TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>184835</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis

癌症相关死亡的最常见原因是转移,这个过程需要将癌细胞从原发性肿瘤传播到继发位点。最近,我们确定,原发性乳腺癌和肺部转移部位的癌细胞传播只发生在称为肿瘤微环境(TMEM)的门口。TMEM 门数是乳腺癌患者转移性疾病远程复发的预后。TMEM 门由癌细胞组成,该细胞在与血管周围、原兆噬细胞直接接触时过度表达行为蛋白调节蛋白 Mena,该细胞表示高水平的 TIE2 和 VEGF,其中这两个细胞都与血液紧密结合血管内皮细胞。癌细胞可以通过TMEM门内血管,由于由TMEM相关巨噬细胞和TMEM相关的梅纳表达癌细胞的联合活动编排的瞬态血管渗透。在本手稿中,我们描述了两种评估 TMEM 介导的瞬态血管渗透性的方法:生命内成像和固定组织免疫荧光。虽然这两种方法各有优缺点,但两种方法的结合可以最完整地分析 TMEM 介导的血管渗透性以及 TMEM 功能的微观环境先决条件。由于乳腺癌的转移过程,可能还有其他类型的癌症,涉及通过TMEM门传播癌细胞,因此必须采用成熟的方法来分析TMEM门活动。此处描述的两种方法为分析 TMEM 门性提供了一种全面的方法 , 无论是幼稚的还是药物治疗的动物 , 这对预防癌细胞的制剂的临床前试验至关重要通过TMEM传播。

本文中描述的实验过程在图1A-C中进行了简要的总结和说明。
为了测量TMEM介导的血管渗透性("爆裂活性")和减少其他血管渗透模式(如导言所述的跨细胞和准细胞)的实验噪音,我们进行了静脉注射(即v.)注入高分子量探针,如155 kDa Dextran,与四甲基罗丹胺结合。低分子量的Dextrans没有区分三种血管渗透模式。我们以往的经验显示,155 kDa TMR-Dextran 的全?...

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

利用生命内成像和固定组织分析评估与癌细胞传播相关的转移门道介导血管渗透性的肿瘤微环境

我们描述了两种方法,用于评估与转移(TMEM)的肿瘤微环境(TMEM)和癌细胞内溢相关的瞬态血管渗透性,使用静脉注射高分子量(155 kDa)dextran小鼠。这些方法包括活体动物的活体成像和使用免疫荧光的固定组织分析。

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

这些互补技术使用高分子量 Dextran 评估和测量肿瘤血管的渗透性。固定组织协议提供更大的肿瘤覆盖率，高吞吐量，不需要多光子成像设备。另一方面，病毒内成像协议提供有关转移或TMEM肿瘤微环境中细胞动力学、功能和动态相互作用的实时信息。因此，这里提出的协议能够直接测量TMEM依赖性血管渗透性，这与癌细胞传播有强烈关系，因此这些协议可用于评估肿瘤的转移电位。要生成适合移植的肿瘤组织片段，请从文本协议中描述的带肿瘤小鼠的安乐死开始。将带DMEM/F12细胞培养培养基的培养皿放在烟罩的冰上。将鼠标带到烟罩，用70%乙醇对小鼠腹部进行消毒。使用无菌手套和手术工具，切除肿瘤，并将其放入培养皿中。将肿瘤切成小块，丢弃任何坏死部分，而他们是在培养皿。为了将肿瘤片段移植到接受者宿主体内，麻醉小鼠，如文本协议所述，这些小鼠用基因工程、荧光标记的巨噬细胞长大。将麻醉量降低至约3%异氟烷，并涂抹在小鼠眼睛的眼科软膏，以防止干燥。从鼠标的第四个乳腺上去除头发。用防腐剂清洁皮肤后，使用消毒仪器制作一个小切口，切口大约两到三毫米，只低于第四个奶嘴。解剖，直到乳腺脂肪垫暴露。从培养皿中拿一块肿瘤，用人造细胞外基质涂上外衣。移植肿瘤下的第四乳腺脂肪垫。使用氰丙烯酸酯粘合剂关闭切口。最后，在动物的饮用水中加入一毫升的苯丙沙星抗生素。麻醉鼠标，并插入尾静脉导管，如文本协议中所述。使纵向中线切口立即开始优于生殖器，并携带切口到第四乳腺的上级水平。将切口横向进行到第四乳腺的优越方面。在这一点上，避免损害血液供应至关重要。将一小块硬橡胶（尺寸为两厘米）贴在皮瓣的皮瓣上，以稳定皮肤活门。肿瘤应该位于橡胶稳定区域的中心。将小薄膜的氰丙烯酸酯涂抹到定制成像窗框的外缘上。现在，在盖玻璃的中心涂抹一小滴 PBS。避免窗框上的氰丙烯酸酯与玻璃上的PBS接触，避免氰丙烯酸酯过早聚合。用实验室擦拭擦干周围的皮瓣组织。将小成像窗口贴在组织皮瓣上，肿瘤位于透明孔径的中心。将麻醉小鼠和尾静脉导管转移到显微镜阶段。使用极其小心，确保尾静脉导管不会脱落。此时，执行文本协议和我们之前的 JoVE 出版物中描述的长期病毒内成像。要进行更高的通量分析和更大的肿瘤覆盖率，请使用固定组织中的免疫荧光来评估TMEM培养的血管渗透性。要进行免疫荧光染色，首先准备文本协议中描述的样品，然后加热浸在柠檬酸盐中靠近沸点的部分20分钟，以进行抗原检索。让样品冷却至室温15至20分钟后，在PBS中清洗样品三次，每次洗涤两分钟。阻断60至90分钟的阻断缓冲液，然后用原生大鼠和快速抗体的混合物孵育样品，分别针对内莫素和四甲苯二胺。孵育后，在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。用二次驴抗体对Rat IgG和快速IgG的混合物孵育样品，然后在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。使用无甘油硬安装介质进行常规 DAPI 染色和安装幻灯片。将样品存放在黑暗的地方，直到扫描。为了获得最佳效果，请扫描数字全幻灯片扫描仪上的幻灯片。要执行图像分析，请使用任何适合数字病理学的软件，每个案例捕获 10 个高功率场。将内向明素和 TMR 通道分别保存为 TIFF。使用 ImageJ，上传 TIFF 文件并将其转换为 8 位图像。将 8 位图像阈值到负控级别，并生成两个显示内向素和 TMR 蒙版的二进制图像。从二进制工具中，选择内向膜面上的填充孔。生成阈值的 Dextran 映像，并将其保存为 Dextran ROI。此外，生成阈值内莫素图像，将其保存为血管 ROI，并生成倒置内等素图像，并保存为血管外 ROI。接下来生成相交的血管外 ROI 和 Dextran ROI 图像，并将其保存为血管外投资回报率。最后将整个图像保存为肿瘤 ROI。将血管外德克斯特兰 ROI 区域除以 Tumor ROI 区域，再乘以 100，生成外血管 Dextran 覆盖整个肿瘤的百分比区域。对每个案例的 10 到 20 个高功率场重复此过程，并生成每个案例的平均血管外 Dextran。这里展示的是转基因动物中一个健康、发育中的乳腺的图像。血管由TMR Dextran以红色标记，乳腺延展性上皮由绿色荧光蛋白dendra2标记，巨噬细胞由青色荧光蛋白标记。相比之下，移植的登德拉2标记的侵入性延展癌显示在一种标有巨噬细胞和血管的动物中。健康的肺组织通过小鼠内有标记血管的肺成像窗口进行可视化。肺转移是明显的后，注射肿瘤细胞到转基因动物与标记巨噬细胞和血管。这里展示的仍然是高分子量 Dextran 标记的新血管在移植的 dendra2 标记的乳房侵入性癌中的时间失效的病毒内成像电影。虚线表示泄漏事件之前、期间和之后瞬态血管泄漏区域的轮廓。TMEM 门在实时成像中捕获。多通道免疫荧光显示内分素，高分子量Dextran，其合并图像以及DAPI，以及相应的阈值血管和血管外德克斯特兰口罩。同时显示了TMEM免疫组织化学的相应顺序部分。远离 TMEM 的血管轮廓显示为非泄漏血管轮廓，而 TMEM 相关的血管轮廓显示为泄漏的血管轮廓。在肿瘤的手术暴露过程中，避免切割供应肿瘤的血管是非常重要的。此处描述的方法可以与药物治疗相结合，同样可以抑制TMEM功能，防止血管渗透，甚至使肿瘤血管正常化，以测量其影响和疗效。通过此协议，我们之前已经证明化疗可增强血管渗透性和癌细胞传播，实际上，通过联合管理TMEM功能抑制剂可以规避这些亲转移性变化。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

该<em&gt;果蝇</em&gt;成虫盘瘤模型：基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

科研

癌症研究

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

脑肿瘤细胞行为的纵向生命成像,以响应侵入性手术活检

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

固体肿瘤细胞系侧面人口分析

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

一种用于乳腺肿瘤微环境活体内成像的无标记分割方法

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

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斑马鱼幼虫作为评估潜在放射增敏剂或保护剂的模型

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使用宽场活细胞成像进行批量和单类器官分析的多参数肿瘤类器官药物筛选

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Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

多重免疫荧光结合空间图像分析，用于肿瘤微环境的临床和生物学评估

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...