Name: assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00
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Wir danken der Analytical Imaging Facility (AIF) des Albert Einstein College of Medicine für die unterstützung der Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 und CA216248), der SIG 1S10OD019961-01, des Gruss-Lipper Biophotonics Center und seines Integrated Imaging Program und der Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant of Surgeons von Montefiore unterstützt. für die Studie der Tumormikroumgebung (CA200561).

GSK schrieb das Manuskript mit, führte Bildgebung für Abbildung 1C und 3B durch, entwickelte ein Protokoll zur Analyse fester Gewebe und analysierte und interpretierte alle Daten; JMP schrieb das Manuskript mit und führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 1B,2C und 3A durch; LB & AC führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2B durch; RJ führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2A durch; JSC schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; MHO schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; und DE führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2D durch, schrieb das Manuskript mit, entwickelte feste Gewebeanalyse und intravitale Bildgebungsprotokolle und analysierte und interpretierte alle Daten.

Alle Versuche mit lebenden Tieren müssen in Übereinstimmung mit den Tierschutz- und Pflegerichtlinien und -vorschriften durchgeführt werden. Die in dieser Studie beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften der National Institutes of Health über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Genehmigung der Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use durchgeführt. Ausschuss (IACUC).
1. Bewertung der "Bursting Permeability" mittels Live-Tierbildge...

Hier skizzieren wir zwei Protokolle, die angewendet werden können, um eine bestimmte Art von Gefäßdurchlässigkeit zu visualisieren und zu quantifizieren, die an TMEM-Türen vorhanden ist und mit der Störung von Gefäßdicht- und Haftknoten verbunden ist. Diese Art der vaskulären Permeabilität wird durch den dreigliedrigen TMEM-Zellkomplex transient und kontrolliert, wie oben erläutert5. Die Fähigkeit, die MIT TMEM assoziierte Gefäßdurchlässigkeit zu identifizieren und zu quantifizieren...

Jüngste Fortschritte in unserem Verständnis von Krebsmetastasen haben aufgedeckt, dass epitheliale in mesenchymale Übergänge (EMT) und die Induktion einer migranten-invasiven Krebszellsubpopulation für sich genommen nicht ausreichen, um hämatogene Verbreitung zu ermöglichen. 1. Tatsächlich wurde früher angenommen, dass metastasierende Krebszellen durch die Gesamtheit des krebsassoziierten Endothel intravasieren, da die Tumorneovaskulatur oft durch eine geringe Pericytabdeckung gekennzeichnet ist und als solche instabil2,3,4. Obwohl sehr suggestiv für defekte Funktionen innerhalb des Tumors, vaskuläre Modifikationen während der Karzinogenese liefern keinen Beweis per se, dass Tumorzellen Blutgefäße leicht und unkontrolliert durchdringen können. Erkenntnisse aus intravitalen Bildgebungsstudien (IVI), in denen Tumorzellen fluoreszierend markiert werden und die Vaskulatur über die intravenöse Injektion von Fluoreszenzsonden (wie Dextran oder Quantenpunkten) gekennzeichnet ist, zeigen, dass Tumorgefäße gleichmäßig sind, während durchlässige bis niedermolekulare Dextrans (z.B. 70 kD), hochmolekulare Dextrans (155 kD) und Tumorzellen können das Endothel nur an spezialisierten Stellen der Intravasation überqueren, die sich bevorzugt am GefäßzweigPunkt5 befinden, 6 , 7. Immunhistochemische (IHC) Analysen mit Tiermodellen und menschlichem Patientenmaterial haben gezeigt, dass diese Standorte "Türen" sind, die sich auf die lokale und vorübergehende Regulierung der Gefäßdurchlässigkeit spezialisieren und ein kurzes Fenster Möglichkeit für wandernde/invasive Krebszellen, in den Kreislauf einzudringen. Diese Türen werden "Tumor Microenvironment of Metastasis" oder "TMEM" genannt, und, sehr wahrscheinlich, ihre Dichte korreliert mit einem erhöhten Risiko, eine metastasierende Erkrankung bei Brustkrebspatientinnen zu entwickeln8,9, 10.
Jede TMEM-Tür besteht aus drei verschiedenen Zelltypen: einem perivaskulären Makrophagen, einer Tumorzelle, die das aktivierte actin-regulatorische ProteinSäugetier (Mena) überausexzätiert, und einer Endothelzelle, die alle in direktem körperlichen Kontakt miteinander stehen1, 5,9,10,11,12,13. Das Schlüsselereignis für die Funktion von TMEM als Intravasationstürweg ist die lokalisierte Freisetzung des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) auf das zugrunde liegende Gefäß durch das perivaskuläre Makrophagen14. VEGF kann homotypische Verbindungen zwischen Endothelzellen15,16,17,18,19, ein Phänomen, das zu vorübergehenden vaskulären Leckagen führt, als "Bursting"-Durchlässigkeit bekannt, wie in IVI-Studien 5beschrieben. ES hat sich gezeigt, dass TMEM-Makrophagen den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 ausdrücken, der für die VEGF-vermittelte TMEM-Funktion und das Homing dieser Makrophagen in die perivaskuläre Nische5,20,21 , 22. Neben der Regulierung der Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen haben sich TIE2+ Makrophagen als zentrale Regulatoren der Tumorangiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Als solche stellen TIE2+ Makrophagen einen kritischen Bestandteil der Tumormikroumgebung und den Hauptregulator der metastasierenden Kaskade dar.
Um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit (d. h. "Bursting") besser zu konzeptionieren, ist es sehr wichtig, sie von anderen Formen der Vaskulärendurchlässigkeit zu unterscheiden, die nicht mit der Auflösung von endothelialen Zell-Zell-Verbindungen verbunden sind. In einem intakten Endothel (eines, dessen enge und haftende Kreuzungen nicht gestört sind), gibt es drei Haupttypen der vaskulären Durchlässigkeit: a) Pinozytose, die an die Transzytose des aufgenommenen Materials gekoppelt werden kann oder auch nicht; b) Transport von Material durch endotheliale Fenestrae; und c) Transport von Material durch den parazellulären Weg, der durch endotheliale enge Kreuzungen geregelt wird15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Obwohl bei vielen Tumoren dereguliert, wurden die oben genannten Formen der vaskulären Durchlässigkeit meist im Kontext der normalen Gewebephysiologie und Homöostase beschrieben, deren Extreme Gewebe mit entweder begrenzter Durchlässigkeit sind ( z.B. Blut-Hirn-Schranke, Blut-Testis-Schranke) oder reichlich Durchlässigkeit (z.B. fenestrated Kapillaren der Nierenglomerularapparat)34,35,36,37.
Mit Multiphoton intravital Imaging und Multiplexed Immunfluoreszenzmikroskopie sind wir in der Lage, zwischen TMEM-vermittelter vaskulärer Permeabilität ("Bursting") und anderen Formen der vaskulären Permeabilität bei Brusttumoren zu unterscheiden. Um dies zu erreichen, führen wir eine einzige intravenöse Injektion einer hochmolekularen, fluoreszierend markierten Sonde bei Mäusen durch. Spontane Platzereignisse können dann mit intravitaler Bildgebung bei lebenden Mäusen erfasst werden; oder alternativ kann die Extravasation der Sonde durch Co-Lokalisierungsstudien mit Blutvaskulatur (z.B. CD31+ oder Endomucin+) und TMEM-Türen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben beide Techniken, die entweder unabhängig oder in Verbindung miteinander verwendet werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Anti-rabbit IgG (Alexa 488)</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies Corporation</td>
			<td style="width:155px;">A-11034</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rat IgG (Alexa 647)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate</td>
			<td>Eng Scientific Inc</td>
			<td>9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate Adhesive</td>
			<td>Henkel Adhesive</td>
			<td>1647358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran-Tetramethyl-Rhodamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endomucin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-65495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enrofloxacin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>84753076 v-06/2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fish Skin Gelatin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isofluorane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle (30 G)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pulse Oximeter</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quantum Dots</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>Q21561MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1310N14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMR (primary antibody)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>MP Biologicals</td>
			<td>TWEEN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>184835</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis

Die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität ist Metastasierung, ein Prozess, der die Verbreitung von Krebszellen vom Primärtumor an sekundäre Stellen erfordert. Kürzlich haben wir festgestellt, dass die Verbreitung von Krebszellen bei primärem Brustkrebs und an metastasierenden Stellen in der Lunge nur an Türöffnungen auftritt, die als Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM) bezeichnet werden. TMEM Türnummer ist prognostisch für das ferne Wiederauftreten von metastasierenden Erkrankungen bei Brustkrebspatientinnen. TMEM-Türen bestehen aus einer Krebszelle, die das Aktin-Regulierungsprotein Mena in direktem Kontakt mit einem perivaskulären, proangiogenen Makrophagen überausdrückt, das einen hohen ANTEIL an TIE2 und VEGF ausdrückt, wo beide Zellen eng an ein Blut gebunden sind. Gefäß-Endothelzelle. Krebszellen können durch TMEM-Türen durch vorübergehende Gefäßdurchlässigkeit intravasiert werden, die durch die gemeinsame Aktivität des TMEM-assoziierten Makrophagens und der TMEM-assoziierten Mena-exekuitienten Krebszelle orchestriert wird. In diesem Manuskript beschreiben wir zwei Methoden zur Beurteilung der TMEM-vermittelten transienten vaskulären Permeabilität: intravitale Bildgebung und fixe Gewebeimmunfluoreszenz. Obwohl beide Methoden ihre Vor- und Nachteile haben, kann die Kombination der beiden Methoden die umfassendsten Analysen der TMEM-vermittelten Gefäßdurchlässigkeit sowie mikroökologische Voraussetzungen für die TMEM-Funktion liefern. Da der metastasierende Prozess bei Brustkrebs und möglicherweise anderen Krebsarten die Verbreitung von Krebszellen über TMEM-Türen beinhaltet, ist es wichtig, gut etablierte Methoden für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität einzusetzen. Die beiden hier beschriebenen Methoden bieten einen umfassenden Ansatz für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität, entweder bei naiven oder pharmakologisch behandelten Tieren, was für präklinische Versuche mit Wirkstoffen, die Krebszellen verhindern, von größter Bedeutung ist. Verbreitung über TMEM.

Die in diesem Protokollartikel beschriebenen experimentellen Verfahren sind kurz zusammengefasst und in Abbildung 1A-Cdargestellt.
Um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit ("Bursting Activity") zu messen und experimentelles Rauschen durch andere Formen der Vaskulären durchlässige Permeabilität (d. h. transzellulär und parazellulär, wie in der Einleitung erläutert) zu reduzieren, führten wir intravenöse (i.v.) Injektion von hochmolek...

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Diese komplementären Techniken evaluieren und messen die Durchlässigkeit der Tumorvaskulatur mit hochmolekularem Dextran. Das Fixed-Tissue-Protokoll bietet eine größere Tumorabdeckung, einen hohen Durchsatz und erfordert keine Multiphotonen-Bildgebungsgeräte. Andererseits bietet das intravitale Bildgebungsprotokoll Echtzeitinformationen über die Kinetik, Funktion und das dynamische Zusammenspiel der Zellen in der Tumormikroumgebung von Metastasen oder TMEM.Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen somit die direkte Messung der TMEM-abhängigen Gefäßdurchlässigkeit, die stark mit der Verbreitung von Krebszellen korreliert, daher können diese Protokolle zur Beurteilung des metastasierenden Potenzials der Tumoren verwendet werden. Um für die Transplantation geeignete Tumorgewebestücke zu erzeugen, beginnen Sie mit der Euthanasie tumortragender Mäuse, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie eine Petrischale mit DMEM/F12 Zellkulturmedium auf Eis in die Dunstabzugshaube.Bringen Sie die Maus auf die Dunstabzugshaube und desinsieren Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethylalkohol. Mit sterilen Handschuhen und chirurgischen Werkzeugen entfernen Sie die Tumore und legen Sie sie in die Petrischale. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke, werfen Sie alle nekrotischen Portionen, während sie in der Petrischale sind.Um die Tumorstücke in Empfänger-Hosts zu transplantieren, befeuchten Sie Mäuse, die mit gentechnisch veränderten, fluoreszierend markierten Makrophagen aufgezogen wurden, wie im Textprotokoll beschrieben. Reduzieren Sie die Anästhesie auf ca. 3%Isofluoran und tragen Sie eine ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf, um eine Trocknung zu verhindern. Entfernen Sie das Haar von über der vierten Brustdrüse der Maus.Nach der Reinigung der Haut mit Antiseptika, verwenden Sie sterilisierte Instrumente, um einen kleinen Schnitt etwa zwei bis drei Millimeter nur unter der vierten Brustwarze zu machen. Sezieren, bis das Brustfettpad freigelegt wird. Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und beschichten Sie es in künstlicher extrazellulärer Matrix.Transplantieren Sie Tumore unter dem vierten Brustfettpad. Schließen Sie den Schnitt mit Cyanoacrylat-Klebstoff. Zum Schluss einen Milliliter Enrofloxacin-Antibiotikum in das Trinkwasser der Tiere geben.Anästhetisieren Sie die Maus und fügen Sie einen Schwanzvenenkatheter ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Machen Sie einen Längsmittelschnitt, der sofort den Genitalien überlegen beginnt, und tragen Sie den Schnitt bis zum Niveau des überlegenen Aspekts der vierten Brustdrüse. Tragen Sie den Schnitt quer zum überlegenen Aspekt der vierten Brustdrüse.Es ist wichtig, die Blutversorgung an dieser Stelle nicht zu gefährden. Stabilisieren Sie die Hautklappe, indem Sie ein kleines Stück Hartkautschuk anbringen, das zwei mal zwei Zentimeter misst, an der Hautseite der Klappe. Die Tumoren sollten sich in der Mitte des Bereichs befinden, der durch den Gummi stabilisiert wird.Tragen Sie einen kleinen Film aus Cyanoacrylat auf den äußeren Rand des maßgeschneiderten bildgebenden Fensterrahmens auf. Wenden Sie nun ein kleines Tröpfchen PBS auf die Mitte des Deckglases an. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen dem Cyanoacrylat am Fensterrahmen und dem PBS auf dem Glas, um eine vorzeitige Polymerisation des Cyanoacrylats zu vermeiden.Trocknen Sie das umgebende Klappengewebe mit einem Labortuch. Befestigen Sie das kleine bildgebende Fenster an der Gewebeklappe mit dem Tumor in der Mitte der klaren Blende. Übertragen Sie die anästhesierte Maus und den Schwanzvenenkatheter auf die Mikroskopstufe.Seien Sie äußerst vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Schwanzvenenkatheter nicht herausfällt. Führen Sie an dieser Stelle eine langfristige intravitale Bildgebung durch, wie im Textprotokoll und in unserer vorherigen JoVE-Publikation beschrieben. Für eine höhere Durchsatzanalyse und eine größere Tumorabdeckung verwenden Sie Die Immunfluoreszenz im festen Gewebe, um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit zu bewerten.Um Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen, bereiten Sie zuerst die Proben wie im Textprotokoll beschrieben vor, und führen Sie dann antigenen Abruf durch, indem Sie die in Citrat in der Nähe des Siedepunkts eingetauchten Abschnitte 20 Minuten lang erhitzen. Nachdem Sie die Proben 15 bis 20 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen lassen, waschen Sie die Proben dreimal für zwei Minuten. Blockieren Sie für 60 bis 90 Minuten im Sperrpuffer, dann inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus Primärratte und schnellen Antikörpern, die Endomucin bzw. Tetramethylrhodamine zielen.Waschen Sie die Proben nach der Inkubation dreimal in PBST für jeweils zwei Minuten. Inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus sekundären Eselantikörpern gegen Ratig IgG und schnellem IgG, dann waschen Sie die Proben dreimal in PBST für jeweils zwei Minuten. Führen Sie eine routinemäßige DAPI-Färbung durch und montieren Sie die Dias mit einem glyzerinfreien harten Montagemedium.Bewahren Sie die Proben bis zum Scannen an einem dunklen Ort auf. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, scannen Sie die Dias auf einem digitalen Ganzdiascanner. Um eine Bildanalyse durchzuführen, erfassen Sie 10 Hochleistungsfelder pro Fall mit jeder Software, die für die digitale Pathologie geeignet ist.Speichern Sie die Endomucin- und TMR-Kanäle separat als TIFF. Laden Sie die TIFF-Dateien mit ImageJ hoch und konvertieren Sie sie in 8-Bit-Bilder. Schwellen Sie die 8-Bit-Bilder auf die Ebene der Negativkontrolle und erzeugen Sie zwei binarisierte Bilder, die die Endomucin- und TMR-Masken zeigen.Wählen Sie in den Binärwerkzeugen Füllungslöcher auf der Endomucin-Maske aus. Generieren Sie das dextran-Schwellenbild, und speichern Sie es als Dextran-ROI. Generieren Sie außerdem das schwellende Endomucin-Bild und speichern Sie es als Vascular ROI und generieren Sie das invertierte Endomucin-Bild und speichern Sie es als extravaskulären ROI.Als nächstes generieren Sie das sich schneidende extravaskuläre ROI und Dextran ROI-Image und speichern Sie es als Extravaskulärer Dextran ROI. Speichern Sie schließlich das gesamte Bild als Tumor ROI. Teilen Sie den Extravaskulären Dextran-ROI-Bereich durch den Tumor-ROI-Bereich und multiplizieren Sie mit 100, um die prozentuale Fläche zu generieren, die der extravaskuläre Dextran im gesamten Tumor abdeckt.Wiederholen Sie den Vorgang für 10 bis 20 Hochleistungsfelder pro Fall und generieren Sie für jeden Fall einen durchschnittlichen extravaskulären Dextran. Hier ist das Bild einer gesunden, sich entwickelnden Brustdrüse innerhalb eines transgenen Tieres zu sehen. Die Vaskulatur wird durch TMR Dextran in rotem, brustduktiles Epithel beschriftet und durch das fluoreszierende Protein Dendra2 grün und Makrophagen durch ein Cyanfluoreszenzprotein gekennzeichnet.Im Gegensatz dazu wird ein transplantiertes Dendra2-markiertes invasives duktiles Karzinom bei einem Tier mit markierten Makrophagen und Gefäßen gezeigt. Gesundes Lungengewebe wurde durch ein Lungenbildfenster innerhalb einer Maus mit beschrifteter Gefäße visualisiert. Lungenmetastasen sind nach der Injektion von Tumorzellen in ein transgenes Tier mit markierten Makrophagen und Vaskulatur offensichtlich.Hier sind Stills aus einem zeitverstrichenen intravitalen Bildfilm mit hochmolekularen Dextran-markierten neoangiogenen Gefäßen innerhalb eines transplantierten Dendra2-markierten invasiven Karzinoms der Brust zu sehen. Die gepunktete gelbe Linie bezeichnet die Umrisse des transienten vaskulären Leckbereichs vor, während und nach dem Leckageereignis. Eine TMEM-Tür wird in Live-Bildgebung erfasst.Die mehrkanalige Immunfluoreszenz zeigt Endomucin, hochmolekulares Dextran, ihr zusammengeführtes Bild zusammen mit DAPI sowie die entsprechenden schwellenförmigen Blutgefäße und extravaskulären Dextran-Masken. Der entsprechende sequenzielle Abschnitt der TMEM-Immunhistochemie wird ebenfalls gezeigt. Das Von TMEM entfernte Gefäßprofil erscheint als nicht-leaky vaskuläres Profil, während das TMEM-assoziierte Gefäßprofil als undichtes Gefäßprofil erscheint.Es ist sehr wichtig, zu vermeiden, dass die Blutgefäße, die den Tumor während der chirurgischen Exposition des Tumors versorgen, geschnitten werden. Die hier beschriebene Methode kann mit einer medikamentösen Behandlung kombiniert werden, die die TMEM-Funktion hemmt, die Gefäßdurchlässigkeit verhindert oder sogar die Tumorvaskulatur normalisiert, um deren Wirkung und Wirksamkeit zu messen. Mit diesen Protokollen haben wir bereits gezeigt, dass Chemotherapie die Vaskuläre Permeabilität und die Verbreitung von Krebszellen verbessert und dass diese prometastasierenden Veränderungen durch die gleichzeitige Anwendung von Inhibitoren der TMEM-Funktion umgangen werden können.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafischlarven als Modell zur Bewertung potenzieller Radiosensibilisatoren oder Protektoren

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...