Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة السير هنري ويلكوم بعد الدكتوراه (WT100133 إلى G.B.)، وزمالة ويلكوم ترست العليا (WT103789AIA إلى S.L.)، وشهادة الدكتوراه في مؤسسة ويلكوم الاستئمانية إلى (108906/Z/15/Z إلى D.W.). ونحن ممتنون أيضا للدكتور مانويل تيري على نصيحته بشأن تكييف تقنية النقش الضوئي.

<ol>
	<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells.">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioengineering:+building+from+stem+cell+biology.">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing.">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning.">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells.">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology. Pt. A. , (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo.">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366 (2017).</li><li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells.">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li><li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+signaling+thresholds+in+&#8220;engineered+stem+cell+niches&#8221;+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens.">Manipulation of signaling thresholds in &#8220;engineered stem cell niches&#8221; identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438 (2009).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization.">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).</li><li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li><li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation.">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li><li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., R&#252;ther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells.">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li><li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicistronic+targeting+constructs:+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression.">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nessys:+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D.">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872 (2018).</li><li>Weiswald, L. -. B., Guinebreti&#232;re, J. -. M., Richon, S., Bellet, D., Saubam&#233;a, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres:+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy.">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106 (2010).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li><li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-explorer:+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens.">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).</li><li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium.">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li><li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology.">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning.">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839 (2018).</li><li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms.">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).</li><li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Lamins+a+and+B1.">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level.">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos.">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li></ol>

أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه

هنا نقوم بوصف طريقة لتحليل النقش الناشئ في ثقافات الخلايا. يتم استخدام نهج النقوش الدقيقة المبسطة لتوحيد شكل وحجم مستعمرات الخلايا، ونقدم أدوات تحليل الصور ونصوص R التي تمكن من الكشف عن الأنماط داخل هذه المستعمرات والتحديد الكمي لها.
خط الأنابيب نقترح مشابهة إلى حد ما مع الطريقة التي نشرت سابقا31 حيث يركز المؤلفون على ظروف الثقافة، وذلك باستخدام الأنماط الدقيقة المتاحة تجاريا، للحصول على تشكيل طبقة جرثومية قابلة للاستنساخ في مستعمرات ESC ل دراسة أحداث الغاز في وقت مبكر في المختبر. هدفنا هو أكثر تركيزا نحو توفير خط أنابيب قابل للتعميم لاكتشاف تشكيل نمط في المختبر حيث التنظيم الجماعي للخلايا قد تصبح واضحة فقط بعد التحليل الإحصائي. لهذا السبب، نحن نقدم سير عمل تحليل الصورة قوية التي تمكن من تحديد وتحليل دقيقة للموقف النووي في الفضاء 3D على مستعمرات متعددة (انظر أيضا "ميزة وقيود طريقة الكشف عن نمط" القسم من هذا المناقشة). كما قررنا وضع نهج بسيط في مجال الميكرونمط الذي يوفر بديلا أكثر مرونة وأرخص للحلول المتاحة تجاريا على المدى الطويل التي نأمل أن تكون مفيدة للمجتمع.
وأخيرا، نلاحظ أنه خلال مراجعة هذه المخطوطة، تم إصدار حزمة جديدة لتحليل النقش في المختبر مماثلة لنصوص R لدينا32. تقبل هذه الحزمة الجديدة جداول ميزات الخلايا كإدخال يمكن الحصول عليها من منصات التصوير عالية الإنتاجية. ونعتقد أن جدول السمات النووية الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7 من بروتوكولنا يمكن أن يكون من حيث المبدأ بمثابة مدخل لهذه الحزمة الجديدة على الرغم من أننا لم نختبر هذه الإمكانية بأنفسنا.
قابلية هذه الطريقة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى وهندسة المستعمرة
نقدم هذا النهج في سياق دراسة ظهور عوامل النسخ في الجلد الأوسط في ثقافات الخلايا متعددة القوى في وجود المصل. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الخلايا الأخرى ومع الثقافات الخالية من المصل على الرغم من أنه قد يكون من الضروري تحسين تركيزات ECM/poloxamer 407 (انظر الجدول 1 للاطلاع على التركيزات المختبرة والجدول 2 للاطلاع على دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها). ويمكن أيضا تكييف هذه الطريقة مع أحجام أكبر أو أصغر من الأنماط الدقيقة ومجموعة واسعة من الأشكال وفقا لاحتياجات المستخدم. ومع ذلك، أثناء تأسيس الأسلوب، من المهم أن تكون على علم بأن تركيبات نوع الشكل/الخلية ليست كلها الأمثل. على سبيل المثال، mESC التعبير عن مستويات عالية من E-الكادرين33،34 تمكين هذه الخلايا لتشكيل هياكل جماعية تمتد المناطق التي تخلو من ECM. هذه الخلايا لا تتبع بدقة الجيومتريات مع زوايا حادة أو التي تشمل ثقوب صغيرة في نمط. لاحظ على سبيل المثال أن على حلقة الشكل 3B، الخلايا هي في عملية استعمار المنطقة الوسطى. في أيدينا منطقة مركزية أصغر لم يجبر mESC لتشكيل مستعمرات على شكل حلقة. ولذلك فمن المستحسن للغاية لتشمل مجموعة متنوعة من الجيومتريات أثناء تصميم قناع ضوئي لتكون قادرة على اختبار وتحديد الأحجام المثلى وانحناءات التي سوف تكون مناسبة لنوع الخلية من الاختيار.
وثمة عامل هام آخر ينبغي أخذه في الاعتبار هو طول التجربة ومعدل انتشار الخلايا. بالنسبة لبعض أنواع الخلايا التي تتكاثر بسرعة (بما في ذلك الخلايا متعددة القوى) يمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على الخلايا على الأنماط الدقيقة على مدى عدة أيام (لmESC ثلاثة أيام هو الحد الأقصى). أيضا، بذر الخلايا على الأنماط الدقيقة لا يحدث دائما على النحو الأمثل لكل مستعمرة، لذلك فمن المستحسن أن بذر فائض من المستعمرات من أجل الحصول على قطع الغيار.
ميزة وقيود طريقة الكشف عن النمط
وتتمثل إحدى المزايا الخاصة للطريقة في القدرة على الكشف عن الأنماط"المتوسطة" عن طريق الجمع بين نتائج تحليل الصور من مستعمرات متعددة تكرارية (الشكل 5). وهذا يمكن أن يكشف عن أحداث النقش التي لا تظهر من تفتيش المستعمرات الفردية. ومن عيوب هذا النهج "المتوسط" أنه قد يفتقد أنواعاً معينة من الأنماط المتكررة، مثل البقع الصغيرة أو الخطوط الضيقة. ومع ذلك، قد يتم الكشف عن هذه الأنواع من نمط بدلا من ذلك مع مزيج من أحجام نمط مختارة بعناية8. أيضا، خط أنابيب تحليل الصورة الموضحة هنا يوفر بيانات كمية في كل من خلية واحدةومستعمرة القرار يوفر إمكانية للتحقيق في مستوى التباين بين المستعمرة (الشكل 5) أو لإجراء تحليل الجيران في متعددة جداول10.
وثمة ميزة هامة أخرى لطريقة المتوسط هي أنها تتيح الفرصة لرسم خريطة للموقع التفضيلي للعديد من العلامات دون أن تكون محدودة بمركبات الفلوروفور المتاحة لقنوات الكشف. في الواقع، على الرغم من أننا الاستفادة من اثنين فقط من علامات التمايز في العمل المعروض هنا، والقدرة على توحيد المستعمرات واستخراج أنماط "متوسط" يجعل من الممكن مقارنة خرائط التوزيع من مجموعات مختلفة من المستعمرات معا من أجل للكشف عن العلاقات المكانية المعممة للعلامات لبعضها البعض.
وعلاوة على ذلك، وعلى الرغم من تركيزنا هنا على دراسة علامات التمايز، يمكن توسيع طريقة التحليل لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى التي تتوفر بشأنها علامات نووية. على سبيل المثال، فإن النقش الدقيق لخط الخلية الذي يحتوي على مؤشر دورة الخلية الفلورية في كل مكان35 (FUCCI) من شأنه أن يجعل من الممكن دراسة كيفية تأثير هندسة مستوى المستعمرة على أحداث دورة الخلايا في المجموعة.
الاتجاهات المستقبلية
هذه الطريقة قابلة لتحليل الصورة الإنتاجية المتوسطة، ومع ذلك، فإن الحصول على الصور غير مؤتمت بالكامل في الوقت الحالي ويمكن أن يصبح مقيداً للتجارب الكبيرة جداً. الترتيبات العادية للمستعمرات ينبغي أن تجعل من الممكن إنشاء إجراءات اقتناء تلقائية بالكامل مماثلة لما تم تطويره لخلية واحدة في المتوسط20. ومع ذلك، لأن حجم الحقل المطلوب لتصوير مستعمرة كبير، وربما يتطلب الفسيفساء، ولأن المستعمرات ثلاثية الأبعاد، فمن المستحسن للغاية تقليل كل من حجم مجموعة البيانات ووقت الاقتناء عن طريق تصوير المستعمرات ذات الصلة فقط. ولذلك، قد تكرس الجهود المستقبلية لتطوير مجهر "ذكي" قادر على تحديد المستعمرات ذات الصلة وتكييف إحداثيات التصوير مع كل عينة. وهذا لن يقلل من الوقت والجهد فحسب، بل سيمنع أيضاً التحيزات المحتملة للمشغلين.
كما يمكن جعل خطوط أنابيب التحليل أكثر كفاءة عن طريق تقليل عدد الخطوات التي يحتاج المستخدم إلى اتخاذها. لدينا خطط لبناء آلية بناء خط أنابيب ودمج R مباشرة في برنامجنا (انظر أيضا القضايا pickcells-api # 3 وpickcells-rjava#1 في تعقب القضية من مستودعات التعليمات البرمجية لدينا [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). وسيؤدي التشغيل الآلي الكامل لإجراء التحليل إلى تقليل الوقت والجهد والحد من أخطاء المستعملين المحتملين.
وأخيرا، نلاحظ أن أسلوب التحليل لدينا لا يلتقط بعد تماما الطبيعة الدينامية للنقش الخلوي. يمكن استخراج بعض المعلومات الديناميكية المحدودة عن طريق فحص سلسلة زمنية من صور اللقطة8و10و36. ومع ذلك، فإن القدرة على تسجيل تاريخ سكان الخلايا أمر مرغوب فيه للغاية إذا أردنا أن نفهم بشكل أفضل كيف يظهر النقش. أحد القيود هو أن تتبع دقيق للخلايا الفردية في مجموعة خلايا كثيفة 3D لا يزال مهمة صعبة جدا37. لدينا طريقة الكشف عن الخلايا يستخدم المغلف النووي ويؤدي بشكل جيد بشكل خاص على كثافة وتداخل مجموعات الخلايا28. المراسلون المباشرون للغلاف النووي متاحون بسهولة28و38 وإحدى مزايا تقنية النقش الدقيق هي أنه يمكن استخدامه لمنع الخلايا من التحرك خارج مجال الرؤية أثناء التصوير على المدى الطويل. عموما، ونحن على ثقة من أن تتبع الآلي للخلايا يمكن تحقيقها باستخدام مزيج من الأدوات التي أنشئت مؤخرا28،39،40، وأن هذا ينبغي أن تجلب رؤى جديدة في الأساسية مبادئ التنظيم الذاتي.

في أنظمة الثدييات، النقش هو خاصية ناشئة للسلوك الجماعي للخلايا وهكذا، يمكن أن تشكلأنماط في المختبر إذا تم توفير العظة المناسبة للخلايا 1،2،3،4، 5 , 6.إحدى الطرق للكشف عن القدرة الذاتية للخلايا على التنظيم الذاتي في المختبر هو إجبار الخلايا على تشكيل مجموعات / مستعمرات من الأشكال والأحجام المحددة7و8و9و10 . تقنية التي تمكن هذا هو micropatterning11. النقش الدقيق يجعل من الممكن تحديد الموقع بدقة حيث يتم إيداع جزيئات المصفوفة خارج الخلية (ECM) على سطح. وهذا بدوره يملي أين يمكن للخلايا الالتزام وبالتالي يتحكم في كيفية تنظيم الخلايا مكانياً.
التنقش الدقيق هو تقنية مع العديد من التطبيقات، على سبيل المثال، micropatterning تمكن توحيد الظروف الأولية قبل التمايز12. الأهم من ذلك، micropatterning يجعل من الممكن بسهولة السيطرة على حجم وشكل وتباعد مستعمرات الخلايا ويمكن استخدام هذه الخاصية لابتكار التجارب التي تهدف إلى التحقيق في الاستجابة الجماعية للخلايا لmorphogen أو إلى العظة المادية7 , 8 , 10 سنوات , 13 , 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17.
وقد وضعت عدة طرق micropatterning11. تقنيات النقش الضوئي هي ربما أسهل الطرق لإنشاء18. هذه النهج لديها أيضا ميزة الدقة كما أنها يمكن استخدامها للسيطرة على شكل خلايا واحدة18،19،20. ومع ذلك، فإنها تتطلب أيضا معدات متخصصة باهظة الثمن بما في ذلك المغطي تدور، وغرفة البلازما ومنظف UVO (الأشعة فوق البنفسجية الأوزون) التي عموما ليست متاحة بسهولة في مختبرات البيولوجيا القياسية. ولتسهيل اعتماد هذه التقنية، قمنا بتكييف البروتوكول ليتطلب فقط مصباح UVO. نبدأ من الشرائح البلاستيكية المتاحة تجاريا والتي يمكن قطعها مع مقص أو مع لكمة حفرة إلى الشكل المطلوب.
إحدى المنافع الهامة للأنماط الدقيقة هي القدرة على توحيد المستعمرات من أجل مقارنة المستعمرات الفردية عبر عمليات تكرار متعددة. وهذا يجعل من الممكن أن نسأل إلى أي مدى يتم استنساخ تشكيل نمط داخل هذه المستعمرات، واستكشاف العوامل التي تؤثر على قوة عملية النقش. والأهم من ذلك أن التحديد الكمي للأنماط "المتوسطة" عبر مستعمرات موحدة متعددة يمكن أن يكشف أيضا عن عمليات النقش التي لن تكون واضحة لولا ذلك. ميزة القدرة على قياس النقش على المستعمرات الموحدة يعتمد على القدرة على قياس التعبير البروتين بدقة، من الناحية المثالية على مستوى خلية واحدة. ومع ذلك، غالباً ما تكون الخلايا على الأنماط الدقيقة معبأة بإحكام، مما يجعل من الصعب تقسيمها بدقة عالية. كما غالباً ما تنظم الخلايا نفسها في ثلاثة أبعاد بدلاً من بعدين، ويمكن أن يكون من الصعب الكشف عن المعلومات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) والحفاظ عليها أثناء التجزئة. بمجرد تقسيم الخلايا بنجاح، هناك حاجة إلى أساليب حسابية لاستخراج معلومات النقش من مجموعات البيانات الناتجة.
وقد طورنا أدوات للتجزئة وتحليل الصور للمساعدة في التغلب على هذه المشاكل. يستخدم أسلوب التحليل هذا البرامج الحرة والمفتوحة المصدر فقط ولا يتطلب معرفة سطر الأوامر أو البرمجة لتنفيذها. لتوضيح الطريقة هنا، ونحن نستخدم الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (mES) التي تعبر تلقائيا علامة من التمايز المبكر البذيني (Tbra)21،22. وفي حين أنه لا يوجد ترتيب مكاني واضح يمكن اكتشافه بصرياً، فإن هذه الطريقة تسمح بوضع خريطة لتحديد المواقع التفضيلية لخلايا T+ في المستعمرات. كما نبين أن نمط Tbra يتناقض مع عدم وجود توطين تفضيلي للخلايا التي تعبر عن Id1، قراءة مباشرة للبروتين المورفوجيجيني للعظام (BMP) المسار23. كما نناقش القيود الحالية للطريقة وكيف يمكن تكييف هذه التقنية مع الأنظمة التجريبية الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

ويتمثل أحد الأهداف الأساسية في علم الأحياء في فهم كيفية ظهور الأنماط أثناء التنمية. وقد أظهرت عدة مجموعات أن النقش يمكن أن يتحقق في المختبر عندما تقتصر الخلايا الجذعية مكانيا على الأنماط الدقيقة، وبالتالي وضع نماذج تجريبية التي توفر فرصا فريدة لتحديد، في المختبر، المبادئ الأساسية للبيولوجية منظمه.
وهنا نوصف تنفيذنا للمنهجية. قمنا بتكييف تقنية نقش الصور لتقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة لتسهيل إنشاء هذه الطريقة في مختبر بيولوجيا الخلايا القياسي. كما قمنا بتطوير إطار مجاني مفتوح المصدر وسهل التركيب لتحليل الصور من أجل قياس الوضع التفضيلي للمجموعات الفرعية من الخلايا داخل مستعمرات الأشكال والأحجام القياسية. هذا الأسلوب يجعل من الممكن الكشف عن وجود أحداث النقش حتى في السكان غير المنظمة على ما يبدو من الخلايا. وتوفر هذه التقنية رؤى كمية ويمكن استخدامها لفصل تأثيرات البيئة (مثل الإشارات المادية أو الإشارات الذاتية)، على عملية نقش معينة.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

تستخدم الطريقة المعروضة هنا النقش الدقيق مع التصوير الكمي للكشف عن التنظيم المكاني داخل الثقافات الثدييات. هذه التقنية من السهل تأسيسها في مختبر بيولوجيا الخلايا القياسية، ويوفر نظام قابل للبسط لدراسة النقش في المختبر.

رسم خرائط التنظيم المكاني الناشئ للخلايا الثديية باستخدام الأنماط الدقيقة والتصوير الكمي

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

هذه الطريقة تجعل من الممكن التلاعب وتحديد كيفية تنظيم الخلايا بشكل جماعي. وهذا أمر مهم لأننا يمكن أن نموذج نمط في المختبر وفك العظة مقرونة بإحكام في الجسم الحي. تتطلب هذه التقنية الحد الأدنى من المعدات المتخصصة ، مما يسمح بإرساءها في مختبر بيولوجي قياسي ، وهي كمية ، مما يجعل من الممكن اكتشاف أحداث النقش شبه البصرية.ويمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أي نظام خلية حيث يمكن أن تظهر النقش واكتشاف أنماط غير عشوائية من التمايز، والانتشار، وتنافس الخلايا إلى الخلية. الرئيسي مع هذا الأسلوب هو التحسين المنهجي لالمعلمات micropatterning لأنواع الخلايا الجديدة. على سبيل المثال، حجم النقش وشكله ونوع المصفوفة ووقت التصاق الخلية.ارتداء قفازات، ووضع قطعة من الفيلم المختبر في الجزء السفلي من طبق بيتري مربع 10 سنتيمترات. استخدام لكمة حفرة 12 ملليمتر لقطع الشرائح البلاستيكية المائية لإنشاء 12 ملليمتر حول زلات الغطاء، ووضع زلات الغطاء في طبق بيتري جديد. استخدم الملاقط لإزالة الفيلم الواقي بعناية من زلات الغلاف.ضع قناع الصورة على سطح نظيف ومستقر ، وجانب الكروم لأعلى ، وأضف قطرة من الماء المقطر المزدوج في موضع تصميم الشريحة المطلوبة. اضغط بلطف على زلة غلاف على القطرة ووضع حاملها على رأس الشرائح البلاستيكية. إصلاح بعناية هذا ساندويتش مع المشابك للحفاظ على القطع البلاستيكية في اتصال مع قناع الصورة.ضع التجميع في مصباح أوزون فوق البنفسجية حوالي سنتيمترين من مصدر الضوء لإضاءة لمدة 10 دقائق. في نهاية فترة الإضاءة، فهم شطيرة مع قناع الصورة في الجزء السفلي وإزالة المشابك بعناية مع الحفاظ على الضغط بيد واحدة لمنع الشرائح من التحرك في حين تفكيك شطيرة. عندما تم إزالة جميع المشابك، وإزالة حامل، مع الحرص على أن جميع القطع البلاستيكية لا تزال على القناع وغير عالقة إلى حامل، وإضافة الماء المقطر المزدوج إلى رقائق لفصل بلطف رقائق من قناع الصورة.ضع الرقائق المنقوشة على الصورة داخل غرفة الترسب المصفوفية ، الجانب المضاء ، وأضف 200 ميكرولترات من محلول الطلاء على كل رقاقة. ثم، إضافة طبق بيتري ثلاثة سنتيمترات مليئة بالماء المقطر المزدوج إلى الغرفة للحد من التبخر في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لزرع الخلايا الجنينية على رقائق، وغسل رقائق مع اثنين من يغسل ما لا يقل عن خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة والمعقمة لكل غسل، قبل الاستغناء عن واحد مرة عشرة إلى الخلايا الخامسة في 200 ميكرولترات من متوسطة ثقافة الخلية المناسبة على كل رقاقة.ثم أغلق غرفة البذر. احتضان لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا على التمسك رقائق. عندما تعلق الخلايا، ملء آبار لوحة متعددة الآبار مع 500 ميكرولترات من المتوسطة الدافئة في البئر، واستخدام ملاقط عقيمة لنقل رقائق في آبار لوحة الفردية.يهز لوحة بقوة لفصل أي خلايا غير المنضمة، وعلى الفور استبدال ناظر مع الطازجة، المتوسطة الدافئة. ثم تحقق تحت المجهر لمراقبة ما إذا كان النقش مرئيًا أم لا. بعد 48 ساعة من الطلاء، يجب أن تشكل الخلايا مستعمرات كثيفة تتبع بدقة شكل الأنماط.ترك رقائق في لوحة، وإزالة جميع ولكن فقط ما يكفي من المتوسطة لمنع رقائق من التجفيف، وإضافة ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من paraformaldehyde أو محلول التثبيت القائم على PFA في بئر. بعد عشر دقائق، وغسل الآبار لفترة وجيزة ثلاث مرات مع محلول الغسيل، تليها غسل واحد مع كلوريد الأمونيوم 50 ملليمولر المخفف في محلول الغسيل لإخماد المتبقية PFA عبر النشاط. بعد الغسيل الأخير، تعاملي مع العينات بمحلول مانع لمدة 30 دقيقة على الأقل.للمناعة من الثقافات رقاقة، نقل رقائق في الجانب خلية غرفة تلطيخ حتى، وعلى الفور إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الأولية التي تهم كل رقاقة. بعد ساعة واحدة على منصة دوارة في درجة حرارة الغرفة، وغسل رقائق ثلاث مرات مع محلول الغسيل كما هو موضح، واحتضان رقائق مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة على منصة الدورية. في نهاية حضانة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل رقائق ثلاث مرات في محلول الغسيل وجبل رقاقة على شريحة المجهرية مع 20 ميكرولترات من أي متوسطة تصاعد القياسية.لصورة الرقائق، أولاً ضبط سرعة المسح الضوئي، ودقة الصورة، ومتوسط الإطار، ومكاسب الكاشف لتحديد أفضل ما بين جودة الصورة ووقت التصوير. ثم الحصول على صور لكل رقاقة. عند الحصول على كافة الصور، تثبيت وتشغيل PickCells التالية الوثائق المتوفرة على الإنترنت، إنشاء تجربة جديدة، واستيراد الصور إلى البرنامج.استخدم وحدة نيسيز لتقسيم النوى استنادًا إلى إشارة المغلف النووي. استخدم الوحدة النمطية الأساسية للتجزئة لتحديد إشارة النقش التلقائي. ثم انقر فوق إنهاء "وانتظر حتى تتم معالجة كافة الصور.لإنشاء كائنات نواة وحوسبة ميزات الكائن الأساسية، قم بتشغيل وحدة الميزات الجوهرية من شريط المهام وإغلاق لوحات المجهز الإهليلجي وسطح النازع للحفاظ على لوحة الميزات الأساسية مفتوحة فقط. حدد النواة "كنوع الكائن، وحدد البادئة المقدمة التي تم تحديدها للصور المجزأة. ثم انقر فوق Compute "وانتظر حتى تتم معالجة كافة الصور.في هذه المرحلة، يجب كتابة ميزات إضافية في النوى قبل تصدير البيانات لتحليلنا. على سبيل المثال، لتخزين اسم الصورة التي تنتمي إليها كل نواة كسمة Nucleus، انقر فوق البيانات"والسمة الجديدة" وحدد النواة"في الحوار المنبثق. انقر فوق موافق "حدد جمع البيانات من الكائنات الأخرى المتصلة العقدة" وانقر فوق التالي "في اللوحة اليمنى، حدد صورة" وانقر نقراً مزدوجاً فوق علامة الاستجواب لتعيين عقدة الصورة كهدف للمسار.قم بتوسيع جزء عملية التخفيض وحدد الحصول على واحد"توسيع جزء السمة المتوفرة وحدد السمة الاسم. ثم انقر فوق تغيير"و التالي"أدخل اسم الصورة، اضغط على المفتاح Tab، وانقر فوق إنهاء"ثم تصدير البيانات إلى ملف قيمة مفصولة بعلامة التبويب. لتحليلنا، حلقة البيانات التي تم تصديرها إلى مجلد البيانات من المجلد R-النصي.فتح لدينا استوديو "وفتح قالب خريطة binned R-Script"ثم تعيين دليل العمل إلى موقع الملف المصدر، وتشغيل البرنامج النصي لتوليد خرائط الكثافة. في ساعة واحدة بعد زرع الخلايا، قد لا تكون الخلايا الفردية الزنكة تماما كما تتكاثر الخلايا مع مرور الوقت. ومع ذلك، سوف تصبح أنماط المستعمر بالكامل مع عدد قليل جدا من الخلايا فقط خارج الأسطح اللاصقة.النقش الذي ليس واضحا ما يصل الى ساعتين بعد البذر يشير إلى فشل الإجراء. إن الحبس المكاني للخلايا الجذعية الجنينية الماوس على أقراص كبيرة أو رنين صغير حلقة يوجه نمط مجموعة فرعية من الخلايا التي تعبر عن علامة brachyury mesodermal. على سبيل المثال، عندما تزرع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس على ميكروباتينس القرص الكبير، تكون الخلايا الإيجابية brachyury مقيدة بشكل تفضيلي إلى محيط النمط حيث كثافة الخلايا المحلية هي الأدنى.ويؤكد هذا النقش من خلال خريطة كثافة الدماغ brachyury. وتبين هذه البيانات أن الأسلوب يمكن أن تكشف عن المعلومات دون البصرية كما التفتيش من مستعمرة واحدة ليست كافية لتحديد أي شكل من أشكال التنظيم المكاني في علامة التعبير عن الفائدة. ويفسر هذا بشكل ملحوظ من قبل اختلاف مستعمرة إلى مستعمرة هامة.وتبين هذه التقنية أيضا أنه لا يوجد أي نمط يمكن اكتشافه لمثبطات من الحمض النووي ملزمة واحدة والتي قد تشير إلى أن T-نقش لا تحركها العظام الإشارات البروتين المورفوجينيك في هذا السياق. تذكر دائما أي جانب من زلة الغطاء قد تم القضاء عليها ومغلفة وأيضا التأكد من أن الخلايا قد التزمت بشكل صحيح قبل غسل الخلايا الزائدة. هذه الطريقة تسمح لدراسة الإشارات البيئية الهامة في توجيه التنظيم الذاتي للخلايا ويمكن أيضا أن أبلغ النماذج الرياضية التي تساعدنا على نحو أفضل في ظل النقش البدائية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ<em&gt; في المختبر</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...