Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een Sir Henry Wellcome post-doctoraats Fellowship (WT100133 to G.B.), een Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA tot S.L.), en een Wellcome Trust PhD studentship to (108906/Z/15/Z tot D.W.). We zijn ook Dr. Manuel Thery dankbaar voor zijn advies over de aanpassing van de photopatterning-techniek.

<ol>
	<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells.">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioengineering:+building+from+stem+cell+biology.">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing.">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning.">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells.">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology. Pt. A. , (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo.">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366 (2017).</li><li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells.">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li><li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+signaling+thresholds+in+&#8220;engineered+stem+cell+niches&#8221;+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens.">Manipulation of signaling thresholds in &#8220;engineered stem cell niches&#8221; identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438 (2009).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization.">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).</li><li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li><li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation.">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li><li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., R&#252;ther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells.">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li><li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicistronic+targeting+constructs:+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression.">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nessys:+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D.">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872 (2018).</li><li>Weiswald, L. -. B., Guinebreti&#232;re, J. -. M., Richon, S., Bellet, D., Saubam&#233;a, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres:+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy.">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106 (2010).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li><li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-explorer:+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens.">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).</li><li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium.">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li><li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology.">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning.">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839 (2018).</li><li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms.">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).</li><li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Lamins+a+and+B1.">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level.">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos.">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Hier beschrijven we een methode voor het analyseren van emergente patronen in culturen van cellen. Een vereenvoudigde micropatterning benadering wordt gebruikt voor het standaardiseren van de vorm en grootte van celkolonies, en we presenteren beeldanalyse tools en R-scripts die de detectie en kwantificering van patronen binnen deze kolonies mogelijk maken.
De pijpleiding die wij voorstellen is in zekere mate vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde methode31 , waarbij de auteurs zich richten op de cultuuromstandigheden, met behulp van commercieel verkrijgbare micro patronen, om reproduceerbare kiem lagen vorming te verkrijgen in ESC-kolonies voor de studie van vroege gastrulatie-Events in vitro. Ons doel is meer gericht op het leveren van een generaliseerbare pijpleiding voor de ontdekking van patroonvorming in vitro, waar de collectieve organisatie van de cellen pas zichtbaar kan worden na statistische analyse. Daarom bieden we een robuuste beeldanalyse-workflow die de nauwkeurige identificatie en analyse van de nucleaire positie in de 3D-ruimte over meerdere kolonies mogelijk maakt (Zie ook de sectie ' voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode ' van deze discussie). We hebben ook besloten om een eenvoudige in-House micropatterning aanpak te ontwikkelen die een flexibeler en goedkoper alternatief biedt voor commercieel beschikbare oplossingen op de lange termijn, wat hopelijk nuttig zal zijn voor de Gemeenschap.
Ten slotte merken we op dat tijdens de herziening van dit manuscript, een nieuw pakket voor de analyse van patronen in vitro vergelijkbaar met onze R-scripts is uitgebracht32. Dit nieuwe pakket accepteert tabellen van celfuncties als invoer die kunnen worden verkregen van high-throughput Imaging platforms. Wij zijn van mening dat de tabel van kernen-functies die in stap 7 van ons protocol zijn gegenereerd in principe als input voor dit nieuwe pakket kan dienen, hoewel we deze mogelijkheid zelf niet hebben getest.
Aanpassingsvermogen van de methode voor andere celtypen en kolonie geometrieën
We presenteren deze aanpak in de context van het bestuderen van de opkomst van mesodermale transcriptiefactoren in culturen van pluripotente cellen in de aanwezigheid van serum. De methode is echter gemakkelijk aanpasbaar aan andere celtypes en aan serum vrije culturen, hoewel het nodig kan zijn om de concentraties ECM/poloxamer 407 te optimaliseren (Zie tabel 1 voor geteste concentraties en tabel 2 voor een gids voor probleemoplossing). De methode kan ook worden aangepast aan grotere of kleinere maten van micro patronen en aan een breed scala aan vormen op basis van de behoeften van de gebruiker. Bij het vaststellen van de methode is het echter belangrijk om te beseffen dat niet alle combinaties van vorm/celtype optimaal zijn. Bijvoorbeeld, MESC Express hoge niveaus van E-cadherin33,34 waardoor deze cellen te vormen van collectieve structuren spanning gebieden die verstoken zijn van ECM. Deze cellen volgen niet strikt geometrieën met scherpe hoeken of die kleine gaten in het patroon bevatten. Let op bijvoorbeeld dat op de ring van Figuur 3b, de cellen zijn in het proces van het koloniseren van het centrale gebied. In onze handen heeft een kleiner centraal gebied het mESC niet dwingen om ringvormige kolonies te vormen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om een verscheidenheid aan geometrieën op te nemen tijdens het ontwerpen van de photomask om de optimale maten en krommingen te kunnen testen en te identificeren die geschikt zijn voor het celtype keuze.
Een andere belangrijke factor om rekening mee te houden is de lengte van het experiment en de proliferatie van de cellen. Voor sommige snel prolifererende celtypen (inclusief pluripotente cellen) kan het moeilijk zijn om cellen op micropatterns gedurende vele dagen te onderhouden (voor mESC drie dagen is een maximum). Ook is het zaaien van cellen op micro patronen niet altijd optimaal voor elke kolonie, dus het is raadzaam om een overmaat aan kolonies te zaaien om reserveonderdelen te krijgen.
Voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode
Een bijzonder voordeel van de methode is de mogelijkheid om "gemiddelde" patronen te detecteren door het combineren van beeldanalyse resultaten van meerdere replicaten (Figuur 5). Dit kan patronen onthullen die niet blijken uit de inspectie van individuele kolonies. Een nadeel van deze ' Middelings '-aanpak is dat het bepaalde soorten repetitieve patronen kan missen, bijvoorbeeld kleine vlekken of smalle strepen. Echter, deze soorten patroon kan in plaats daarvan worden onthuld met een combinatie van zorgvuldig gekozen patroon maten8. De pijplijn voorbeeld analyse die hier wordt beschreven, biedt ook kwantitatieve gegevens op zowel single cell-als Colony-resoluties die de mogelijkheid bieden om het niveau van Inter-kolonie variabiliteit te onderzoeken (Figuur 5) of om neighbor-analyse uit te voeren op meerdere Weegschaal10.
Een ander belangrijk voordeel van de gemiddeldenmethode is dat het de mogelijkheid biedt om de preferentiële locatie van veel markers in kaart te laten komen zonder te worden beperkt door beschikbare fluor Foren van detectie kanalen. Inderdaad, hoewel we gebruik maken van slechts twee markers van differentiatie in het hier gepresenteerde werk, maakt het vermogen om kolonies te standaardiseren en "gemiddelde" patronen te extraheren het mogelijk om de distributie kaarten van verschillende verzamelingen van kolonies samen te vergelijken in volgorde om de gegeneraliseerde ruimtelijke relaties van markers aan elkaar te onthullen.
Bovendien, hoewel onze focus hier is geweest om markers van differentiatie te bestuderen, kan de analysemethode worden uitgebreid om andere biologische processen te bestuderen waarvoor nucleaire markers beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld micropatterning van een cellijn die een fluorescentie-celcyclus indicator35 (fucci) bevat, zou het mogelijk maken om te bestuderen hoe de geometrie van het kolonie niveau de celcyclus gebeurtenissen in de groep kan beïnvloeden.
Toekomstige richtingen
De methode is geschikt voor middellange doorvoer beeldanalyse, echter, Image Acquisition is momenteel niet volledig geautomatiseerd en kan worden beperkt voor zeer grote experimenten. De reguliere regelingen van kolonies moeten het mogelijk maken om volledig geautomatiseerde overname routines te creëren die vergelijkbaar zijn met wat is ontwikkeld voor het gemiddelde van de enkelvoudige cel20. Echter, omdat de grootte van het veld dat nodig is om een kolonie te beeld is groot, mogelijk vereisen mosaicking, en omdat kolonies zijn driedimensionaal, het is zeer wenselijk om zowel dataset grootte en acquisitie tijd te verminderen door het Imaging alleen relevante kolonies. Daarom kunnen toekomstige inspanningen worden besteed aan het ontwikkelen van een ' intelligente ' Microscoop die relevante kolonies kan identificeren en de beeld coördinaten aan elk monster aanpast. Dit zal niet alleen verminderen tijd en moeite, maar ook voorkomen dat potentiële operator biases.
De analyse pijplijnen kunnen ook efficiënter worden gemaakt door het aantal stappen te verminderen dat de gebruiker moet nemen. We hebben plannen om een mechanisme voor het bouwen van pijpleidingen te bouwen en R rechtstreeks in onze software te integreren (Zie ook problemen met pickcells-API # 3 en pickcells-rjava # 1 in de issue tracker van onze code repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). De volledige automatisering van de analyseprocedure zal tijd en moeite verminderen en potentiële gebruikers fouten beperken.
Tot slot merken we op dat onze analysemethode het dynamische karakter van cellulair patroon nog niet volledig vastlegt. Sommige beperkte dynamische informatie kan worden geëxtraheerd door het onderzoeken van een tijdreeks van momentopnamen van afbeeldingen8,10,36. Echter, de mogelijkheid om de geschiedenis van de celpopulatie op te nemen is zeer wenselijk als we willen beter begrijpen hoe patronen ontstaat. Een beperking is dat het nauwkeurig volgen van afzonderlijke cellen in een 3D-dichte celpopulatie nog steeds een zeer uitdagende taak is37. Onze cel detectiemethode maakt gebruik van de nucleaire envelop en presteert bijzonder goed op dichte en overlappende celpopulaties28. Live verslaggevers van de nucleaire envelop zijn gemakkelijk beschikbaar28,38 en een voordeel van de micropatterning techniek is dat het kan worden gebruikt om te voorkomen dat de cellen verplaatsen buiten het gezichtsveld tijdens de lange termijn beeldvorming. Over het algemeen zijn we ervan overtuigd dat het geautomatiseerd volgen van cellen haalbaar is met behulp van een combinatie van recent opgerichte tools28,39,40 en dat dit nieuwe inzichten moet opleveren in de fundamentele principes van zelforganisatie.

In zoogdier systemen is patronen een emergente eigenschap van het collectief gedrag van cellen en zo kunnen patronen in vitro worden vormgegeven, indien passende aanwijzingen aan de cellen1,2,3,4, 5 , 6. een manier om het intrinsieke vermogen van de cellen te onthullen om in vitro zelf te organiseren, is door de cellen te dwingen groepen/kolonies te vormen van een gedefinieerde vormen en maten7,8,9,10 . Een techniek die dit mogelijk maakt is micropatterning11. Micropatterning maakt het mogelijk om de locatie waar extracellulaire matrix (ECM) moleculen op een oppervlak worden afgezet nauwkeurig te definiëren. Dit, op zijn beurt dicleert waar de cellen kunnen hechten en daarom bepaalt hoe cellen ruimtelijk organiseren.
Micropatterning is een techniek met tal van toepassingen, bijvoorbeeld micropatterning maakt standaardisatie van initiële omstandigheden voorafgaand aan differentiatie12mogelijk. Belangrijk is dat micropatterning het mogelijk maakt om eenvoudig de grootte, vorm en afstand van celkolonies te beheersen en deze eigenschap kan worden gebruikt om experimenten uit te werken die gericht zijn op het ondervragen van de collectieve respons van de cellen op morfogen of op fysieke signalen7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Er zijn verschillende micropatterning methoden ontwikkeld11. Photopatterning technieken zijn misschien wel de eenvoudigste methoden om18te vestigen. Deze benaderingen hebben ook het voordeel van precisie, omdat ze kunnen worden gebruikt om de vorm van enkele cellen18,19,20te beheersen. Ze vereisen echter ook dure gespecialiseerde apparatuur, waaronder een spin coater, een plasma kamer en een UVO (UV-ozon) reiniger die over het algemeen niet direct beschikbaar zijn in standaard biologie laboratoria. Om het aannemen van de techniek te vergemakkelijken, hebben we het protocol aangepast om alleen de UVO-lamp te vereisen. We starten met de in de handel verkrijgbare plastic dia's die met een schaar kunnen worden gesneden of met een perforator naar het gewenste formaat.
Een belangrijk nut van micropatterns is de mogelijkheid om kolonies te standaardiseren om individuele kolonies over meerdere replicaten te vergelijken. Dit maakt het mogelijk om te vragen in hoeverre de patroonvorming binnen deze kolonies reproduceerbaar is, en om factoren te onderzoeken die de robuustheid van het patronen proces beïnvloeden. Belangrijk is dat de kwantificering van "gemiddelde" patronen in meerdere gestandaardiseerde kolonies ook patroon processen kan onthullen die anders niet zouden blijken. Het voordeel van het kunnen kwantificeren van patronen op gestandaardiseerde kolonies is afhankelijk van de mogelijkheid om de eiwit expressie nauwkeurig te meten, idealiter op het niveau van één cel. Cellen op micro patronen zijn echter vaak strak verpakt, waardoor ze moeilijk te segmenteren zijn met hoge nauwkeurigheid. Cellen organiseren zich ook vaak in drie in plaats van twee dimensies en het kan lastig zijn om driedimensionale (3D) informatie tijdens segmentatie te detecteren en te behouden. Zodra de cellen met succes zijn gesegmenteerd, zijn er rekenmethoden nodig voor het extraheren van patronen uit de resulterende gegevenssets.
We hebben segmentatie-en beeldanalyse tools ontwikkeld om deze problemen te helpen overwinnen. Deze analysemethode maakt alleen gebruik van gratis en open-source software en vereist geen kennis van Command Line of programmering om te implementeren. Om de methode hier te illustreren, gebruiken we muizen embryonale stam (mES) cellen die spontaan een marker van vroege differentiatie brachyury (tbra)21,22uitdrukken. Hoewel geen schijnbare ruimtelijke ordening visueel detecteerbaar is, maakt de methode het mogelijk om een kaart te maken van de preferentiële positionering van T + cellen in kolonies. We tonen ook aan dat Tbra-patronen contrasteert met het ontbreken van een voorkeurs lokalisatie van de cellen die Id1 uitdrukken, een directe uitlezen van het botmorfogenetische eiwit (BMP)-traject23. We bespreken ook de huidige beperkingen van de methode en hoe deze techniek kan worden aangepast aan andere experimentele systemen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

Een fundamenteel doel in de biologie is om te begrijpen hoe patronen ontstaan tijdens de ontwikkeling. Verschillende groepen hebben aangetoond dat patronen in vitro kunnen worden bereikt wanneer stamcellen ruimtelijk beperkt zijn tot micro patronen, waardoor experimentele modellen worden opgezet die unieke mogelijkheden bieden om in vitro de fundamentele principes van biologische Organisatie.
Hier beschrijven we onze eigen implementatie van de methodologie. We hebben een foto-patterning techniek aangepast om de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur te reduceren, zodat het gemakkelijker wordt om de methode in een standaard cel biologie laboratorium te vestigen. We ontwikkelden ook een gratis, open-source en eenvoudig te installeren beeldanalyse kader om de preferentiële positionering van subpopulaties van cellen binnen kolonies van standaard vormen en-maten nauwkeurig te meten. Deze methode maakt het mogelijk om het bestaan van patronen gebeurtenissen te onthullen, zelfs in schijnbaar ongeorganiseerde populaties van cellen. De techniek biedt kwantitatieve inzichten en kan worden gebruikt voor het ontkoppelen van invloeden van de omgeving (bijv. fysieke signalen of endogene signalering), op een bepaald patroon proces.

De hier beschreven foto-patterning methode maakt het mogelijk om gekweekte cellen nauwkeurig te organiseren in kolonies van gedefinieerde vormen en maten. Het succes van deze procedure moet duidelijk zichtbaar zijn onmiddellijk na de celseeding-procedure (stap 3,7), omdat de cellen in de cel worden afgestemd op het photomask-ontwerp zoals weergegeven in Figuur 2a. Bij 1 h na het zaaien van cellen kunnen individuele patronen niet volledig samengaan (slechts een paar cellen per patroon), maar naarmate de cellen na verloop van tijd toenemen, zullen patronen volledig gekoloniseerd worden met slechts zeer weinig cellen buiten de Kleef vlakken (Figuur 2b). Het exacte uiterlijk van de cultuur zal afhankelijk zijn van de cellijn. Bijvoorbeeld, mESC vorm kolonies in koepel vorm10. Een chip waarbij patronen niet helder zijn 1 tot 2 uur na het zaaien van cellen geeft aan dat de procedure is mislukt (figuur 2c, d).
Grote en dikke kolonies kunnen soms een uitdaging zijn om homogeen te vlekken. Wij stellen voor om te repareren en permeabilize de cellen in één stap (sectie 4) als dit kan verbeteren antilichaam penetratie29. Dit is de reden waarom de gekozen fixatieve oplossing een reinigingsmiddel bevat. Figuur 3 toont het fluorescentie signaal dat na immunokleuring wordt verwacht. Merk op dat heldere Id1 positieve cellen worden gevonden in dichte gebieden (heldere NPC-gebieden) van de kolonies (Figuur 3a). Hints zoals deze zijn nuttig om de kwaliteit van de antilichaam kleurings procedure te beoordelen. Merk ook op dat de micro patronen gemaakt met de huidige techniek zijn auto fluorescerende. Dit signaal (afbeelding 3a, B links de meeste afbeeldingen) is nuttig tijdens de analyse fase om kolonies met elkaar te registreren en de resultaten te creëren die worden weergegeven in Figuur 5. Het autofluorescentie signaal is over het algemeen de helderste wanneer het monster opgewonden is met een 405 nm laser en dit kanaal moet zonder vlekken voor dit doel worden achtergelaten. Figuur 3 laat ook zien hoe de cellen nauwkeurig worden beperkt op patronen van verschillende vormen.
De analyse van beeldvormende gegevens wordt uitgevoerd in PickCells, een gratis en open-source software ontwikkeld in ons lab (Blin et al., in voorbereiding). Deze software bevat de beeldanalyse modules om confocale beelden (Figuur 4-1) te lezen en te sorteren, om te segmenteren (Figuur 4-2,4-4) en om gesegmenteerde objecten te cureren (Figuur 4-3, 4-5), om object te berekenen eigenschappen zoals coördinaten of gemiddelde intensiteit (Figuur 4-6) en om de gegevens te exporteren (Figuur 4-7, 4-8). Belangrijk, we ontwikkelden een robuuste nucleaire segmentatie methode genaamd Nessys28 die is vooral geschikt voor dichte en heterogene populaties van cellen, zoals cellen geteeld op micro patronen (Figuur 3). Figuur 4 -2 toont een representatieve uitvoer van de nessys-module waar elke afzonderlijke cel nauwkeurig een unieke kleuridentiteit krijgt. Slechts minimale bewerking moet nodig zijn, maar bewerking is haalbaar als de gebruiker dit besluit (Figuur 4-3). Eindelijk PickCells biedt een aantal visualisatie modules om de gegevens te visualiseren. Een voorbeeld is gegeven in Figuur 4-6: een ringvormige kolonie wordt gerenderd in 3D, waar kernen in kleur gecodeerd zijn volgens hun positie langs de z-as. Zodra de analyse is gevalideerd in PickCells, kunnen gegevens worden geëxporteerd om de ruimtelijke kaarten in R te maken met behulp van de scripts die beschikbaar zijn op (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) zoals weergegeven in afbeelding 530.
We hebben onlangs aangetoond dat de ruimtelijke opsluiting van mESC op kleine (30.000 μm2) schijf of ellips micropatterns het patroon begeleidt van een subpopulatie van cellen die de mesodermale marker tbra10uitdrukken. Dus, om onze methode hier te illustreren, vragen we of het patroon van Tbra kan worden beïnvloed door BMP-signalering in grotere kolonies (90.000 μm2). Figuur 5a laat zien dat wanneer MESC worden geteeld op grote schijf Micropatterns, tbra + cellen bij voorkeur beperkt tot de omtrek van het patroon (tbra + dichtheids kaart), waar de lokale celdichtheid de laagste is (Zie de blauwe kaart aan de linkerkant van figuur 5a ). Dit patroon van Tbra wordt bevestigd door de kaart van de gemiddelde intensiteit van de Tbra.
Deze gegevens tonen aan dat de methode subvisuele informatie kan onthullen. Sterker nog, uit Figuur 3is een visuele inspectie van één kolonie niet voldoende om enige vorm van ruimtelijke ordening in de tbra-uitdrukking te identificeren. Dit wordt met name verklaard door de belangrijke kolonie van de variabiliteit van de kolonie die wordt gekwantificeerd en weergegeven in het meest rechtse paneel van figuur 5a.
De techniek toont ook aan dat er geen detecteerbaar patroon bestaat voor Id1 (een doelwit van BMP-signalering), wat kan aangeven dat T-patroon niet wordt aangestuurd door BMP-signalering in deze context.
Micropatterning maakt het mogelijk om kolonies te dwingen om bijna elke gewenste geometrie aan te nemen. Dit is met name handig om te ondervragen hoe het systeem reageert op verschillende geometrieën. We kunnen bijvoorbeeld de reden hebben dat als een morfogen gradiënt in het midden van de kolonie opbouwt, het creëren van een gat in de kolonie deze gradiënt zou verstoren. Interessant is dat we nog steeds patronen observeren op een ring micro patroon, zij het op een minder robuuste manier (Figuur 5b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig1.jpg"> Figuur 1: overzicht van de methode. Het diagram dat de belangrijkste stappen van de methode weergeeft. Voor elke stap wordt de geschatte hoeveelheid tijd aangegeven onder de naam van de taak en een schematische voorstelling van het doel van de procedure. Een verwijzing naar een relevant cijfer wordt ook verstrekt indien beschikbaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig2.jpg"> Figuur 2: Cultuur uiterlijk 1 uur en 48 uur na het zaaien van de cellen op micro patronen. Brightfield-beelden van mESC zijn op micro patronen geseeid. a) verwachte celorganisatie 1 uur na het zaaien moeten de patronen duidelijk herkenbaar zijn. b) verwacht resultaat na 48 h van de culturen. mESC zijn toegenomen en zijn nog steeds strikt beperkt tot de patroon vormen. (c-d) Mogelijke niet-optimale uitkomsten, ofwel zeer weinig cellen houden zich aan het plastic, behalve aan de omtrek van de dia (c) of cellen zich tussen de patronen (d) hechten. Zie tabel 2 voor een gids voor probleemoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig3.jpg"> Figuur 3: representatieve confocale beelden van immuunbevlekte kolonies die op micro patronen zijn geteeld. Representatieve mESC-kolonies na immunofluorescentie voor (A) Id1 en nucleair porie complex of (B) tbra en LaminB1. Voor elke kleuring, een kolonie geteeld op een schijf micro patroon en een kolonie geteeld op een ring micro patroon wordt getoond. Afzonderlijke kanalen worden geleverd als afbeeldingen met een grijs schaal. Let op het duidelijke automatische fluorescentie signaal van het micro patroon (405 nm Laser excitatie). Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig4.jpg"> Figuur 4: stroomdiagram van de beeldanalyse procedure. Een lijst met 3D-confocale beelden wordt voor analyse geïmporteerd in PickCells (1). Dit voorbeeld toont een experiment met twee verschillende vormen (schijven en ringen zoals in Figuur 2). De naamgevingsconventie voor afbeeldingen wordt weergegeven aan de linker-en PickCells-interface aan de rechterkant. Vervolgens wordt de Nessys-module gebruikt om automatisch kernen te segmenteren (2). In de screenshot krijgt elke individuele Nucleus een unieke kleur die nauwkeurige segmentatie aangeeft. De auto fluorescentie van het patroon is ook gesegmenteerd, dit keer, met behulp van de ' basis segmentatie ' module (4). Achtergrond wordt weergegeven in blauw en wit signaal wordt gedefinieerd als de patroon vorm. Gesegmenteerde vormen worden vervolgens visueel geïnspecteerd om nauwkeurige segmentatie te garanderen, en indien nodig bewerkt met behulp van de segmentatie-Editor module (3 – 5). De schermafbeeldingen tonen de omtrek van de gedetecteerde vormen. De roze en gele vormen zijn bewerkt. Ten slotte worden objecten functies berekend en geëxporteerd naar een bestand dat later wordt verwerkt tot R (6 – 7). Een screenshot van een kolonie weergegeven als een 3D-weergave is voorzien (6). Voor de stappen 2 tot 6 de pictogrammen gevonden in de PickCells-interface op het moment van schrijven van dit artikel worden gegeven naast de stap-index. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig5.jpg"> Figuur 5: representatieve resultaten voor twee verschillende transcriptiefactoren en micro patroon vormen Binned ruimtelijke kaart voor mESC geteeld voor 48 h op (a) schijfvormige micro patronen of (B) ringvormige micro patronen. Voor elke micropattern vorm wordt de kaart van celdichtheid, ongeacht het fenotype van de cel, links met een blauwe kleur schaal getoond. Vervolgens voor elke marker (Tbra op de bovenste rij en Id1 op de onderste rij), drie verschillende kaarten worden verstrekt, van links naar rechts: celdichtheids kaart van marker die alleen cellen uitdrukt (op drempel gebaseerde analyse), de kaart van de gemiddelde markerings intensiteit (LOG2) en de kaart van de standaarddeviatie van de markerings intensiteit. Intensiteiten worden gegeven als willekeurige fluorescentie-eenheden. Voor elke kaart wordt de micro patroon vormgegeven als een witte omtrek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ECM-type</td>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Membraan matrix in de kelder</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Concentratie</td>
			<td>ECM-concentratie</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>20 μg/mL</td>
			<td>200 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poloxamer 407 concentratie</td>
			<td>500 μg/mL</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Getest met</td>
			<td>mESC</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mepisa</td>
			<td>No</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Serum vrij medium</td>
			<td>No</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: geteste concentraties van poloxameer 407 en ECM. Deze tabel geeft een overzicht van de concentraties van ECM en poloxameer 407 die we in ons laboratorium hebben getest. Voor elke ecu/poloxamer 407-combinatie wordt het celtype waarvoor het patroon succesvol is bereikt, getoond, evenals de vraag of de cultuur serum bevatte of niet. mESC = embryonale stamcel van de muis, Mepisa = muis epiblast stamcel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Procedure</td>
			<td>Observatie</td>
			<td>Mogelijke probleem</td>
			<td>Oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">Micropatterning</td>
			<td rowspan="3">Lage celbevestiging</td>
			<td>ongeschikte ECM/poloxamer 307 concentratie ratio</td>
			<td>Verhoog de concentratie ratio ECM/poloxamer 307</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celbijlage tijd te kort</td>
			<td>Verhoog de incubatietijd om voldoende tijd te geven aan de cellen om zich goed te houden aan patronen (stap 3,4). Om deze stap te optimaliseren, kan het controleren van de cellen onder een Microscoop helpen bij het detecteren van een verandering in celmorfologie die aangeeft dat de cellen zijn begonnen te hechten.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wast te intens (stap 3,6)</td>
			<td>Voor het vervangen van medium, Vermijd Pipetteer medium rechtstreeks op de chips. Pipet in plaats daarvan het medium zachtjes op de wanden van de put in plaats</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Cellen houden zich tussen de patronen</td>
			<td>ongeschikte ECM/poloxamer 307 concentratie ratio</td>
			<td>Verlaag de concentratie ratio ECM/poloxamer 407</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celbijlage tijd te lang</td>
			<td>Verlaag de incubatietijd (stap 3,4).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wast ineffectief (stap 3,6)</td>
			<td>De plaat krachtig schudden is meestal voldoende om de cellen in overmaat te losmaken. Voor celtypen die de neiging hebben om sterk aan de chip te hechten, kan pipetteren rechtstreeks op de chip het resultaat verbeteren. Het verhogen van het aantal wast kan ook helpen, met name om ervoor te zorgen dat er geen cel zwevend in het medium na deze stap blijven.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Cellen volgen niet strikt de patroon vorm</td>
			<td>' Incompatibel ' celtype en patroon geometrie</td>
			<td>Plan/ontwerp meerdere geometrieën/grootten die aan de photomask worden toegevoegd om de optimale patroon grootte voor een bepaalde patroon vorm en celtype te kunnen testen en identificeren. Raadpleeg de sectie ' beperkingen ' in de discussie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niet-optimale foto-patterning, dit kan worden gediagnosticeerd door het observeren van de scherpte van het autofluorescentie signaal. Patroon grenzen moeten scherp uitzien zoals in Fig. 2. Als de randen van de patronen wazig worden weergegeven, moet de foto-patterning stap worden verbeterd.</td>
			<td>Scherpe patroon randen geven aan dat de plastic Slide niet dicht genoeg bij het oppervlak van het masker was tijdens de verlichtings stap. Zorg ervoor dat de stukken die de glijbanen aan de photomask vasthouden zelfs zijn en dat er tijdens de verlichtings procedure een constante en voldoende druk op de montage wordt uitgeoefend.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Kleuring</td>
			<td rowspan="2">Niet-homogene kleuring</td>
			<td>incubatietijd van het antilichaam te kort</td>
			<td>Verhoog de incubatietijd van het antilichaam (tot 24 uur bij kamertemperatuur)</td>
		</tr>
<tr>
<td>kolonies afgevlakt tijdens de montage procedure</td>
			<td>Monteer micro patroon dia's in een kamer zoals chamlide of cytoo-kamers om zowel immunokleuring als beeldvorming uit te voeren zonder de cellen te hoeven monteren. Dit zal beter de kolonies 3D-structuur te behouden.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Loskoppelen van kolonies tijdens de kleurings procedure</td>
			<td>Dewetting van de chip</td>
			<td>Laat voldoende medium staan of gebruik 2 pipetten, één om het medium te verwijderen en de andere om de nieuwe oplossing toe te voegen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kolonies lijken onder de Microscoop geschoren</td>
			<td>kolonies werden geschoren tijdens het monteren van de chip op de microscopie dia</td>
			<td>Wees heel voorzichtig bij het monteren van de chips. Als alternatief worden de micropatterns in een kamer, zoals chamlide of cytoochambers, op een andere wijze uitgevoerd om zowel immunokleuring als beeldvorming uit te voeren zonder de cellen te hoeven monteren. Dit behoudt ook de kolonie ultrastructure.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: gids voor probleemoplossing. Deze tabel geeft een overzicht van mogelijke suboptimale uitkomsten. De potentiële bronnen van de problemen worden ook vermeld samen met de aanbevolen oplossingen.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Deze methode maakt het mogelijk om te manipuleren en te kwantificeren hoe de cellen zich collectief organiseren. Dit is belangrijk omdat we patroon kunnen modelleren in in vitro en disentangle cues strak gekoppeld in vivo. De techniek vereist minimale specialistische apparatuur, waardoor het kan worden vastgesteld in een standaard biologie lab, en het is kwantitatief, waardoor de ontdekking van sub-visuele patronen gebeurtenissen.Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op elk celsysteem waar patronen kunnen ontstaan en om niet-willekeurige patronen van differentiatie, proliferatie en cel-tot-celconcurrentie te ontdekken. De belangrijkste met deze methode is de systematische optimalisatie van micropatterning parameters voor nieuwe celtypes. Bijvoorbeeld patroongrootte en vorm, type matrix en celhechtingstijd.Het dragen van handschoenen, plaats een stuk laboratoriumfilm in de bodem van een 10-centimeter vierkante petrischaal. Gebruik een 12-millimeter gat punch om hydrofobe plastic glijbanen te snijden om 12-millimeter-rond deksel slips te creëren, en plaats de cover slips in een nieuwe Petri schotel. Gebruik een pincet om de beschermfolie voorzichtig uit de afdekslipjes te verwijderen.Plaats het fotomasker op een schoon en stabiel oppervlak, chroom zij omhoog, en voeg een twee-microliter druppel van dubbel gedestilleerd water op de positie van de gewenste chip ontwerp. Druk voorzichtig een afslag op de druppel en plaats de houder bovenop de plastic glijbanen. Bevestig deze sandwich voorzichtig met klemmen om de plastic stukken in contact te houden met het fotomasker.Plaats de montage in een ultraviolette ozonlamp ongeveer twee centimeter van de lichtbron voor een verlichting van 10 minuten. Aan het einde van de verlichtingsperiode, pak de sandwich met het fotomasker aan de onderkant en verwijder voorzichtig de klemmen met behoud van druk met één hand om te voorkomen dat de dia's bewegen tijdens het demonteren van de sandwich. Wanneer alle klemmen zijn verwijderd, verwijder de houder, zorg ervoor dat alle plastic stukken zijn nog steeds op het masker en niet vast te zitten aan de houder, en voeg dubbel gedestilleerd water aan de chips om voorzichtig los de chips van het fotomasker.Plaats de chips met fotopatroon in de matrixafzettingskamer, verlicht naar boven, en voeg 200 microliter coatingoplossing toe aan elke chip. Voeg vervolgens 's nachts een petrischaal van drie centimeter gevuld met dubbelgedestilleerd water toe aan de kamer om verdamping bij vier graden Celsius 's nachts te beperken. Voor het zaaien van embryonale cellen op de chips, was de chips met twee ten minste vijf minuten wast in verse, steriele PBS per wasbeurt, alvorens een keer tien tot de vijfde cellen in 200 microliter van de juiste celkweek medium op elke chip.Sluit vervolgens de zaaikamer. Een uur lang uitbroeden zodat de cellen zich aan de chips kunnen hechten. Wanneer de cellen zijn bevestigd, vul de putten van een multiwell plaat met 500 microliters van warm medium per put, en gebruik steriele pincet om de chips over te brengen in individuele plaat putten.Schud de plaat krachtig om niet-aanhangende cellen los te maken en vervang de supernatant onmiddellijk door vers, warm medium. Controleer vervolgens onder de microscoop of patronen zichtbaar zijn. 48 uur na hun beplating moeten de cellen dichte kolonies vormen die de vorm van de patronen rigoureus volgen.Laat de chips in de plaat, verwijder alles behalve net genoeg medium om te voorkomen dat de chips uitdrogen, en voeg ten minste 500 microliter van paraformaldehyde of PFA-gebaseerde fixatie oplossing per goed. Na tien minuten, kort wassen de putten drie keer met wasoplossing, gevolgd door een wasbeurt met 50-millimolar ammoniumchloride verdund in wasoplossing om resterende PFA crosslinking activiteit te blussen. Behandel de monsters na de laatste wasbeurt gedurende ten minste 30 minuten met een blokkeeroplossing.Voor immunostaining van de chipculturen, breng de chips in een kleurkamercel naar boven en voeg onmiddellijk 100 microliters toe van de primaire antilichaamoplossing die van belang is voor elke chip. Na een uur op een roterend platform bij kamertemperatuur, was de chips drie keer met wasoplossing zoals aangetoond, en broed de chips met de juiste secundaire antilichamen gedurende een uur op het roterende platform. Aan het einde van de secundaire antilichaam incubatie, was de chips drie keer in wasoplossing en monteer de chip op een microscopie schuif met 20 microliters van een standaard montagemedium.Als u de chips wilt beelden, past u eerst de scansnelheid, beeldresolutie, framemiddeling en detectorverding aan om een optimaal tussen de beeldkwaliteit en de beeldtijd te identificeren. Dan verwerven beelden van elke chip. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, installeer en voer PickCells uit volgens de documentatie die online beschikbaar is, maakt u een nieuw experiment en importeert u de afbeeldingen in het programma.Gebruik de Nessys module om de kernen te segmenteren op basis van het nucleaire envelopsignaal. Gebruik de basissegmentatiemodule om het autofluorescentiesignaal van het patroon te identificeren. Klik vervolgens op Voltooien en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.Als u nuclei-objecten wilt maken en basisobjectfuncties wilt berekenen, start u de module Intrinsieke functies vanaf de taakbalk en sluit u de deelvensters Ellipsoïde fitter en surface-afzuigpaneel om alleen het deelvenster Basisfuncties open te houden. Selecteer nucleus"als objecttype en selecteer het opgegeven voorvoegsel voor de gesegmenteerde afbeeldingen. Klik vervolgens op Compute" en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.In dit stadium moeten extra functies in kernen worden geschreven voordat de gegevens voor onze analyse worden geëxporteerd. Als u bijvoorbeeld de naam van de afbeelding wilt opslaan waartoe elke kern behoort als een nucleuskenmerk, klikt u op Gegevens en nieuw kenmerk en selecteert uker"in de pop-updialoog. Klik op OK"selecteer Gegevens verzamelen van andere objecten die zijn verbonden met het knooppunt" en klik op Volgende"Selecteer Afbeelding in het linkerdeelvenster en dubbelklik op het ondervragingsteken om het afbeeldingsknooppunt in te stellen als doel van het pad.Vouw het deelvenster Bewerking Reductie uit en selecteer Eén ophalen:Het deelvenster Beschikbaar attribuut uitvouwen en selecteer het kenmerk Naam. Klik vervolgens op Wijzigen en Volgende"Afbeeldingsnaam invoeren, druk op de Tab-toets en klik op Voltooien"Exporteer de gegevens vervolgens naar een door tabbladen gescheiden waardebestand. Voor onze analyse worden de geëxporteerde gegevens herhaald naar de gegevensmap van de R-Script-map.Open Onze studio en open de mapsjabloon R-Script binned"Stel vervolgens de werkmap in op de bronbestandslocatie en voer het script uit om dichtheidskaarten te genereren. Op een uur na celzaaien, de individuele celcultuur pattens kan niet volledig worden samengevoegd als de cellen vermenigvuldigen na verloop van tijd. Echter, de patronen zullen volledig gekoloniseerd met slechts zeer weinig cellen buiten de kleefoppervlakken.Patroon dat niet duidelijk is tot twee uur na het zaaien duidt op een storing van de procedure. De ruimtelijke opsluiting van embryonale stamcellen van muizen op grote schijven of ringmicropatronen leidt de patronen van een subpopulatie cellen die de mesodermale brachyurymarker uitdrukken. Wanneer de embryonale stamcellen van de muis bijvoorbeeld worden gekweekt op micropatronen op grote schijven, zijn de brachyury-positieve cellen bij voorkeur beperkt tot de periferie van het patroon waar de lokale celdichtheid het laagst is.Deze patroon wordt bevestigd door de kaart van de intensiteit van de hersenen-brachyury. Deze gegevens tonen aan dat de methode subvisueele informatie kan onthullen, aangezien de inspectie van één kolonie niet voldoende is om enige vorm van ruimtelijke organisatie in merker van interesseexpressie te identificeren. Dit wordt met name verklaard door de belangrijke variabiliteit van kolonie tot kolonie.De techniek toont ook aan dat er geen detecteerbare patronen bestaan voor remmer van DNA-bindende die erop kan wijzen dat T-patroon niet wordt aangedreven door botmorfogenetische eiwitsignalering in deze context. Onthoud altijd welke kant van de cover slip heeft geëlimineerd en gecoat en ook zorg ervoor dat de cellen goed hebben gehecht voor het afwassen van de overtollige cellen. Deze methode maakt het mogelijk de studie van de milieu-signalen belangrijk in het begeleiden van zelf-organisatie van cellen en kan ook wiskundige modellen die ons helpen beter onder de rudimental patroon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generatie Aggregaten van muis embryonale stamcellen die Toon symmetriebreking, polarisatie en Emergent Collective Gedrag<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...