Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
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Ce travail a été financé par une bourse postdoctorale Sir Henry Wellcome (WT100133 à G.B.), une bourse d'études supérieures Wellcome Trust (WT103789AIa à S.L.), et un doctorat de Wellcome Trust à (108906/Z/15/Z à D.W.). Nous sommes également reconnaissants au Dr Manuel Thery pour ses conseils sur l'adaptation de la technique de photopatterning.

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Les auteurs n'ont rien à révéler

Ici nous décrivons une méthode pour analyser le modelage émergent dans les cultures des cellules. Une approche simplifiée de micropatterning est utilisée pour normaliser la forme et la taille des colonies cellulaires, et nous présentons des outils d'analyse d'image et des scripts R qui permettent la détection et la quantification des modèles au sein de ces colonies.
Le pipeline que nous proposons est similaire dans une certaine mesure avec une méthode31 publiée précédemment où les auteurs se concentrent sur les conditions de culture, en utilisant des micromodèles disponibles dans le commerce, pour obtenir la formation reproductible de couche germinale dans les colonies esC pour le l'étude des événements précoces de gastrulation in vitro. Notre objectif est plus axé sur la fourniture d'un pipeline généralisable pour la découverte de la formation de modèles in vitro où l'organisation collective des cellules ne peut devenir apparente qu'après analyse statistique. Pour cette raison, nous fournissons un workflow d'analyse d'image robuste qui permet l'identification et l'analyse précises de la position nucléaire dans l'espace 3D sur plusieurs colonies (voir aussi la section « Avantage et limitations de la méthode de détection des motifs » de cette discussion). Nous avons également décidé de développer une approche simple de micropatterning interne qui offre une alternative plus flexible et moins chère aux solutions disponibles dans le commerce à long terme qui, nous l'espérons, seront utiles à la communauté.
Enfin, nous notons que lors de la révision de ce manuscrit, un nouveau paquet pour l'analyse des motifs in vitro similaire à nos scripts R a été publié32. Ce nouveau paquet accepte les tables de caractéristiques cellulaires comme entrée qui peuvent être obtenues à partir de plates-formes d'imagerie à haut débit. Nous croyons que la table des caractéristiques des noyaux générées à l'étape 7 de notre protocole pourrait en principe servir d'entrée à ce nouveau paquet, bien que nous n'ayons pas testé cette possibilité nous-mêmes.
Adaptabilité de la méthode à d'autres types de cellules et géométries de colonies
Nous présentons cette approche dans le contexte d'étudier l'émergence des facteurs de transcription mésodermales dans les cultures des cellules pluripotentes en présence du sérum. Cependant, la méthode est facilement adaptable à d'autres types de cellules et aux cultures sans sérum, bien qu'il puisse être nécessaire d'optimiser les concentrations d'ECM/poloxamer 407 (voir le tableau 1 pour les concentrations testées et le tableau 2 pour un guide de dépannage). La méthode peut également être adaptée à des tailles plus ou moins grandes de micromodèles et à un large éventail de formes en fonction des besoins de l'utilisateur. Cependant, tout en établissant la méthode, il est important d'être conscient que toutes les combinaisons de forme /type cellulaire ne sont pas optimales. Par exemple, le MESC exprime des niveaux élevés d'E-cadherin33,34 permettant à ces cellules de former des structures collectives couvrant des zones dépourvues d'ECM. Ces cellules ne suivent pas strictement les géométries avec des angles pointus ou qui incluent de petits trous dans le modèle. Notez par exemple que sur l'anneau de la figure 3B, les cellules sont en train de coloniser la zone centrale. Dans nos mains, une zone centrale plus petite n'a pas forcé le MESC à former des colonies en forme d'anneau. Il est donc fortement recommandé d'inclure une diversité de géométries lors de la conception du photomask pour être en mesure de tester et d'identifier les tailles optimales et les courbures qui seront adaptés pour le type de cellule de choix.
Un autre facteur important à prendre en considération est la durée de l'expérience et le taux de prolifération des cellules. Pour certains types de cellules qui prolifèrent rapidement (y compris les cellules pluripotentes), il peut être difficile de maintenir les cellules sur des micromodèles sur plusieurs jours (Pour mESC trois jours est un maximum). En outre, l'ensemencement des cellules sur les micromodèles ne se produit pas toujours de manière optimale pour chaque colonie, il est donc conseillé de semer un excès de colonies afin d'avoir des pièces de rechange.
Avantage et limitations de la méthode de détection des modèles
Un avantage particulier de la méthode est la capacité de détecter les modèles « moyens » en combinant les résultats de l'analyse d'image provenant de colonies de repli multiples (figure 5). Cela peut révéler des événements de modelage qui ne sont pas apparents de l'inspection des colonies individuelles. Un inconvénient de cette approche de « moyenne » est qu'elle peut manquer certains types de modèles répétitifs, par exemple de petites taches ou des bandes étroites. Cependant, ces types de modèle peuvent plutôt être révélés avec une combinaison de tailles de modèle soigneusement choisies8. De plus, le pipeline d'analyse d'images décrit ici fournit des données quantitatives à la fois à une seule cellule et à la résolution de la colonie, offrant la possibilité d'étudier le niveau de variabilité intercoloniale (figure 5) ou d'effectuer l'analyse des voisins à plusieurs échelles10.
Un autre avantage important de la méthode de la moyenne est qu'elle offre la possibilité de cartographier l'emplacement préférentiel de nombreux marqueurs sans être limité par les fluorophores disponibles des canaux de détection. En effet, bien que nous n'utilisions que deux marqueurs de différenciation dans les travaux présentés ici, la capacité de normaliser les colonies et d'extraire des modèles « moyens » permet de comparer les cartes de distribution de différents ensembles de colonies afin de pour révéler les relations spatiales généralisées des marqueurs les uns aux autres.
En outre, bien que notre objectif ici ait été d'étudier des marqueurs de différenciation, la méthode d'analyse peut être étendue pour étudier d'autres processus biologiques pour lesquels des marqueurs nucléaires sont disponibles. Par exemple, le micromodelage d'une lignée cellulaire contenant un indicateur de cycle cellulaire d'ubiquitination de fluorescence35 (FUCCI) permettrait d'étudier comment la géométrie du niveau des colonies peut influencer les événements du cycle cellulaire dans le groupe.
Orientations futures
La méthode est favorable à l'analyse d'image de débit moyen, cependant, l'acquisition d'image n'est actuellement pas entièrement automatisée et peut devenir limitante pour les expériences très grandes. Les arrangements réguliers des colonies devraient permettre de créer des routines d'acquisition entièrement automatisées semblables à ce qui a été développé pour une cellule unique en moyenne20. Cependant, parce que la taille du champ nécessaire pour l'image d'une colonie est grande, nécessitant peut-être mosaïque, et parce que les colonies sont tridimensionnelles, il est hautement souhaitable de réduire à la fois la taille des ensembles de données et le temps d'acquisition par l'imagerie que les colonies pertinentes. Par conséquent, des efforts futurs pourraient être consacrés à la mise au point d'un microscope « intelligent » capable d'identifier les colonies pertinentes et d'adapter les coordonnées d'imagerie à chaque échantillon. Cela permettra non seulement de réduire le temps et les efforts, mais aussi d'éviter les biais potentiels de l'opérateur.
Les pipelines d'analyse peuvent également être rendus plus efficaces en réduisant le nombre de mesures que l'utilisateur doit prendre. Nous avons l'intention de construire un mécanisme de construction de pipelines et d'intégrer R directement dans notre logiciel (voir aussi les questions pickcells-api-3 et pickcells-rjava-1 dans le tracker d'émission de nos référentiels de code [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). L'automatisation complète de la procédure d'analyse réduira le temps et l'effort et limitera les erreurs potentielles de l'utilisateur.
Enfin, nous notons que notre méthode d'analyse ne saisit pas encore pleinement la nature dynamique du modelage cellulaire. Certaines informations dynamiques limitées peuvent être extraites en examinant une série chronologique d'images instantanées8,10,36. Cependant, être en mesure d'enregistrer l'histoire de la population cellulaire est hautement souhaitable si nous voulons mieux comprendre comment le modèle émerge. Une limitation est que le suivi précis des cellules individuelles dans une population de cellules denses 3D reste une tâche très difficile37. Notre méthode de détection cellulaire utilise l'enveloppe nucléaire et fonctionne particulièrement bien sur les populations cellulaires denses et qui se chevauchent28. Les journalistes en direct de l'enveloppe nucléaire sont facilement disponibles28,38 et un avantage de la technique de micro-patterning est qu'il peut être utilisé pour empêcher les cellules de se déplacer en dehors du champ de vision pendant l'imagerie à long terme. Dans l'ensemble, nous sommes convaincus que le suivi automatisé des cellules sera réalisable à l'aide d'une combinaison d'outils récemment mis en place28,39,40 et que cela devrait apporter de nouvelles idées dans le fondamental principes d'auto-organisation.

Dans les systèmes mammifères, le modelage est une propriété émergente du comportement collectif des cellules et ainsi, les modèles peuvent se former in vitro si des indices appropriés sont fournis aux cellules1,2,3,4, 5 Annonces , 6. Une façon de révéler la capacité intrinsèque des cellules à s'auto-organiser in vitro est de forcer les cellules à former des groupes/colonies d'une forme et d'une taille définies7,8,9,10 . Une technique qui permet cela est micropatterning11. Le micro-patterning permet de définir avec précision l'emplacement où les molécules de matrice extracellulaire (ECM) sont déposées sur une surface. Ceci, à son tour dicte où les cellules peuvent adhérer et contrôle donc la façon dont les cellules s'organisent spatialement.
Le micropatterning est une technique avec de nombreuses applications, par exemple, le micropatterning permet la normalisation des conditions initiales avant la différenciation12. Fait important, le micro-modèle permet de contrôler facilement la taille, la forme et l'espacement des colonies cellulaires et cette propriété peut être utilisée pour concevoir des expériences visant à interroger la réponse collective des cellules à la morphogène ou aux indices physiques7 , 8 Annonces , 10 Ans et plus , 13 (en) , 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17.
Plusieurs méthodes de micro-patterning ont été développées11. Les techniques de photopatterning sont peut-être les méthodes les plus faciles à établir18. Ces approches ont également l'avantage de la précision car elles peuvent être utilisées pour contrôler la forme des cellules simples18,19,20. Cependant, ils ont également besoin d'équipement spécialisé coûteux, y compris un spin coater, une chambre à plasma et un UVO (UV-Ozone) nettoyant qui ne sont généralement pas facilement disponibles dans les laboratoires de biologie standard. Pour faciliter l'adoption de la technique, nous avons adapté le protocole pour ne nécessiter que la lampe UVO. Nous commençons à partir de diapositives en plastique disponibles dans le commerce qui peuvent être coupés avec des ciseaux ou avec un poinçon de trou au format désiré.
Une utilité importante des micromodèles est la capacité de normaliser les colonies afin de comparer les colonies individuelles à travers de multiples répliques. Cela permet de se demander dans quelle mesure la formation des motifs au sein de ces colonies est reproductible, et d'explorer les facteurs qui influencent la robustesse du processus de modelage. Fait important, la quantification des modèles « moyens » dans plusieurs colonies normalisées peut également révéler des processus de modelage qui ne seraient pas apparents autrement. L'avantage de pouvoir quantifier le modelage sur des colonies normalisées dépend de la mesure de mesurer avec précision l'expression des protéines, idéalement au niveau des cellules uniques. Cependant, les cellules sur les micromodèles sont souvent serrées, ce qui les rend difficiles à segmenter avec une grande précision. Les cellules s'organisent souvent en trois dimensions plutôt qu'en deux dimensions, et il peut être difficile de détecter et de préserver l'information tridimensionnelle (3D) pendant la segmentation. Une fois que les cellules ont été segmentées avec succès, des méthodes de calcul sont nécessaires pour extraire l'information de modèle des ensembles de données résultants.
Nous avons développé des outils de segmentation et d'analyse d'images pour aider à surmonter ces problèmes. Cette méthode d'analyse n'utilise que des logiciels libres et open-source et ne nécessite pas de connaissance de la ligne de commande ou de la programmation pour la mise en œuvre. Pour illustrer la méthode ici, nous utilisons des cellules de tige embryonnaire de souris (MES) qui expriment spontanément un marqueur de brachyury de différenciation tôt (Tbra)21,22. Bien qu'aucun arrangement spatial apparent ne soit visuellement détectable, la méthode permet la création d'une carte du positionnement préférentiel des cellules Tdans les colonies. Nous montrons également que le modelage de Tbra contraste avec l'absence d'une localisation préférentielle des cellules exprimant Id1, une lecture directe de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) voie23. Nous discutons également des limites actuelles de la méthode et de la façon dont cette technique peut être adaptée à d'autres systèmes expérimentaux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

Un objectif fondamental en biologie est de comprendre comment les modèles émergent au cours du développement. Plusieurs groupes ont montré que le modelage peut être réalisé in vitro lorsque les cellules souches sont confinées spatialement sur des micromodèles, mettant ainsi en place des modèles expérimentaux qui offrent des possibilités uniques d'identifier, in vitro, les principes fondamentaux de la biologie organisation.
Ici, nous décrivons notre propre mise en œuvre de la méthodologie. Nous avons adapté une technique de photo-modèle pour réduire le besoin d'équipement spécialisé pour faciliter l'établissement de la méthode dans un laboratoire standard de biologie cellulaire. Nous avons également développé un cadre d'analyse d'image gratuit, open-source et facile à installer afin de mesurer précisément le positionnement préférentiel des sous-populations de cellules dans des colonies de formes et de tailles standard. Cette méthode permet de révéler l'existence d'événements de modelage même dans des populations apparemment désorganisées de cellules. La technique fournit des informations quantitatives et peut être utilisée pour découpler les influences de l'environnement (p. ex., indices physiques ou signalisation endogène), sur un processus de modelage donné.

La méthode de photo-modèle décrite ici permet d'organiser précisément les cellules cultivées en colonies de formes et de tailles définies. Le succès de cette procédure devrait être clairement évident immédiatement après la procédure d'ensemencement cellulaire (étape 3.7) que les cellules adhérants se regroupera selon la conception du photomasque comme indiqué dans la figure 2a. À 1 h après l'ensemencement cellulaire, les modèles individuels peuvent ne pas être entièrement confluents (seulement quelques cellules par modèle), cependant, comme les cellules prolifèrent au fil du temps, les modèles deviendront entièrement colonisés avec seulement très peu de cellules en dehors des surfaces adhésives (Figure 2b). L'aspect exact de la culture dépendra de la lignée cellulaire. Par exemple, le MESC forme des colonies en forme de dôme10. Une puce dont le modelage n'est pas clair 1 à 2 h après l'ensemencement cellulaire indique l'échec de la procédure (Figure 2c,d).
Les grandes colonies épaisses peuvent parfois être difficiles à tacher de façon homogène. Nous suggérons de fixer et de perméabilize les cellules en une seule étape (section 4) car cela peut améliorer la pénétration des anticorps29. C'est la raison pour laquelle la solution fixative choisie contient un détergent. La figure 3 montre le signal de fluorescence qui est attendu après l'immunostaining. Notez que les cellules positives Id1 brillantes se trouvent dans les régions denses (régions brillantes des PNJ) des colonies (figure 3A). Des conseils comme celui-ci sont utiles pour évaluer la qualité de la procédure de coloration des anticorps. Notez également que les micromodèles créés avec la technique actuelle sont autofluorescents. Ce signal (figure3A, B à gauche la plupart des images) est utile au cours de l'étape d'analyse pour enregistrer spatialement les colonies les unes avec les autres et créer les résultats indiqués dans la figure 5. Le signal d'autofluorescence est généralement le plus brillant lorsque l'échantillon est excité avec un laser de 405 nm et ce canal doit être laissé sans coloration à cet effet. La figure 3 montre également comment les cellules sont précisément limitées sur des motifs de différentes formes.
L'analyse des données d'imagerie est effectuée dans PickCells, un logiciel libre et open-source développé dans notre laboratoire (Blin et al., en préparation). Ce logiciel comprend les modules d'analyse d'images pour lire et trier les images confocales (Figure 4-1), pour segmenter ( Figure4-4-4) et curatez les objets segmentés (figure 4-3,4-5), pour calculer l'objet caractéristiques telles que les coordonnées ou l'intensité moyenne (figure 4-6) et d'exporter les données (figure4,4-8). Fait important, nous avons mis au point une méthode robuste de segmentation nucléaire appelée Nessys28, qui convient particulièrement aux populations denses et hétérogènes de cellules telles que les cellules cultivées sur des micromodèles (Figure 3). Figure 4 -2 montre une sortie représentative du module Nessys où chaque cellule est donnée avec précision une identité de couleur unique. Seule une édition minimale devrait être nécessaire, mais l'édition est faisable si l'utilisateur le décide (Figure 4-3). Enfin PickCells fournit un certain nombre de modules de visualisation pour visualiser les données. Un exemple est donné dans la figure 4-6: une colonie en forme d'anneau est rendue en 3D où les noyaux sont codés en couleur en fonction de leur position le long de l'axe z. Une fois l'analyse validée dans PickCells, les données peuvent être exportées pour créer les cartes spatiales en R en utilisant les scripts disponibles à (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) comme indiqué dans la figure 530.
Nous avons montré récemment que le confinement spatial du MESC sur de petits (30 000 m2) de micropatterns de disque ou d'ellipse guide le modelage d'une sous-population de cellules exprimant le marqueur mésodermal Tbra10. Ainsi, pour illustrer notre méthode ici, nous demandons si le modelage de Tbra peut être influencé par la signalisation BMP dans les grandes colonies (90 000 m2). La figure 5A montre que lorsque le MESC est cultivé sur de grands micropatterns à disques, les cellules TbraMD sont préférentiellesment limitées à la périphérie du motif (carte de densité de Tbra), où la densité cellulaire locale est la plus faible (voir la carte bleue à gauche de la figure 5A ). Ce modelage de Tbra est confirmé par la carte de l'intensité moyenne de Tbra.
Ces données démontrent que la méthode peut révéler des informations sous-visuelles. En effet, à partir de la figure 3, l'inspection visuelle d'une colonie n'est pas suffisante pour identifier toute forme d'organisation spatiale dans l'expression De Tbra. Cela s'explique notamment par l'importante variabilité de la colonie à la colonie qui est quantifiée et montrée dans le panneau le plus à droite de la figure 5A.
La technique montre également qu'il n'existe pas de modèle détectable pour Id1 (une cible de signalisation BMP) qui peut indiquer que le modelage T n'est pas entraîné par la signalisation BMP dans ce contexte.
Le micro-patterning permet de forcer les colonies à adopter presque n'importe quelle géométrie désirée. Ceci est particulièrement utile pour interroger la façon dont le système réagit à diverses géométries. Par exemple, nous pouvons raisonner que si un gradient morphogène s'accumule au centre de la colonie, la création d'un trou dans la colonie perturberait ce gradient. Fait intéressant, nous observons toujours le modelage sur un micromotif d'anneau, mais d'une manière moins robuste (Figure 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig1.jpg"> Figure 1 : Aperçu de la méthode. Le diagramme montrant les principales étapes de la méthode. Pour chaque étape, le temps estimé est indiqué sous le nom de la tâche et un schéma illustre le but de la procédure. Une référence à un chiffre pertinent est également fournie lorsqu'elle est disponible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig2.jpg"> Figure 2 : Aspect culturel 1 h et 48 h après l'ensemencement des cellules sur des micromodèles. Images brightfield de mESC ensemoir sur des micromodèles. (a) Organisation cellulaire prévue 1 h après l'ensemencement, les modèles doivent être clairement identifiables. (b) Résultat attendu après 48 h de cultures. mESC ont proliféré et sont encore strictement confinés aux formes de modèle. (cd) Les résultats non optimaux possibles, soit très peu de cellules adhèrent au plastique, sauf à la périphérie de la diapositive (c) ou les cellules adhèrent entre les modèles (d). Voir le tableau 2 pour un guide de dépannage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig3.jpg"> Figure 3 : Images confocales représentatives de colonies immunostained cultivées sur des micromodèles. Colonies mESC représentatives après immunofluorescence pour (A) Id1 et Nuclear Pore Complex ou (B) Tbra et LaminB1. Pour chaque coloration, une colonie cultivée sur un micromodèle de disque et une colonie cultivée sur un micromotif d'anneau est montrée. Les canaux individuels sont fournis sous forme d'images à l'échelle grise. Notez le signal clair d'autofluorescence du micromotif (excitation laser de 405 nm). La barre d'échelle représente 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig4.jpg"> Figure 4 : Graphique de flux de la procédure d'analyse d'image. Une liste d'images confocales 3D est importée dans PickCells pour analyse (1). Cet exemple montre une expérience avec deux formes distinctes (disques et anneaux comme dans la figure 2). La convention de nommage d'image s'affiche sur la gauche et l'interface PickCells à droite. Ensuite, le module Nessys est utilisé pour segmenter automatiquement les noyaux (2). Dans la capture d'écran, chaque noyau individuel reçoit une couleur unique indiquant une segmentation précise. L'autofluorescence du motif est également segmentée, cette fois, à l'aide du module de segmentation de base (4). L'arrière-plan apparaît en bleu et le signal blanc sera défini comme la forme du motif. Les formes segmentées sont ensuite inspectées visuellement pour assurer une segmentation précise, et éditées si nécessaire à l'aide du module d'éditeur de segmentation (3-5). Les captures d'écran montrent le contour des formes détectées. Les formes roses et jaunes ont été modifiées. Enfin, les entités d'objets sont calculées et exportées vers le fichier pour être ensuite traitées en R (6-7). Une capture d'écran d'une colonie rendue en 3D est fournie (6). Pour les étapes 2 à 6, les icônes trouvées dans l'interface PickCells au moment de la rédaction de cet article sont données à côté de l'index d'étape. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig5.jpg"> Figure 5 : Résultats représentatifs de deux facteurs de transcription et de formes de micro-modèles différents Carte spatiale binée pour le MESC cultivé pendant 48 h sur (A) micropatterns en forme de disque ou (B) micropatterns en forme d'anneau. Pour chaque forme de micromodèle, la carte de la densité cellulaire, quel que soit le phénotype cellulaire, est montrée sur la gauche avec une échelle de couleur bleue. Ensuite, pour chaque marqueur (Tbra sur la rangée supérieure et Id1 sur la rangée inférieure), trois cartes distinctes sont fournies, de gauche à droite: carte de densité cellulaire des cellules exprimant des marqueurs seulement (analyse basée sur le seuil), la carte de l'intensité moyenne du marqueur (log2) et la carte de la déviation standard de l'intensité du marqueur. Les intensités sont données en tant qu'unités de fluorescence arbitraires. Pour chaque carte, la forme du micromotif est donnée sous forme de contour blanc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Type ECM</td>
			<td>Gélatine</td>
			<td>Fibronectine</td>
			<td>Matrice de membrane de sous-sol</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">concentration</td>
			<td>Concentration d'ECM</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 g/mL</td>
			<td>200 g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentration de Poloxamer 407</td>
			<td>500 g/mL</td>
			<td>400 g/mL</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Testé avec</td>
			<td>MESC (en)</td>
			<td>ouais</td>
			<td>ouais</td>
			<td>ouais</td>
		</tr>
<tr>
<td>mEpiSC (en)</td>
			<td>non</td>
			<td>ouais</td>
			<td>ouais</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu sans sérum</td>
			<td>non</td>
			<td>ouais</td>
			<td>ouais</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Concentrations testées de poloxamer 407 et d'ECM. Ce tableau donne un aperçu des concentrations d'ECM et de poloxamer 407 que nous avons testées dans notre laboratoire. Pour chaque combinaison ECM/poloxamer 407, le type de cellule pour lequel le modelage a été atteint avec succès est montré ainsi que si la culture contenait du sérum ou non. mESC - cellule souche embryonnaire de souris, mEpiSC - cellule souche d'épiblaste de souris.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>procédure</td>
			<td>observation</td>
			<td>Question possible</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">Micropatterning</td>
			<td rowspan="3">Faible attachement cellulaire</td>
			<td>inapproprié ECM/poloxamer 307 concentration ratio</td>
			<td>Augmenter le ratio de concentration ECM/poloxamer 307</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d'attachement cellulaire trop court</td>
			<td>Augmentez le temps d'incubation pour donner suffisamment de temps aux cellules pour qu'elles adhèrent correctement aux modèles (étape 3.4). Pour optimiser cette étape, la vérification des cellules au microscope peut aider à détecter un changement dans la morphologie cellulaire indiquant que les cellules ont commencé à adhérer.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavages trop intenses (étape 3.6)</td>
			<td>Lors du remplacement du milieu, évitez de faire du tuyauterie directement sur les copeaux. Au lieu de cela, légèrement pipet le milieu sur les murs du puits à la place</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Les cellules adhèrent entre les modèles</td>
			<td>inapproprié ECM/poloxamer 307 concentration ratio</td>
			<td>Diminuer le ratio de concentration ECM/poloxamer 407</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d'attachement cellulaire trop long</td>
			<td>Diminuer le temps d'incubation (étape 3.4).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavages inefficaces (étape 3.6)</td>
			<td>Secouer la plaque vigoureusement est généralement suffisant pour détacher les cellules en excès. Pour les types de cellules qui ont tendance à adhérer fortement à la puce, pipetting directement sur la puce peut améliorer les résultats. L'augmentation du nombre de lavages peut également aider, notamment pour s'assurer qu'aucune cellule ne reste flottante dans le milieu après cette étape.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Les cellules ne suivent pas strictement la forme du modèle</td>
			<td>Géométrie du type de cellule et du motif 'Incompatibles'</td>
			<td>Planifiez/concevez plusieurs géométries/tailles à ajouter au photomasque pour être en mesure de tester et d'identifier la taille optimale du modèle pour une forme de modèle et un type de cellule donnés. S'il vous plaît, voir la section «Limitations» dans la discussion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Photo-patterning non-optimal, ceci peut être diagnostiqué en observant la netteté du signal d'autofluorescence. Les limites des motifs devraient être nettes comme dans la fig. 2. Si les bordures des motifs semblent floues, l'étape de photo-modèle doit être améliorée.</td>
			<td>Les bords flous du motif indiquent que la glissière en plastique n'était pas assez proche de la surface du masque pendant l'étape d'éclairage. Assurez-vous que les pièces qui tiennent les diapositives sur le photomask sont uniformes et qu'une pression constante et suffisante est appliquée à l'assemblage pendant la procédure d'illumination.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Coloration</td>
			<td rowspan="2">Coloration non homogène</td>
			<td>temps d'incubation des anticorps trop court</td>
			<td>Augmenter le temps d'incubation des anticorps (jusqu'à 24h à température ambiante)</td>
		</tr>
<tr>
<td>colonies aplaties pendant la procédure de montage</td>
			<td>Le micromotif de montage glisse dans une chambre telle que le chamlide ou le cytoo-chambres pour exécuter l'immunostaining et l'imagerie sans avoir besoin de monter les cellules. Cela permettra de mieux préserver les colonies 3D-structure.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Détachement des colonies pendant la procédure de coloration</td>
			<td>Dewetting de la puce</td>
			<td>Laisser assez moyen ou utiliser 2 pipettes, l'une pour enlever le milieu et l'autre pour ajouter la solution fraîche</td>
		</tr>
<tr>
<td>Les colonies apparaissent cisaises sous le microscope</td>
			<td>colonies ont été cisaises tout en montant la puce sur la diapositive de microscopie</td>
			<td>Soyez très doux lors du montage des copeaux. Alternativement, montez des diapositives de micropatterns dans une chambre telle que le chamlide ou les cytoochambers pour exécuter l'immunostaining et l'imagerie sans avoir besoin de monter les cellules. Cela préserve également l'ultrastructure de la colonie.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Guide de dépannage. Ce tableau donne un aperçu des résultats sous-optimaux possibles. Les sources potentielles des problèmes sont également énumérées ainsi que les solutions recommandées.

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Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

La méthode présentée ici utilise le micromodèle avec l'imagerie quantitative pour révéler l'organisation spatiale au sein des cultures mammifères. La technique est facile à établir dans un laboratoire standard de biologie cellulaire et offre un système tractable pour étudier le modelage in vitro.

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Cette méthode permet de manipuler et de quantifier la façon dont les cellules s’organisent collectivement. C’est important parce que nous pouvons modéliser le modèle in vitro et démêler les indices étroitement couplés in vivo. La technique nécessite un minimum d’équipement spécialisé, ce qui lui permet d’être établi dans un laboratoire de biologie standard, et il est quantitatif, ce qui permet la découverte d’événements de modelage sous-visuels.Cette méthode peut facilement être appliquée à n’importe quel système cellulaire où le modelage pourrait émerger et pour découvrir des modèles non aléatoires de différenciation, de prolifération et de concurrence de cellule à cellule. Le principal avec cette méthode est l’optimisation systématique des paramètres de micropatration pour les nouveaux types de cellules. Par exemple, la taille et la forme du motif, le type de matrice et le temps d’adhérence cellulaire.En portant des gants, placez un morceau de film de laboratoire au fond d’une boîte de Pétri carrée de 10 centimètres. Utilisez un poinçon de trou de 12 millimètres pour couper les glissières en plastique hydrophobe pour créer des glissements de couverture de 12 millimètres et placer les glissements de couverture dans une nouvelle boîte de Pétri. Utilisez des pinces à épiler pour retirer soigneusement le film protecteur des feuillets de couverture.Placez le masque photo sur une surface propre et stable, côté chrome vers le haut, et ajoutez une goutte de deux microlitres d’eau double-distillée à la position de la conception désirée de puce. Appuyez doucement sur un slip de couvercle sur la chute et placez le support sur les glissières en plastique. Fixez soigneusement ce sandwich avec des pinces pour maintenir les morceaux en plastique en contact avec le masque photo.Placez l’assemblage dans une lampe à ozone ultraviolet à environ deux centimètres de la source lumineuse pour un éclairage de 10 minutes. À la fin de la période d’éclairage, saisir le sandwich avec le masque photo en bas et retirer soigneusement les pinces tout en maintenant la pression d’une main pour empêcher les glissières de se déplacer tout en démontant le sandwich. Lorsque toutes les pinces ont été enlevées, retirez le support, en prenant soin que toutes les pièces en plastique sont encore sur le masque et non collées au support, et ajoutez de l’eau double-distillée aux copeaux pour détacher doucement les copeaux du masque photo.Placez les copeaux photo-modelés dans la chambre de dépôt de matrice, le côté illuminé vers le haut, et ajoutez 200 microlitres de solution de revêtement sur chaque puce. Ensuite, ajoutez une boîte de Pétri de trois centimètres remplie d’eau double distillée à la chambre pour limiter l’évaporation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’ensemencement des cellules embryonnaires sur les copeaux, lavez les copeaux avec deux lavages d’au moins cinq minutes dans du PBS frais et stérile par lavage, avant de distribuer une fois dix à la cinquième cellule dans 200 microlitres du milieu de culture cellulaire approprié sur chaque puce.Fermez ensuite la chambre d’ensemencement. Incuber pendant une heure pour permettre aux cellules d’adhérer aux puces. Lorsque les cellules se sont fixées, remplissez les puits d’une plaque multiwell de 500 microlitres de milieu chaud par puits et utilisez des pinces stériles pour transférer les copeaux dans des puits de plaques individuels.Secouez vigoureusement l’assiette pour détacher les cellules non adhérentes et remplacez immédiatement le supernatant par un milieu frais et chaud. Ensuite, vérifiez au microscope si le modelage est visible. 48 heures après leur placage, les cellules doivent former des colonies denses qui suivent rigoureusement la forme des motifs.En laissant les copeaux dans la plaque, retirer tout sauf juste assez moyen pour empêcher les copeaux de sécher, et ajouter au moins 500 microlitres de paraformaldéhyde ou de solution de fixation à base de PFA par puits. Après dix minutes, laver brièvement les puits trois fois avec une solution de lavage, suivie d’un lavage avec du chlorure d’ammonium de 50 millimlaire dilué dans la solution de lavage pour étancher l’activité résiduelle de liaison croisée PFA. Après le dernier lavage, traiter les échantillons avec une solution de blocage pendant au moins 30 minutes.Pour l’immunostaining des cultures de puce, transférez les puces dans un côté de cellule de chambre de coloration vers le haut, et ajoutez immédiatement 100 microlitres de la solution primaire d’anticorps d’intérêt à chaque puce. Après une heure sur une plate-forme rotative à température ambiante, laver les copeaux trois fois avec la solution de lavage comme démontré, et incuber les puces avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure sur la plate-forme rotative. À la fin de l’incubation secondaire d’anticorps, lavez les copeaux trois fois dans la solution de lavage et montez la puce sur une glissière de microscopie avec 20 microlitres de n’importe quel milieu de montage standard.Pour imager les puces, ajustez d’abord la vitesse de numérisation, la résolution d’image, la moyenne des images et les gains de détecteur pour identifier un optimum entre la qualité de l’image et le temps d’imagerie. Puis acquérir des images de chaque puce. Lorsque toutes les images ont été acquises, installez et exécutez PickCells en suivant la documentation disponible en ligne, créez une nouvelle expérience et importez les images dans le programme.Utilisez le module Nessys pour segmenter les noyaux en fonction du signal de l’enveloppe nucléaire. Utilisez le module de segmentation de base pour identifier le signal d’autofluorescence du motif. Ensuite, cliquez sur Terminer » et attendre que toutes les images soient traitées.Pour créer des objets nucléaires et calculer les caractéristiques de base de l’objet, lancez le module Caractéristiques intrinsèques à partir de la barre des tâches et fermez les panneaux Ellipsoid Fitter et Surface Extractor pour ne garder que le panneau Fonctionnalités de base ouvert. Sélectionnez noyau " comme type d’objet, et sélectionnez le préfixe fourni pour les images segmentées. Ensuite, cliquez sur Calculer » et attendre que toutes les images soient traitées.À ce stade, des fonctionnalités supplémentaires doivent être écrites en noyaux avant d’exporter les données pour notre analyse. Par exemple, pour stocker le nom de l’image à laquelle chaque noyau appartient en tant qu’attribut nucleus, cliquez sur Données « et Nouvel Attribut » et sélectionnez noyau"dans le dialogue pop-up. Cliquez sur OK « sélectionnez Collecter des données d’autres objets connectés au nœud » et cliquez sur Suivant"Dans le panneau gauche, sélectionnez Image » et double-cliquez sur la marque d’interrogation pour définir le nœud d’image comme cible du chemin.Élargissez le volet Opération de réduction et sélectionnez Get One"Expand the Available Attribute pane et sélectionnez l’attribut Nom. Cliquez ensuite sur Modifier et Suivant « Entrez le nom de l’image, appuyez sur la touche Onglet et cliquez sur Terminer"Puis exportez les données vers un fichier de valeur séparé par onglets. Pour notre analyse, bouclez les données exportées vers le dossier de données du dossier R-Script.Ouvrez notre studio » et ouvrez le modèle de carte binned R-Script"Puis définissez l’annuaire de travail à l’emplacement du fichier source, et exécutez le script pour générer des cartes de densité. À une heure après l’ensemencement cellulaire, les pattens de culture cellulaire individuelle peuvent ne pas être complètement confluents à mesure que les cellules prolifèrent au fil du temps. Cependant, les modèles deviendront entièrement colonisés avec seulement très peu de cellules en dehors des surfaces adhésives.Le modelage qui n’est pas clair jusqu’à deux heures après l’ensemencement indique un échec de la procédure. L’enfermement spatial des cellules souches embryonnaires de souris sur de grands disques ou micropatrins d’anneau guide le modelage d’une sous-population de cellules exprimant le marqueur brachyury mésodermique. Par exemple, lorsque les cellules souches embryonnaires de souris sont cultivées sur des micropatrins à gros disques, les cellules brachyury-positives sont préférentiellement limitées à la périphérie du modèle où la densité cellulaire locale est la plus faible.Cette configuration est confirmée par la carte de l’intensité cerveau-brachyurie. Ces données démontrent que la méthode peut révéler des informations sous-visuelles car l’inspection d’une colonie n’est pas suffisante pour identifier toute forme d’organisation spatiale dans le marqueur d’expression d’intérêt. Cela s’explique notamment par l’importante variabilité entre les colonies.La technique démontre également qu’il n’existe aucun modelage détectable pour l’inhibiteur de l’ADN liant celui qui peut indiquer que t-modelage n’est pas entraîné par la signalisation de protéine morphogénétique d’os dans ce contexte. Rappelez-vous toujours quel côté de la feuille de couverture a éliminé et enduit et assurez-vous également que les cellules ont correctement adhéré avant de laver les cellules excédentaires. Cette méthode permet l’étude des indices environnementaux importants pour guider l’auto-organisation des cellules et peut également éclairer les modèles mathématiques qui nous aident mieux sous le modèle rudimentaire.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Recherche

Biologie du développement

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