Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

העבודה הזאת ממומנת על ידי מלגת סר הנרי ברוך פוסט-דוקטורט (WT100133 to G.B.), מלגת בכירה מבית-הנאמנות (WT103789AIA ל-ס), וברוכים ה לאמון ברוך הבא (108906/Z/15/Z עד D.W.). אנחנו גם אסירי תודה ד ר מנואל Thery עבור עצתו על התאמת הטכניקה photopatterning.

<ol>
	<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells.">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioengineering:+building+from+stem+cell+biology.">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing.">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning.">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells.">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology. Pt. A. , (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo.">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366 (2017).</li><li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells.">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li><li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+signaling+thresholds+in+&#8220;engineered+stem+cell+niches&#8221;+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens.">Manipulation of signaling thresholds in &#8220;engineered stem cell niches&#8221; identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438 (2009).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization.">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).</li><li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li><li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation.">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li><li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., R&#252;ther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells.">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li><li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicistronic+targeting+constructs:+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression.">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nessys:+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D.">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872 (2018).</li><li>Weiswald, L. -. B., Guinebreti&#232;re, J. -. M., Richon, S., Bellet, D., Saubam&#233;a, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres:+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy.">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106 (2010).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li><li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-explorer:+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens.">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).</li><li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium.">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li><li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology.">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning.">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839 (2018).</li><li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms.">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).</li><li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Lamins+a+and+B1.">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level.">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos.">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף

כאן אנו מתארים שיטה לניתוח מתהווה בתרבויות של תאים. גישה מיקרופינינג פשוטה משמשת לסטנדרטיזציה של הצורה והגודל של מושבות התא, ואנו מציגים כלי ניתוח תמונה וסקריפטים R המאפשרים איתור וכימות של דפוסים בתוך המושבות האלה.
הצינור שאנו מציעים דומה במידה מסוימת עם שיטה שפורסמה קודם לכן31 שבו המחברים מתמקדים בתנאי התרבות, באמצעות מיקרודפוסים זמינים מסחרית, כדי לקבל היווצרות שכבת הנבט להתרבות במושבות ESC ל חקר של אירועים מוקדמים בתחומי החוץ. המטרה שלנו היא ממוקדת יותר כלפי מתן צינור הניתן להכליל לגילוי של תבנית היווצרות מבחנה שבה הארגון הקולקטיבי של התאים עשוי להיות גלוי רק לאחר ניתוח סטטיסטי. מסיבה זו, אנו מספקים זרימת עבודה חזקה התמונה המאפשרת זיהוי מדויק וניתוח של מיקום גרעיני בחלל תלת-ממדי על מושבות מרובות (ראה גם ' יתרון ומגבלות של שיטת זיהוי דוגמת מילוי ' בסעיף זה דיון). כמו כן החלטנו לפתח גישה פשוטה בתוך הבית, המציעה חלופה גמישה וזולה יותר לפתרונות מסחריים בטווח הארוך, שאנו מקווים שיהיו שימושיים לקהילה.
לבסוף, אנו מודעים לכך שבמהלך התיקון של כתב היד הזה, חבילה חדשה לניתוח המיון באופן מתורבת בדומה לסקריפטים שלנו R שוחררה32. חבילה חדשה זו מקבלת טבלאות של תכונות תא כקלט הניתן להשגה מפלטפורמות הדמיה גבוהה של תפוקה. אנו מאמינים כי הטבלה של תכונות גרעין שנוצרו בשלב 7 של הפרוטוקול שלנו יכול עקרונית לשמש כקלט לחבילה חדשה זו למרות שלא בדקנו את האפשרות הזאת בעצמנו.
הסתגלות של השיטה לסוגי תאים אחרים וגאומטריות מושבה
אנו מציגים גישה זו בהקשר של לימוד הופעתה של גורמים שעתוק מזועורי בתרבויות התאים החזקים ביותר בנוכחות של סרום. עם זאת, השיטה ניתנת להתאמה בקלות לסוגי תאים אחרים ולתרבויות ללא סרום למרות שייתכן שיהיה צורך למטב את ECM/poloxamer 407 ריכוזי (ראה טבלה 1 עבור ריכוזי נבדק ושולחן 2 עבור מדריך לפתרון בעיות). ניתן גם להתאים את השיטה לגדלים גדולים או קטנים יותר של מיקרודפוסים ולמגוון רחב של צורות בהתאם לצורכי המשתמש. עם זאת, בזמן שאתה מבסס את השיטה, חשוב להיות מודע לכך שלא כל שילובי הצורה/סוג התא הם אופטימליים. לדוגמה, רמות גבוהות של mesc express של E-קדהרין33,34 המאפשרות לתאים אלה ליצור מבנים קיבוציים המשתרעים על פני אזורים נטולי ecm. תאים אלה אינם מתבצע בקפדנות גאומטריות עם זוויות חדות או הכוללות חורים קטנים בתבנית. הודעה לדוגמה כי על הטבעת של איור 3B, התאים נמצאים בתהליך של הנכבש האזור המרכזי. בידינו, אזור מרכזי קטן יותר, לא כפה את הכוחות ליצור מושבות בצורת טבעת. לכן מומלץ מאוד לכלול מגוון של גיאומטריות בזמן עיצוב הפושאול כדי להיות מסוגל לבחון ולזהות את הגדלים והעקמומיות האופטימליים שיתאימו לסוג התא של בחירה.
גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא אורך הניסוי ושיעור ההתפשטות של התאים. עבור כמה סוגי תאים מתרבים במהירות (כולל תאים pluriפוטנטי) זה יכול להיות קשה לשמור על התאים על מיקרודפוסים במשך ימים רבים (עבור mESC שלושה ימים הוא מקסימום). כמו כן, זריעת תאים על מיקרודפוסים לא תמיד מתרחשת בצורה אופטימלית עבור כל מושבה, ולכן מומלץ לזרע עודף של מושבות כדי לקבל רזרבי.
היתרון והמגבלות של שיטת זיהוי התבנית
יתרון אחד מסוים של השיטה הוא היכולת לזהות דפוסי "ממוצעים" על ידי שילוב תוצאות ניתוח תמונה ממספר מושבות שכפול (איור 5). זה יכול לחשוף את האירועים שאינם גלויים מתוך בדיקה של מושבות נפרדות. חסרון בגישה זו של ' חישוב ממוצע ' הוא שהוא עלול להחמיץ סוגים מסוימים של דפוסים חוזרים, למשל כתמים קטנים או פסים צרים. עם זאת, סוגי דפוס אלה עשויים להתגלות במקום זאת עם שילוב של גדלים שנבחרו בקפידה גודל8. כמו כן, צינור ניתוח התמונה המתואר כאן מספק נתונים כמותיים בשני תאים בודדים ורזולוציית המושבה המציעה את האפשרות לחקור את רמת ההשתנות הבין-מושבה (איור 5) או לבצע ניתוח שכנים במספר מאזניים10.
יתרון חשוב נוסף של השיטה בממוצע הוא שהוא מציע את ההזדמנות למפות את המיקום האידיאלי של סמנים רבים מבלי להיות מוגבל על ידי fluorophores זמין של ערוצי זיהוי. אכן, למרות שאנו עושים שימוש רק בשני סמנים של בידול בעבודה המוצגת כאן, היכולת לתקנן מושבות ולחלץ "ממוצעים" דפוסים מאפשר להשוות את מפות ההפצה מקבוצות שונות של מושבות יחד על מנת לחשוף את הקשרים המרחביים הללו של סמנים זה לזה.
יתר על כן, למרות ההתמקדות שלנו כאן היה ללמוד סמנים של בידול, שיטת הניתוח ניתן להרחיב כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים שעבורם סמנים גרעיניים זמינים. לדוגמה מיקרופאנינג של קו תא המכיל מחוון מחזור תאים פלואורסצנטית35 (fucci) תאפשר ללמוד כיצד גיאומטריה רמת המושבה עלולה להשפיע על אירועי מחזור התא בקבוצה.
כיוונים לעתיד
השיטה היא קלה לניתוח תמונה תפוקה בינונית, עם זאת, רכישת תמונה אינה אוטומטית לחלוטין והוא יכול להיות הגבלת ניסויים גדולים מאוד. הסדרים קבועים של מושבות צריך לאפשר ליצור באופן מלא שגרות רכישה מלאה דומה למה שפותחה עבור תא בודד בממוצע20. עם זאת, מכיוון שגודל השדה הנדרש לדימוי המושבה גדול, ייתכן שהוא זקוק לmosaicking, ומכיוון שמושבות הן תלת-ממדיות, רצוי מאוד להפחית הן את גודל הנתונים והן את זמן הרכישה באמצעות הדמיה של מושבות רלוונטיות בלבד. לכן, מאמצים עתידיים יכולים להיות מוקדשים לפתח ' אינטליגנטי ' מיקרוסקופ מסוגל לזהות מושבות רלוונטיות ולהתאים קואורדינטות הדמיה לכל מדגם. זה לא רק להפחית את הזמן והמאמץ אלא גם למנוע הטיות המפעיל פוטנציאליים.
גם צינורות הניתוח עשויים להיות יעילים יותר על-ידי הפחתת מספר הצעדים שהמשתמש צריך לנקוט. יש לנו תוכניות לבנות מנגנון בניית צינור ולשלב R ישירות לתוך התוכנה שלנו (ראה גם בעיות בפיתאים-api 3 ו-כדוריות-rjava 1 בגשש הנושא של מאגרי הקוד שלנו [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). האוטומציה המלאה של הליך הניתוח תפחית את הזמן והמאמץ ותגביל את שגיאות המשתמש הפוטנציאליות.
לבסוף, אנו מודעים לכך ששיטת הניתוח שלנו עדיין לא לוכד במלואה את האופי הדינאמי של הפענוח התאי. מידע דינמי מוגבל ניתן לחילוץ על ידי בחינת סדרת זמן של תמונות תמונה8,10,36. עם זאת, להיות מסוגל להקליט את ההיסטוריה של אוכלוסיית התאים הוא מאוד רצוי אם אנחנו רוצים להבין טוב יותר איך מתגלה הסדר. מגבלה אחת היא כי מעקב מדויק של תאים בודדים באוכלוסיית תא צפופה 3D נשאר משימה מאתגרת מאוד37. שיטת זיהוי התאים שלנו משתמשת במעטפה הגרעינית ומבצעת היטב במיוחד על אוכלוסיית תאים צפופים וחופפים28. כתבים חיים של המעטפה הגרעינית הם זמינים28,38 ואחד היתרונות של הטכניקה מיקרומניפולציה היא שזה יכול לשמש כדי למנוע את התאים מחוץ לשדה הראייה במהלך הדמיה ארוכת טווח. בסך הכל, אנחנו בטוחים כי מעקב אוטומטי של תאים יהיה השגה באמצעות שילוב של כלים שהוקמו לאחרונה28,39,40 וכי זה צריך להביא תובנות חדשות לתוך היסוד עקרונות של ארגון-עצמי.

במערכות היונקים, הדפוס הוא תכונה מתהווה של התנהגות קולקטיבית של תאים ולכן, דפוסים יכולים ליצור מבחנה אם רמזים מתאימים מסופקים לתאים1,2,3,4, מיכל 5 , 6. אחת הדרכים לחשוף את היכולת הפנימית של התאים לארגן את עצמו ב-"מבחנה" היא לאלץ את התאים ליצור קבוצות/מושבות של צורות וגדלים מוגדרים7,8,9,10 . טכניקה המאפשרת זאת היא מיקרומניפולציה11. מיקרומטנינג מאפשר להגדיר במדויק את המיקום שבו מולקולות המכפלה (ECM) מיופקדו על משטח. זה, בתורו מכתיב היכן התאים יכולים לדבוק ולכן שולט כיצד תאים לארגן.
מיקרומניפולציה היא טכניקה עם מספר רב של יישומים, למשל, מיקרו, מאפשרת סטנדרטיזציה של תנאים ראשוניים לפני בידול12. חשוב לעשות זאת, המיקרו-מיקרוסקופ מאפשר לשלוט בקלות בגודל, בצורה ובריווח של מושבות תאים ובמאפיין זה ניתן להשתמש כדי לתכנן ניסויים המיועדים לחקור את התגובה הקולקטיבית של התאים כדי מורפוגן או לסימנים פיזיים7 , בן שמונה , מיכל עשור , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , . שבע עשרה
מספר שיטות מיקרוטונינג פותחו11. טכניקות photopatterning הן אולי השיטות הקלות ביותר להקמת18. גישות אלה יש גם את היתרון של דיוק כפי שהם יכולים לשמש כדי לשלוט על הצורה של תאים בודדים18,19,20. עם זאת, הם דורשים גם ציוד יקר מיוחדים כולל מסתובב ספין, תא פלזמה ו UVO (UV-אוזון) ניקוי אשר בדרך כלל לא זמין במעבדות ביולוגיה סטנדרטית. כדי להקל על אימוץ הטכניקה, התאמתי את הפרוטוקול כדי לאפשר רק את מנורת ה-UVO. אנחנו מתחילים מתוך שקופיות פלסטיק זמין מסחרית אשר ניתן לגזור עם מספריים או עם ניקוב חור לפורמט הרצוי.
כלי חשוב אחד של מיקרודפוסים הוא היכולת לתקנן מושבות כדי להשוות בין מושבות בודדות לבין מספר משכפל. זה מאפשר לשאול לאיזה מידה היווצרות התבנית בתוך מושבות אלה הוא להיות מיוצר, ולחקור גורמים המשפיעים על החוסן של תהליך הדפוס. וחשוב מכך, הכמת של דפוסי "ממוצעים" על פני מושבות סטנדרטיות מרובות יכולים גם לחשוף את תהליכי המדידה שאחרת לא היו גלויים לעין. היתרון של היכולת לכמת את המדידה על המושבות מתוקננת תלוי ביכולת למדוד במדויק את ביטוי החלבון, באופן אידיאלי במפלס התא היחיד. עם זאת, תאים על מיקרודפוסים הם לעתים קרובות ארוזים הדוק, מה שהופך אותם קשה פלח עם דיוק גבוהה. תאים גם לעתים קרובות לארגן את עצמם בשלושה ולא בשני ממדים, וזה יכול להיות מאתגר לזהות ולשמר תלת מימדי (3D) מידע במהלך פילוח. לאחר שתאים מחולקים בהצלחה, נדרשות שיטות חישוביות לחילוץ מידע מתוך ערכות הנתונים שיתקבלו.
פיתחנו פילוח וניתוח תמונה כלי כדי לסייע להתגבר על בעיות אלה. שיטת ניתוח זו משתמשת רק בתוכנה חופשית ובקוד פתוח ואינה דורשת ידע על שורת הפקודה או על תיכנות ליישום. כדי להמחיש את השיטה כאן, אנו משתמשים גזע מעובריים של העכבר (mES) תאים אשר באופן ספונטני לבטא סמן של בידול מוקדם brachyury (tbra)21,22. בעוד שאין הסדר מרחבי גלוי לעין חזותית, השיטה מאפשרת יצירת מפה של מיקום מועדף של תאי T + במושבות. כמו כן, אנו מראים כי Tbra המ, ניגודים עם העדר לוקליזציה מועדפים של התאים המבטאים Id1, הבדיקה הישירה של חלבון מורמורגנטי העצם (BMP) בנתיב23. אנו דנים גם במגבלות הנוכחיות של השיטה וכיצד ניתן להתאים טכניקה זו למערכות נסיוניות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

מטרה בסיסית בביולוגיה היא להבין כיצד מופיעים דפוסים במהלך הפיתוח. כמה קבוצות הראו כי הדפוס ניתן להשיג באופן מתורבת כאשר תאי גזע מוגבלים על מיקרודפוסים, ובכך להגדיר מודלים ניסיוניים המציעים הזדמנויות ייחודיות לזהות, באופן מתורבת, עקרונות היסוד של ביולוגי ארגון.
כאן אנו מתארים את ההטמעה שלנו של המתודולוגיה. התאמתי את הטכניקה צילום-מניפולציה כדי להפחית את הצורך בציוד מיוחד כדי להקל על הקמת השיטה במעבדה סטנדרטית ביולוגיה תא. פיתחנו גם בחינם, מקור פתוח וקל להתקין מסגרת ניתוח תמונה כדי למדוד במדויק את המיקום המוועדף של אוכלוסיות תת של תאים בתוך מושבות של צורות סטנדרטיות גדלים. שיטה זו מאפשרת לחשוף את קיומם של אירועים מסוימים גם באוכלוסיות בלתי מאורגנת לכאורה של תאים. הטכניקה מספקת תובנות כמותיים ויכולה לשמש לזיווג השפעות הסביבה (למשל, רמזים פיזיים או איתות אנדוגני), בתהליך מסוים.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

השיטה המוצגת כאן משתמשת במיקרוגרף יחד עם הדמיה כמותית לחשיפת הארגון המרחבי בתוך תרבויות היונקים. הטכניקה היא קלה להקים מעבדה סטנדרטית בביולוגיה התא והוא מציע מערכת צייתן לחקור מבחנה בפריפרייה.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

שיטה זו מאפשרת לטפל ולמת את האופן שבו התאים מתארגנים באופן קולקטיבי. זה חשוב כי אנחנו יכולים מודל דפוס במבחנה ורמזים disentangle יחד בחוזקה vivo. הטכניקה דורשת ציוד מומחה מינימלי, המאפשר לה לקום במעבדה ביולוגית סטנדרטית, והיא כמותית, מה שמאפשר גילוי של אירועי דפוס תת-ויזואליים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על כל מערכת תא שבה דפוס יכול לצוץ ולגלות דפוסים לא אקראיים של התברות, התפשטות ותחרות בין תא לתא. העיקרי בשיטה זו הוא אופטימיזציה שיטתית של פרמטרים micropatterning עבור סוגי תאים חדשים. לדוגמה, גודל וצורה של תבנית, סוג מטריצה ותוזה של הידבקות בתאים.לובשים כפפות, מניחים חתיכת סרט מעבדה בתחתית צלחת פטרי מרובעת באורך 10 ס"מ. השתמש בניקוב חורים של 12 מ"מ כדי לחתוך מגלשות פלסטיק הידרופוביות כדי ליצור תלושי כיסוי של 12 מ"מ מסביב, והצב את מחליקי הכיסוי בצלחת פטרי חדשה. השתמש פינצטה כדי להסיר בזהירות את הסרט מגן מן החלקות העטיפה.מניחים את מסכת הצילום על משטח נקי ויציב, צד כרום למעלה, ומוסיפים טיפה של שני מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים במיקום של עיצוב השבב הרצוי. לחץ בעדינות על החלקת שער על הירידה והצב את המחזיק מעל מגלשות הפלסטיק. בזהירות לתקן את הכריך הזה עם מלחציים כדי לשמור על חתיכות פלסטיק במגע עם מסכת צילום.מניחים את ההרכבה במנורת אוזון אולטרה סגולה כשני סנטימטרים ממקור האור לתאורה של 10 דקות. בסוף תקופת התאורה, תופסים את הכריך עם מסכת הצילום בתחתית ומסירים בזהירות את המהדקים תוך שמירה על לחץ ביד אחת כדי למנוע מהמגלשות לנוע תוך פירוק הכריך. לאחר הסרת כל המהדקים, מוציאים את המחזיק, דואגים שכל חתיכות הפלסטיק עדיין על המסכה ולא דבוקות למחזיק, ומוסיפים מים מזוקקים כפולים לשבבים כדי לנתק בעדינות את השבבים מסכת הצילום.מניחים את השבבים בדוגמת התמונה בתוך תא התצהיר של המטריצה, צד מואר כלפי מעלה ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של תותב ציפוי על כל שבב. לאחר מכן, מוסיפים צלחת פטרי באורך 3 ס"מ מלאה במים מזוקקים כפולים לתא כדי להגביל את האידוי בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. עבור זריעת תאים עובריים על השבבים, לשטוף את השבבים עם שתי שטיפות לפחות חמש דקות PBS טרי, סטרילי לכל לשטוף, לפני חלוקת אחד 10 עד התאים החמישי ב 200 microliters של מדיום תרבות התא המתאים על כל שבב.ואז לסגור את תא הזריעה. דגירה במשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים לדבוק בשבבים. כאשר התאים מחוברים, למלא את בארות של צלחת multiwell עם 500 microliters של מדיום חם לגם, ולהשתמש פינצטה סטרילית להעביר את השבבים לתוך בארות צלחת בודדים.מנערים את הצלחת במרץ כדי לנתק את כל התאים שאינם חסידים, ומיד להחליף את העל-טבעי במדיום טרי וחם. ואז לבדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לבחון אם דפוס גלוי. 48 שעות לאחר ציפוי שלהם, התאים צריכים ליצור מושבות צפופות כי בקפדנות בצע את הצורה של הדפוסים.משאירים את השבבים בצלחת, מסירים את כל המדיום מלבד מספיק כדי למנוע מהשבבים להתייבש, ומוסיפים לפחות 500 מיקרוליטרים של פרפורמלדהיד או פתרון קיבוע מבוסס PFA לעין. לאחר עשר דקות, לשטוף בקצרה את הבאר שלוש פעמים עם פתרון כביסה, ואחריו לשטוף אחד עם 50 מילימולר אמוניום כלוריד מדולל בתת תקצוב כביסה כדי לרוות את פעילות ההצלבה PFA שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, לטפל בדגימות עם פתרון חסימה לפחות 30 דקות.לכשל חיסוני של תרבות השבבים, מעבירים את השבבים לצד תא מכתים למעלה, ומיד מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי המעניין כל שבב. לאחר שעה על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר, לשטוף את השבבים שלוש פעמים עם פתרון כביסה כפי שהוכח, ולהדגים את השבבים עם נוגדנים משניים המתאימים במשך שעה אחת על הפלטפורמה מסתובבת. בסוף הדגירה המשנית של הנוגדנים, שטפו את השבבים שלוש פעמים בתסכולת הכביסה והרו את השבב על מגלשת מיקרוסקופיה עם 20 מיקרוליטרים של כל מדיום הרכבה סטנדרטי.כדי לדמיין את השבבים, התאם תחילה את מהירות הסריקה, רזולוציית התמונה, ממוצע המסגרות ורווחי הגלאי כדי לזהות אופטימלי בין איכות התמונה לזמן ההדמיה. לאחר מכן לרכוש תמונות של כל שבב. לאחר שכל התמונות נרכשו, התקן והפעל את PickCells בהתאם לתיעוד הזמין באינטרנט, צור ניסוי חדש וייבא את התמונות לתוכנית.השתמש במודול Nessys כדי למקטע את הגרעינים בהתבסס על אות המעטפה הגרעינית. השתמש במודול הפילוח הבסיסי כדי לזהות את אות השפע האוטומטי של התבנית. לאחר מכן לחץ על סיום"והמתן לעיבוד כל התמונות.ליצירת עצמים גרעיניים ולמשכוב תכונות אובייקט בסיסיות, הפעל את המודול תכונות מהותיות מפס המשימות וסגור את הלוחות Ellipsoid Fitter ו- Surface Extractor כדי להשאיר רק את החלונית 'תכונות בסיסיות' פתוחה. בחרו 'גרעין' כ'סוג אובייקט', ובחרו את הקידומת שסופקה לתמונות המפוספקות. לאחר מכן לחץ על מ לחשב" והמתן לעיבוד כל התמונות.בשלב זה, תכונות נוספות צריך להיות כתוב לתוך גרעינים לפני ייצוא הנתונים לניתוח שלנו. לדוגמה, כדי לאחסן את שם התמונה שכל גרעין שייך לה כתכונת גרעין, לחץ על נתונים "ותכונה חדשה" ובחר גרעין בתיבת הדו-שיח המוקפץ. לחץ על אישור"בחר לאסוף נתונים מאובייקטים אחרים המחוברים לצומת" ולחץ על הבא "בחלונית הימנית, בחר תמונה" ולחץ פעמיים על סימן החקירה כדי להגדיר את צומת התמונה כיעד של הנתיב.הרחב את החלונית פעולת הפחתה ובחר קבל תכונה אחת"הרחב את החלונית תכונה זמינה ובחר את התכונה שם. לאחר מכן לחץ על שנה"ו הבא"הזן שם תמונה, הקש על מקש Tab ולחץ על סיום"לאחר מכן יצא את הנתונים לקובץ ערך המופרד באמצעות טאבים. לצורך הניתוח שלנו, לולאה את הנתונים המיוצאים לתיקיית הנתונים של תיקיית R-Script.פתח את הסטודיו שלנו"ו פתח את תבנית המפה המאוכפלת R-Script"לאחר מכן הגדר את ספריית העבודה למיקום קובץ המקור והפעל את קובץ ה- Script כדי ליצור מפות צפיפות. בשעה אחת לאחר זריעת התאים, ייתכן שתרבות התאים הבודדת לא תהיה חד-משמעית לחלוטין מכיוון שהתאים מתרבים עם הזמן. עם זאת, הדפוסים יתיישבו באופן מלא עם מעט מאוד תאים מחוץ למשטחי ההיבקות.תבנית שלא ברורה עד שעתיים לאחר הזריעה מצביעה על כשל בהליך. הכליאה המרחבית של תאי גזע עובריים של עכבר על דיסקים גדולים או מיקרופטרנים טבעת מנחה את התבנית של תת אוכלוסייה של תאים המבטאים את סמן הברכיורי mesodermal. לדוגמה, כאשר תאי הגזע העובריים של העכבר גדלים על מיקרופטרנים של דיסק גדול, התאים החיוביים-ברכיורי מוגבלים באופן מועדף לפריפריה של התבנית שבה צפיפות התאים המקומית היא הנמוכה ביותר.דפוס זה מאושר על ידי המפה של עוצמת המוח-brachyury. נתונים אלה מראים כי השיטה יכולה לחשוף מידע תת-ויזואלי מכיוון שבדיקה של מושבה אחת אינה מספיקה כדי לזהות כל צורה של ארגון מרחבי בסמן של ביטוי עניין. זה מוסבר בעיקר על ידי השונות החשובה בין המושבה למושבה.הטכניקה גם מדגימה כי אין דפוס לגילוי קיים עבור מעכב של DNA מחייב אחד אשר עשוי להצביע על כך T-דפוס אינו מונע על ידי חלבון מורפגנטי עצם איתות בהקשר זה. זכור תמיד איזה צד של להחליק הכיסוי בוטל מצופה וגם להיות בטוח כי התאים דבקו כראוי לפני לשטוף את התאים העודפים. שיטה זו מאפשרת את המחקר של רמזים סביבתיים חשוב בהנחיית ארגון עצמי של תאים והוא יכול גם ליידע מודלים מתמטיים המסייעים לנו טוב יותר תחת דפוס בסיסי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...