Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av en Sir Henry Wellcome post-doktor Fellowship (WT100133 til G.B.), en Wellcome Trust senior Fellowship (WT103789AIA til S.L.), og en Wellcome Trust PhD studentship til (108906/Z/15/Z til D.W.). Vi er også takknemlige for Dr Manuel thery for hans råd om tilpasning av photopatterning teknikk.

Merk: en oversikt over metoden er gitt i figur 1.
1. maske design
<ol><li>Design photomask i henhold til retningslinjene beskrevet i Azioune et al.18. Se innholdsfortegnelsen for en referanse til programvare-og maske produsenten som brukes i denne studien. Merk: du kan opprette flere geometri, størrelser eller mellomrom mellom figurer på én maske. UV-lampen kan passe en 15 cm photomask som kan inneholde opptil 49 forskjellige utførelser (forutsatt 2 cm x 2 cm chips).</li>
</ol>2. Micropattern produksjon prosedyre
<ol><li>Forbered de nødvendige materialer.<ol>
<li>Forbered en løsning på 0,1% poloksamer 407 (10 mg for 10 mL) i fosfat bufret saltvann (PBS) og la på en shaker ved romtemperatur. Den poloksamer 407 vil ta ca 20 min å oppløse.</li>
		<li>Lay laboratorie film (se tabell over materialer) i bunnen av en 10 cm kvadrat Petri parabolen. Dette vil bli brukt som kammeret for matrise deponering.</li>
		<li>Rengjør overflaten av photomask, først med 100% aceton, deretter med 100% isopropanol og til slutt med ddH2O. Hvis mulig, lufttørke photomask eller på annen måte tørke masken med rent papir håndkle.</li>
		<li>Forbered en firkantet, stiv og ugjennomsiktig stykke plast med nøyaktig samme størrelse som photomask (senere referert som "holderen"). Merk: Dette vil bli brukt til å opprettholde plast coverslips i kontakt med photomask under belysnings trinnet.</li>
		<li>Slå på UVO-lampen og Kjør en oppvarmings belysning i 10 minutter.</li>
	</ol></li>
	<li>Lag photopatterned chips. Merk: det er mulig å tilpasse prosedyren for å lage sjetonger av ønsket størrelse. For enkelhets skyld beskriver vi her prosedyren for å generere en 12 mm rund micropatterned chip.<ol>
<li>Ved hjelp av en 12 mm hull punch, kuttet hydrofobe plast lysbilder å lage 12 mm rund coverslips og plassere dem i en ren ny Petri parabolen. FORSIKTIG: Bruk hansker til enhver tid for å unngå hudkontakt med overflaten av plasten, da dette kan skade overflatebehandlingen.</li>
		<li>Fjern forsiktig den beskyttende filmen fra coverslips med pinsett. Merk: unngå å skade plastoverflaten da dette kan påvirke plasseringen av cellene på brikken under seeding prosedyren (del 3).</li>
		<li>Plasser photomask på en ren og stabil overflate (for eksempel photomask boks), krom side opp, og tilsett en 2 μL dråpe ddH2O i posisjonen til ønsket chip design.</li>
		<li>Legg en dekkglass på dråpe ddH2O og trykk forsiktig. Merk: Kontroller at plast siden som vender mot photomask er den siden som ble beskyttet av filmen som ble fjernet i det tidligere trinnet.</li>
		<li>Plasser holderen på toppen av plast lysbilder og nøye fikse denne sandwich med klemmer for å opprettholde plast brikker i kontakt med photomask. Merk: Plasser klemmene så nært som mulig til plasseringen av plast skred for å sikre at plast lysbildene er perfekt vedlikeholdt i kontakt med overflaten av photomask.</li>
		<li>Plasser monteringen i UVO-lampen på ca. 2 cm fra lyskilden og lyser i 10 minutter. Merk: lysstyrken er anslått til å være 6 mW/cm2 ved 254 NM bølgelengde når brikken er plassert i en avstand på 2 cm fra kilden.</li>
		<li>Hold sandwich med photomask på bunnen og forsiktig fjerne klemmene og samtidig opprettholde trykket med en hånd for å hindre at lysbildene beveger seg om mens demontering av sandwich. Fjern holderen, og sørg for at alle plastbitene fortsatt er på masken og ikke sitter fast i holderen.</li>
		<li>Legg ddH2O på toppen av chips og forsiktig løsne chips fra photomask. Merk: Hvis plasten brikken er fast til photomask, løsne chip ved hjelp av en plast pipette spissen for å skyve chip mens du holder pinsett litt over brikken i tilfelle chip løsner plutselig.</li>
		<li>Til slutt plasserer photopatterned chips i matrisen deponering kammeret. Merk: Pass på at den opplyste siden av brikken vender oppover.</li>
	</ol></li>
	<li>Sett inn matrisen. Merk: alle prosedyrer i denne delen skal utføres i en vev kultur hette.<ol>
<li>Filtrer poloksamer 407-oppløsning via et 0,22 μm-polyetersulfon (PES).</li>
		<li>Klargjør ECM belegg løsningen ved å blande 500 μg/mL sterilt filtrert poloksamer 407 og 1 mg/mL gelatin. Merk: Se også tabell 1 for ytterligere informasjon om andre mulige ECM-molekyler.</li>
		<li>Tilsett 200 μL av belegg løsningen på hver opplyst chip. Laboratoriet filmen vil hindre fall fra å falle utenfor chip.</li>
		<li>Legg til en 3 cm Petri parabolen fylt med ddH2O for å begrense fordampning og plassere den med chip ved 4 ° c over natten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. seeding prosedyre
Merk: trinnene som er beskrevet nedenfor er optimalisert for CGR8 mus embryonale stamceller (mESC)24 bruker standard mESC medium (se også tabellen av materialer). Det er imidlertid mulig i prinsippet å tilpasse prosedyren for en hvilken som helst celle type. Merk også at konvensjonelle cellekultur mus embryonale stamceller er ikke beskrevet her som omfattende dokumentasjon kan bli funnet andre steder25.
<ol><li>Aspirer belegg løsningen og ruge sjetongene to ganger i minst 5 minutter med steril PBS.</li>
	<li>I mellomtiden, utarbeide en celle suspensjon av 5,5 x 105 celler/ml i varmt medium.</li>
	<li>Pipet 200 μL av celle fjæring på hver chip (~ 100 000 celler/cm2).</li>
	<li>Lukk seeding kammeret og la cellene holde seg for 1 time i inkubator.</li>
	<li>Etter 1 time, fyll brønnene på en multiwell plate (4-brønn eller 24-brønn plate avhengig av antall sjetonger) med 500 μL/brønn av varmt medium og Overfør sjetongene til platen med steril pinsett.</li>
	<li>Rist platen kraftig for å løsne ikke-tilhenger celler. Aspirer medium og umiddelbart erstatte med friskt varmt medium. Sjekk under mikroskopet for å se om mønsteret er synlig (figur 2a). Merk: det kan hende at vedheft tid må optimaliseres når du bruker andre cellelinjer enn mESC eller andre matrise proteiner (se også tabell 2).</li>
	<li>Gjenta dette trinnet til mønstrene blir klart synlige som vist i figur 2a. Merk: dette trinnet er kritisk og bestemmer suksessen til prosedyren. En vaske prosedyre som er for intens kan løsne cellene, i kontrast utilstrekkelig vasking kan føre til at cellene forblir festet i mellom mønstrene (figur 2C, d).</li>
</ol>4. fiksering
Merk: etter 48 h i kultur cellene skal danne tette kolonier som strengt følger formen på mønstrene (som vist i figur 2b).
<ol><li>Leaving sjetongene i platen, fjerne ~ 90% av mediet, slik at akkurat nok medium for å hindre at sjetongene tørker. Merk: det er viktig at brikken aldri tørker for å unngå flekker gjenstander og for å hindre celle avløsning fra overflaten. På grunn av hydrofobisiteten av chip overflaten mellom selvklebende mønstre, kan brikken har en tendens til de-våte. På dette stadiet kan bindemiddel føre til at store hvelvede kolonier løsner fra brikken. Vasker bør være svært skånsom, ideelt utført av pipettering væske på siden av brønnen og ikke direkte på brikken.</li>
	<li>Tilsett minst 500 μL av paraformaldehyde (PFA)-basert fiksering løsning per brønn og ruge i 10 min. Merk: Hvis koloniene vises spesielt tykke (mer enn 5 celle lag), kan det være nødvendig å justere fiksering tid til 20 min.</li>
	<li>Etter fiksering, vask 3 ganger med vaskeløsningen (PBS med 0,01% poloksamer 407). En ekstra vask med 50 mM NH4CL fortynnet i vaskeløsning kan være intercalated å SLUKKE resterende PFA Cross-Linking aktivitet.</li>
	<li>Ruge prøvene i minst 30 minutter i blokkerings løsning. Merk: på dette stadiet kan prøvene oppbevares ved 4 ° c i ca. en uke før farging. Hvis ja, forsegle platen med laboratorie film for å hindre fordampning.</li>
</ol>5. Immunostaining
<ol><li>Forbered en farging kammer ved å plassere et ark av laboratoriet film i bunnen av en 10 cm kvadrat Petri parabolen.</li>
	<li>Klargjør antistoff løsninger (se tabell 3 for en liste over antistoffer og fortynninger som brukes i denne artikkelen).</li>
	<li>Plasser brikken i farge kammeret med siden som støtter cellene vendt oppover, og Legg umiddelbart til 100 μL av primær antistoff løsning på brikken. FORSIKTIG: på dette stadiet, bør chips ikke lett de-våte som i trinn 4,1. Imidlertid bør forsiktighet likevel bli tatt fordi det er viktig at sjetongene ikke tørker. Hvis flere sjetonger må behandles, må du bruke trinn 5,3 på hver brikke sekvensielt.</li>
	<li>Ruge for 1 time på en roterende plattform ved romtemperatur. Merk: Hvis cellene har dannet store 3D-strukturer, kan en lengre inkubasjonstid være nødvendig for å tillate ensartet farging av prøven. Inkubasjonstid kan økes til 24 timer. Imidlertid må farging kammeret inneholder en 3 cm parabol fylt med vann og farging kammeret må tettes med laboratorie film for å hindre fordampning.</li>
	<li>Overfør sjetongene til en frisk multiwell plate og vask 3 ganger med vaskeløsningen.</li>
	<li>Utfør inkubasjons med sekundære antistoffer som beskrevet i trinn 5,3 og 5,4.</li>
	<li>Monter brikken på et mikroskopi lysbilde med 20 μL av et standard monterings medium (f.eks. Mowiol).</li>
</ol>6. avbildning
Merk: bildebehandling kan utføres på et standard konfokalmikroskopi mikroskop. Her gir vi bare anbefalinger for å sikre en bildekvalitet som vil være tilstrekkelig for den påfølgende kvantitative analysen.
FORSIKTIG: for å unngå enhver operator bias, bør koloniene til bildet bare velges ved hjelp av kjernefysisk konvolutt signal (for å se om en koloni riktig følger formen på mønsteret). Unngå å sjekke signalet av markører av interesse unntatt når du justerer innstillingene for mikroskopet.
<ol><li>Kontroller at anskaffelses bitdybden er 12 eller 16 biter.</li>
	<li>Identifiser de riktige innstillingene for å maksimere det dynamiske området for hver bilde kanal. Unngå spesielt bilde klipping.</li>
	<li>Ta med en kanal til bildet Micropattern autofluorescence (se Figur 3).</li>
	<li>Juster bildestørrelse og zoomfaktor for å få Voxel størrelser som spenner mellom 0,1 og 0,6 μm i x-og y-aksene og varierer mellom 0,2 og 2 μm i z-aksen. Merk: for eksempel, i denne studien, brukte vi en invertert skanning konfokalmikroskopi mikroskop med en 40x objektiv (numerisk blenderåpning lik 1,3), en bildestørrelse på 1024 x 1024 piksler uten digital zoom og en z-trinn størrelse på 0,5 μm. Dette resulterte i en Voxel størrelse på 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm.</li>
	<li>For hver koloni definerer du minimums-og maksimums posisjonen langs z-aksen for å sikre at hele kolonien anskaffes. Minst ett fly med lav eller ingen signal bør inkluderes under og over kolonien.</li>
	<li>Sørg for at z-stack orientering er ervervet konsekvent (enten alltid topp til bunn eller alltid bunn til topp)</li>
	<li>Juster skannehastigheten, bildeoppløsningen, ramme snitt og detektor gevinster for å finne en optimal mellom bildekvalitet og bilde tid. Som en indikasjon var bilde tid for en koloni som vist i Figur 3 omtrent 2 – 3 min. Utfør bilde anskaffelsen. FORSIKTIG: alle bilder, for å være sammenlignbare, må anskaffes på samme mikroskop med samme objektiv og oppkjøp innstillinger.</li>
	<li>På slutten av oppkjøpet, lagre alle bildene og tilordne en unik navnekonvensjon å identifisere den eksperimentelle forutsetning at hvert bilde representerer. Merk: se Figur 4 som et eksempel, denne konvensjonen vil bli brukt senere under analyse prosedyren. Merk at bilder kan lagres i alle formater som støttes av BioFormats 26. Hvis koloniene er større enn synsfeltet, kan sømmen plugg av ImageJ brukes27. Merk også at i tilfelle av søm, kan belysning Roll off korreksjon være nødvendig.</li>
</ol>7. bildeanalyse
Merk: de anbefalte datamaskinspesifikasjonene for denne prosedyren er: 16 GB RAM, en multi-core 3,33 GHz CPU, og minst 50 GB diskplass (eller mer avhengig av hvor mange sjetonger som er avbildet). Programvaren har blitt testet på Linux, Windows og MacOS. PickCells er et kryss-plattform bildeanalyse program med et grafisk brukergrensesnitt dedikert til analyse av den kollektive organiseringen av cellene i komplekse flerdimensjonale bilder (Blin et al, i forberedelse). Merk at mer informasjon om PickCells samt dokumentasjon for de spesifikke modulene som er nevnt her kan bli funnet på Internett: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Merk også at grensesnittet kan endres når vi holder forbedre programvaren. Hvis grensesnittet er forskjellig fra det som vises i figuren eller videoen, kan du se den elektroniske manualen.
<ol><li>Installer og Kjør PickCells følge dokumentasjonen tilgjengelig på nettet.</li>
	<li>Importer bilder og Bekreft nøyaktigheten til den oppgitte informasjonen (Figur 4-1).</li>
	<li>Dokumentere navnet på hver kanal.</li>
	<li>Segment kjerner basert på kjernefysisk konvolutt signal ved hjelp av Nessys-modulen28 (Figur 4-2) og gi et prefiks ("kjerner" for eksempel) som vil bli brukt til å navngi genererte segmentert bilder. Merk: du finner dokumentasjon om bruk og parameterjusteringer på https://framagit.org/pickcellslab/nessys.</li>
	<li>Inspisere og redigere Segmentations om nødvendig, ved hjelp av segmentering redaktøren modulen (Figur 4-3) Merk: Hvis en eller annen grunn segmentering prosessen ikke gir tilfredsstillende resultater, manuelt slette bilder i databasen mappen og også slette "segmentering resultat" node i metamodellen er View. Deretter gjentar du trinn 7,4 og 7,5. Hvis segmentering av bare en liten undergruppe av bilder ikke gi tilfredsstillende resultater, og deretter bruke Nessys frittstående program (se linken i 7,4), forsøk segmentering på "feil bilder" og erstatte den tilsvarende filen i databasen mappen).</li>
	<li>Segmentere mønsteret autofluorescence signalet ved hjelp av grunnleggende segmentering modulen (Figur 4-4)<ol>
<li>Gi et prefiks ("mønster" for eksempel) som vil bli brukt til å navngi genererte segmentert bilder.</li>
		<li>Velg kanalen som inneholder det autofluorescence signalet.</li>
		<li>Påfør støyreduksjon; vanligvis bruker en Gaussian filter med en kernel størrelse på 10 x 10 x 0,5 voxels gir tilfredsstillende resultater.</li>
		<li>Angi nedre terskel slik at bakgrunnen vises i blått mens forgrunnen vises hvitt. Sett også den øvre terskelen til sin maksimale verdi for å unngå høy intensitet blir ekskludert fra det endelige resultatet (røde områder).</li>
		<li>Velg Hopp over for siste trinn.</li>
		<li>Falle i staver slutten og vent kassaskuff alle profilen er bearbeidet.</li>
	</ol></li>
	<li>Som for kjerner, kan segmentering resultatene nå visuelt inspisert og korrigert om nødvendig ved hjelp av segmentering redaktøren modulen (Figur 4-5).</li>
	<li>Lag kjerner objekter og beregne grunnleggende objekt funksjoner.<ol>
<li>Start den innebygde funksjoner modul fra oppgavelinjen til venstre i de viktigste grensesnittet (Figur 4-6).</li>
		<li>Lukk ellipsoiden montør og Surface Extractor paneler for å holde bare Basic features panel åpen.</li>
		<li>Velg nucleus som objekttype, og velg prefikset som er angitt i trinn 7,4 for «segmentert bilder».</li>
		<li>Trykk på Beregn og vent til alle bildene er behandlet. Merk: etter dette trinnet, vil det ikke være mulig å redigere kjerner Segmentations igjen.</li>
	</ol></li>
	<li>Opprett mønster objekter og beregne grunnleggende objekt funksjoner. Gjenta trinn 7.8.1 til 7.8.4, men denne gangen velger du egendefinert type som objekttype og prefikset som er angitt i trinn 7.6.1 for segmentert bilder. Merk: etter dette trinnet, vil det ikke være mulig å redigere mønsteret Segmentations igjen.</li>
	<li>Lagre navnet på bildet hver kjerne tilhører som en nucleus-attributt.<ol>
<li>Klikk på Data &Gt; nytt attributt og velg nucleus i popup-dialogboksen og klikk OK.</li>
		<li>Velg samle inn data fra andre objekter som er koblet til noden , og klikk på neste.</li>
		<li>Inne det igjen panel, velge Image og så dobbel falle i staver på avhør flekk under avslutningen flagg inne forbindelsesveien definisjon panel sette bildet knute idet målet av forbindelsesveien.</li>
		<li>Utfolde det anvendelig attributtene vindusrute på igjen panel og velge navnet attributt.</li>
		<li>Utfolde reduksjonen operasjon vindusrute og velge bli ettall, så falle i staver på endre knapp og falle i staver neste.</li>
		<li>Skriv inn "image Name", trykk TAB-tasten og klikk OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Opprett en "normalisert koordinat" attributt i kjerner objekter (Figur 4-7).<ol>
<li>Tilpass trinnene 7.10.1 til 7.10.6 for å lagre koordinatene til mønsteret centroid som en nucleus-attributt. Navngi dette nye attributtet "Pattern koordinat".</li>
		<li>Deretter klikker du på Data &Gt; nytt attributt, velg nucleus og klikk OK.</li>
		<li>Velg Definer en funksjon mellom avstandstoleranse eller retnings vekt Orer for noden , og klikk på neste.</li>
		<li>For type funksjon Velg Array operasjon, for v1 Velg Item Vector og deretter Centroid, og for v2 Velg Item Vector og deretter mønster Coordinate.</li>
		<li>Klikk neste, Skriv inn "normalisert koordinat" i navn -feltet og klikk Fullfør.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksporter dataene til en kategori fil med skille verdi.</li>
</ol>8. R-analyse
<ol><li>Last ned og Installer Rstudio. Merk: programvareinformasjon og nedlastingskoblinger er tilgjengelig på https://www.rstudio.com/.</li>
	<li>Last ned R-skriptene som kreves for denne analysen. Merk: skript kan lastes ned fra GitLab repository: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.</li>
	<li>Åpne Rstudio. Merk: Hvis du kjører skriptene for første gang, må du installere de nødvendige R-pakkene (ggplot2 og skalaer).</li>
	<li>Fra Rstudio, åpne binnedmap_template. R-skript.</li>
	<li>Angi arbeidsmappen til kildefil plasseringen.</li>
	<li>Følg instruksjonene i skriptet for å tilpasse skriptet til et gitt datasett for å få romlige kart som vist i figur 5.</li>
	<li>Kjør skriptet for å generere tetthet kart.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells.">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioengineering:+building+from+stem+cell+biology.">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing.">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning.">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells.">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology. Pt. A. , (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo.">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366 (2017).</li><li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells.">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li><li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+signaling+thresholds+in+&#8220;engineered+stem+cell+niches&#8221;+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens.">Manipulation of signaling thresholds in &#8220;engineered stem cell niches&#8221; identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438 (2009).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization.">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).</li><li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li><li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation.">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li><li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., R&#252;ther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells.">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li><li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicistronic+targeting+constructs:+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression.">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nessys:+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D.">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872 (2018).</li><li>Weiswald, L. -. B., Guinebreti&#232;re, J. -. M., Richon, S., Bellet, D., Saubam&#233;a, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres:+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy.">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106 (2010).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li><li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-explorer:+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens.">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).</li><li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium.">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li><li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology.">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning.">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839 (2018).</li><li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms.">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).</li><li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Lamins+a+and+B1.">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level.">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos.">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre

Her beskriver vi en metode for å analysere emergent mønster i kulturer av celler. En forenklet micropatterning tilnærming brukes for standardisering form og størrelse, og vi presenterer bildeanalyse verktøy og R-skript som muliggjør påvisning og kvantifisering av mønstre innenfor disse koloniene.
Rørledningen vi foreslår er lik en viss grad med en tidligere publisert metode31 der forfatterne fokus på kultur forhold, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige micropatterns, for å oppnå reproduserbar bakterie lag FORMASJON i ESC kolonier for studie av tidlige gastrulation hendelser in vitro. Vårt mål er mer fokusert mot å gi en generaliserings rørledning for oppdagelsen av mønster dannelse in vitro der den kollektive organiseringen av cellene kan bare bli tydelig etter statistisk analyse. Av denne grunn gir vi en robust bildeanalyse arbeidsflyt som muliggjør nøyaktig identifisering og analyse av kjernefysisk posisjon i 3D-rom over flere kolonier (se også "fordel og begrensninger i mønster gjenkjennings metoden" i denne diskusjonen). Vi har også besluttet å utvikle en enkel in-House micropatterning tilnærming som tilbyr et mer fleksibelt og billigere alternativ til kommersielt tilgjengelige løsninger på lang sikt som vi håper vil være nyttig for samfunnet.
Til slutt, vi oppmerksom på at under revisjonen av dette manuskriptet, en ny pakke for analyse av mønstre in vitro lik vår R skript har blitt utgitt32. Denne nye pakken godtar tabeller av celle funksjoner som input som kan fås fra høy gjennomstrømming Imaging plattformer. Vi tror at tabellen av kjerner funksjoner generert på trinn 7 i vår protokoll kunne i prinsippet tjene som en inngang til denne nye pakken selv om vi ikke har testet denne muligheten selv.
Tilpasning av metoden til andre celletyper og koloni geometri
Vi presenterer denne tilnærmingen i sammenheng med å studere fremveksten av mesodermal transkripsjon faktorer i kulturer av pluripotent celler i nærvær av serum. Metoden kan imidlertid lett tilpasses andre celletyper og serum frie kulturer, selv om det er nødvendig å optimalisere ECM/poloksamer 407 konsentrasjoner (se tabell 1 for testede konsentrasjoner og tabell 2 for en feilsøkingsveiledning). Metoden kan også tilpasses til større eller mindre størrelser av micropatterns og til et bredt spekter av former i henhold til behovene til brukeren. Men mens du etablerer metoden, er det viktig å være klar over at ikke alle form/celle type kombinasjoner er optimale. For eksempel mESC Express høye nivåer av E-cadherin33,34 slik at disse cellene til å danne kollektive strukturer som spenner over områder som er blottet for ECM. Disse cellene følger ikke strengt geometri med skarpe vinkler eller som inneholder små hull i mønsteret. Legg merke til for eksempel at i ringen av figur 3b, cellene er i ferd med å kolonisere det sentrale området. I våre hender et mindre sentralt område ikke tvinge mESC å danne ring-formede kolonier. Det er derfor sterkt anbefalt å inkludere et mangfold av geometri mens designe photomask å kunne teste og identifisere de optimale størrelser og kurvaturer som vil være egnet for cellen type valg.
En annen viktig faktor å ta hensyn til er lengden på eksperimentet og spredning rate av cellene. For noen raskt voksende celletyper (inkludert pluripotent celler) kan det være vanskelig å opprettholde celler på micropatterns over mange dager (for mESC tre dager er en maksimum). Også seeding celler på micropatterns ikke alltid oppstår optimalt for hver koloni, så det er tilrådelig å frø et overskudd av kolonier for å ha reservedeler.
Fordeler og begrensninger i mønster gjenkjennings metoden
En spesiell fordel med metoden er muligheten til å oppdage "gjennomsnitt" mønstre ved å kombinere bildeanalyse resultater fra flere replikere kolonier (figur 5). Dette kan avdekke mønster hendelser som ikke er tydelige fra inspeksjon av de enkelte koloniene. En ulempe med denne "snitt" tilnærming er at det kan gå glipp av visse typer repeterende mønstre, for eksempel små flekker eller smale striper. Imidlertid kan disse typer mønster i stedet bli avslørt med en kombinasjon av nøye utvalgte mønster størrelser8. I tillegg gir bildeanalyse rørledningen som beskrives her, kvantitative data i både enkelt celle-og koloni oppløsning, og gir muligheten til å undersøke nivået av variasjon mellom kolonien (figur 5) eller for å utføre nabo analyser på flere skala10.
En annen viktig fordel med gjennomsnittet metoden er at den gir mulighet til å kartlegge fortrinnsrett plasseringen av mange markører uten å være begrenset av tilgjengelige fluorophores av deteksjon kanaler. Faktisk, selv om vi gjør bruk av bare to markører for differensiering i arbeidet som presenteres her, evnen til å standardisere kolonier og ekstrakt "gjennomsnitt" mønstre gjør det mulig å sammenligne fordelingen kartene fra ulike sett av kolonier sammen for å avdekke generalisert romlige forhold av markører til hverandre.
Videre, selv om vårt fokus her har vært å studere markører for differensiering, kan analysemetoden utvides til å studere andre biologiske prosesser som kjernefysiske markører er tilgjengelige. For eksempel micropatterning av en cellelinje som inneholder en fluorescens ubiqitinering celle syklus indikator35 (FUCCI) ville gjøre det mulig å studere hvordan kolonien nivå geometri kan påvirke celle syklus hendelser i gruppen.
Fremtidige retninger
Metoden er mottagelig for middels gjennomstrømming bildeanalyse, men bildet oppkjøpet er foreløpig ikke helautomatisk og kan bli begrensende for svært store eksperimenter. Den vanlige ordninger av kolonier bør gjøre det mulig å lage fullt automatisert oppkjøpet rutiner som ligner på det som er utviklet for enkelt celle gjennomsnitt20. Men fordi størrelsen på feltet som kreves for å avbilde en koloni er stor, muligens krever mosaicking, og fordi koloniene er tredimensjonale, er det svært ønskelig å redusere både datasett størrelse og oppkjøpet tid ved Imaging bare relevante kolonier. Derfor kan fremtidig innsats være dedikert til å utvikle en "intelligent" mikroskop i stand til å identifisere relevante kolonier og tilpasse Imaging koordinater til hver prøve. Dette vil ikke bare redusere tid og krefter, men også hindre potensielle operatøren fordommer.
Analyse rørledningene kan også gjøres mer effektive ved å redusere antall trinn som brukeren må utføre. Vi har planer om å bygge en rørlednings bygging mekanisme og å integrere R direkte inn i vår programvare (se også problemer pickcells-API # 3 og pickcells-rjava # 1 i problemet tracker av våre kode repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fullstendige automatisering av analysen prosedyren vil redusere tid og krefter og begrense potensielle bruker feil.
Til slutt, vi oppmerksom på at vår analysemetoden ennå ikke fullt ut fange den dynamiske naturen av cellulære mønstre. Noe begrenset dynamisk informasjon kan trekkes ut ved å undersøke en gang-serien av Snapshot bilder8,10,36. Men å kunne registrere historien til cellen befolkningen er svært ønskelig hvis vi ønsker å bedre forstå hvordan mønstre framgår. En begrensning er at nøyaktig sporing av individuelle celler i en 3D tett celle befolkning fortsatt en svært utfordrende oppgave37. Vår celle deteksjons metode bruker kjernefysisk konvolutt og utfører spesielt godt på tette og overlappende celle populasjoner28. Live journalister av kjernefysiske konvolutten er lett tilgjengelig28,38 og en fordel med micropatterning teknikken er at den kan brukes til å hindre at cellene beveger seg utenfor synsfeltet under langsiktig Imaging. Generelt er vi sikre på at automatisert sporing av celler vil være oppnåelig ved hjelp av en kombinasjon av nylig etablerte verktøy28,39,40 og at dette skulle bringe ny innsikt i de grunnleggende prinsipper for selvorganisering.

I pattedyr systemer, er mønstre en emergent eiendom av den kollektive atferden til celler og så, mønstre kan danne in vitro hvis hensiktsmessig Stikkordene er gitt til cellene1,2,3,4, 5 andre priser , 6. en måte å avdekke den iboende evne til cellene å selv-organisere in vitro er å tvinge cellene til å danne grupper/kolonier av en definert former og størrelser7,8,9,10 . En teknikk som gjør at dette er micropatterning11. Micropatterning gjør det mulig å presist definere plasseringen der ekstracellulære Matrix (ECM) molekyler er avsatt på en overflate. Dette, i sin tur dikterer hvor cellene kan overholde og derfor styrer hvordan cellene romlig organisere.
Micropatterning er en teknikk med mange anvendelser, for eksempel, Micropatterning muliggjør standardisering av innledende forhold før differensiering12. Viktigere, micropatterning gjør det mulig å enkelt kontrollere størrelse, form og avstand av celle kolonier og denne eiendommen kan brukes til å utarbeide eksperimenter som tar sikte på å forhører den kollektive responsen av cellene til morphogen eller fysiske signaler7 , 8 på alle , 10 andre , 13 på alle , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17av dem.
Flere micropatterning metoder har blitt utviklet11. Photopatterning teknikker er kanskje den enkleste metodene for å etablere18. Disse tilnærmingene har også fordelen av presisjon som de kan brukes til å styreformen av enkeltceller18,19,20. Men de krever også dyrt spesialisert utstyr inkludert en spin elektrostatisk, en plasma kammer og en UVO (UV-ozon) renere som vanligvis ikke er lett tilgjengelig i standard biologi laboratorier. For å lette innføringen av teknikken, tilpasset vi protokollen til å kreve bare UVO lampe. Vi starter fra kommersielt tilgjengelige plast skred som kan kuttes med saks eller med et hull punch til ønsket format.
En viktig nytte av micropatterns er muligheten til å standardisere kolonier for å sammenligne individuelle kolonier på tvers av flere replikeres. Dette gjør det mulig å spørre i hvilken grad mønsteret dannes innenfor disse koloniene er reproduserbar, og å utforske faktorer som påvirker robusthet av mønsteret prosessen. Viktigere, kvantifisering av "gjennomsnitt" mønstre på tvers av flere standardiserte kolonier kan også avdekke mønstre prosesser som ellers ikke ville være synlig. Fordelen med å kunne kvantifisere mønstre på standardiserte kolonier avhenger av å være i stand til å nøyaktig måle protein uttrykk, ideelt på enkelt cellenivå. Imidlertid er celler på micropatterns ofte tett pakket, noe som gjør dem vanskelige å segmentere med høy nøyaktighet. Celler også ofte organisere seg i tre enn to dimensjoner, og det kan være utfordrende å oppdage og bevare tredimensjonale (3D) informasjon under segmentering. Når cellene er segmentert, er beregningsmetoder nødvendig for å trekke ut mønster informasjon fra de resulterende datasettene.
Vi har utviklet segmentering og bildeanalyse verktøy for å bidra til å overvinne disse problemene. Denne analysemetoden bruker bare fri og åpen kildekode programvare og krever ikke kjennskap til kommandolinje eller programmering for å implementere. For å illustrere metoden her, bruker vi musen embryonale stammen (mES) celler som spontant uttrykker en markør for tidlig differensiering brachyury (Tbra)21,22. Selv om ingen tilsynelatende romlig ordning er visuelt synlig, gjør at metoden etableringen av et kart over fortrinnsrett posisjonering av T + celler i kolonier. Vi viser også at Tbra mønster kontraster med fravær av en fortrinnsrett lokalisering av cellene uttrykker Id1, en direkte avlesning av benet Morfogenetiske protein (BMP) Pathway23. Vi diskuterer også gjeldende begrensninger av metoden og hvordan denne teknikken kan tilpasses andre eksperimentelle systemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

Et grunnleggende mål i biologi er å forstå hvordan mønstrene dukker opp under utviklingen. Flere grupper har vist at mønstre kan oppnås in vitro når stamceller er romlig begrenset til micropatterns, og dermed sette opp eksperimentelle modeller som tilbyr unike muligheter til å identifisere, in vitro, de grunnleggende prinsippene for biologisk Organisasjon.
Her beskriver vi vår egen implementering av metodikken. Vi tilpasset et foto mønster teknikk for å redusere behovet for spesialisert utstyr for å gjøre det enklere å etablere metoden i et standard cellebiologi laboratorium. Vi har også utviklet en gratis, åpen kildekode og enkel å installere bildeanalyse rammeverk for å presist måle fortrinnsrett posisjonering av Sub-populasjoner av celler i kolonier av standard former og størrelser. Denne metoden gjør det mulig å avdekke eksistensen av mønstre hendelser selv i tilsynelatende uorganisert populasjoner av celler. Teknikken gir kvantitativ innsikt og kan brukes til å koble påvirkninger av miljøet (for eksempel fysiske signaler eller endogene signalering), på en gitt mønster prosess.

Den Foto mønster metoden som er beskrevet her gjør det mulig å presist organisere kulturperler celler i kolonier av definerte former og størrelser. Suksessen til denne prosedyren bør være tydelig synlig umiddelbart etter celle seeding prosedyren (trinn 3,7) som overholder celler vil klynge i henhold til photomask design som vist i figur 2a. Ved 1 h etter celle seeding, kan enkelte mønstre ikke være fullt confluent (bare noen få celler per mønster), men som cellene sprer seg over tid, vil mønstrene bli fullt kolonisert med bare svært få celler utenfor limet overflater (figur 2b). Det eksakte utseendet på kulturen vil være cellelinje avhengig. For eksempel mESC skjema buet-figur kolonier10. En chip der mønsteret ikke er klart 1 til 2 h etter celle seeding indikerer svikt i prosedyren (figur 2C, d).
Store og tykke kolonier kan noen ganger være utfordrende å flekk homogent. Vi foreslår å fikse og permeabilize cellene i ett trinn (del 4) som dette kan forbedre antistoff penetrasjon29. Dette er grunnen til at den valgte bindemiddel løsningen inneholder et vaskemiddel. Figur 3 viser det fluorescens signalet som forventes etter immunostaining. Legg merke til at lyse Id1 positive celler er funnet i tette regioner (lyse NPC regioner) av koloniene (figur 3a). Hint som dette er nyttig for å vurdere kvaliteten på antistoff farging prosedyren. Legg også merke til at micropatterns som er opprettet med dagens teknikk, er autofluorescent. Dette signalet (figur 3a, B venstre de fleste bilder) er nyttig under analysen scenen å romlig registrere kolonier med hverandre og lage resultatene som vises i figur 5. Den autofluorescence signalet er generelt den smarteste når prøven er spent med en 405 NM laser og denne kanalen skal stå uten flekker for dette formålet. Figur 3 viser også hvordan cellene er nøyaktig begrenset på mønstre av forskjellige former.
Analysen av Imaging data er utført i PickCells, en fri og åpen kildekode programvare utviklet i laboratoriet vårt (Blin et al., i forberedelse). Denne programvaren inkluderer bildeanalyse modulene for å lese og sortere konfokalmikroskopi bilder (Figur 4-1), til segment (Figur 4-2,4-4) og kapellan segmentert objekter (Figur 4-3, 4-5), for å beregne objekt funksjoner som koordinater eller gjennomsnittlig intensitet (Figur 4-6) og å eksportere data (Figur 4-7, 4-8). Viktigere, utviklet vi en robust kjernefysisk segmentering metode kalt Nessys28 som er spesielt egnet for tette og heterogene bestander av celler som celler dyrket på Micropatterns (Figur 3). Figur 4 -2 viser en representativ utgang for Nessys-modulen, der hver enkelt celle er nøyaktig gitt en unik farge identitet. Bare minimal redigering bør være nødvendig, men redigering er gjennomførbart bør brukeren bestemme så (Figur 4-3). Endelig PickCells gir en rekke visualisering moduler for å visualisere data. Et eksempel er gitt i Figur 4-6: en ring-formet koloni gjengis i 3D der kjerner er fargekodet i henhold til deres posisjon langs z-aksen. Når analysen er validert i PickCells, kan data eksporteres for å skape den romlige kartene i R ved hjelp av skriptene tilgjengelig på (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) som vist i figur 530.
Vi har vist nylig at romlig fødsel av mESC på små (30 000 μm2) plate eller ellipse micropatterns guider mønsteret av en pasientpopulasjonen av celler uttrykker Mesodermal markør Tbra10. Derfor, for å illustrere vår metode her, spør vi om mønstre av Tbra kan bli påvirket av BMP signalering i større kolonier (90 000 μm2). Figur 5a viser at når mESC dyrkes på store plate Micropatterns, Tbra + celler er fortrinnsvis begrenset til periferien av mønsteret (Tbra + tetthet kart), der den lokale celle tettheten er den laveste (se det blå kartet til venstre i figur 5a ). Dette mønsteret av Tbra bekreftes av kartet over gjennomsnittlig Tbra intensitet.
Disse dataene viser at metoden kan vise under visuell informasjon. Faktisk, fra Figur 3, visuell inspeksjon av en koloni er ikke tilstrekkelig til å identifisere noen form for romlig organisasjon i Tbra uttrykk. Dette forklares spesielt av den viktige kolonien til koloni variasjon som er kvantifisert og vist i det høyre panelet i figur 5a.
Teknikken viser også at det ikke finnes noe synlig mønster for Id1 (et mål for BMP-signalering) som kan indikere at T-mønsteret ikke er drevet av BMP-signalering i denne sammenhengen.
Micropatterning gjør det mulig å tvinge kolonier å vedta nesten alle ønsket geometri. Dette er spesielt nyttig for å avhøre hvordan systemet reagerer på ulike geometri. For eksempel kan vi grunnen til at hvis en morphogen gradient bygger opp i sentrum av kolonien, skape et hull i kolonien ville forstyrre denne gradient. Interessant vi fortsatt observere mønstre på en ring Micropattern om enn på en mindre robust måte (figur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig1.jpg"> Figur 1: oversikt over metoden. Diagrammet viser de viktigste trinnene i metoden. For hvert trinn angis anslått tid under navnet på oppgaven, og en skjematisk illustrerer formålet med prosedyren. En henvisning til et relevant tall er også gitt når tilgjengelig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig2.jpg"> Figur 2: kultur utseende 1 t og 48 h etter seeding cellene på micropatterns. Brightfield bilder av mESC seeded på micropatterns. (a) forventet celle organisasjon 1 time etter seeding, bør mønstrene være klart identifiserbare. (b) forventet resultat etter 48 h av kulturer. mESC har proliferated og er fortsatt strengt begrenset til mønster formene. (c – d) Mulige ikke-optimale utfall, enten svært få celler holder seg til plast unntatt i utkanten av raset (c) eller celler holder seg i mellom mønstrene (d). Se tabell 2 for en feilsøkingsveiledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig3.jpg"> Figur 3: representative konfokalmikroskopi bilder av immunostained kolonier dyrket på micropatterns. Representative mESC kolonier etter immunofluorescence for (A) Id1 og kjernefysiske pore Complex eller (B) Tbra og LaminB1. For hver farging, en koloni dyrket på en plate Micropattern og en koloni dyrket på en ring Micropattern vises. Individuelle kanaler leveres som gråtonebilder. Legg merke til det klare Auto-fluorescens signalet fra Micropattern (405 NM laser eksitasjon). Scale bar representerer 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig4.jpg"> Figur 4: flytskjema for bildeanalyse prosedyren. En liste over 3D-konfokalmikroskopi bilder importeres til PickCells for analyse (1). Dette eksemplet viser et eksperiment med to forskjellige figurer (plater og ringer som i figur 2). Bilde navnekonvensjonen vises til venstre og PickCells-grensesnittet til høyre. Deretter brukes Nessys-modulen til å segmentere kjerner automatisk (2). I skjermbildet, er hver enkelt kjerne gitt en unik farge som indikerer nøyaktig segmentering. Autofluorescence av mønsteret er også segmentert, denne gangen, ved hjelp av "grunnleggende segmentering" modul (4). Bakgrunn vises i blått og hvitt signal vil bli definert som mønster figuren. Segmentert former er så visuelt inspisert for å sikre nøyaktig segmentering, og redigert om nødvendig ved hjelp av segmentering redaktøren modulen (3-5). Skjermbildene viser omrisset av de oppdagede figurene. De rosa og gule figurene er redigert. Til slutt blir objekt funksjoner beregnet og eksportert til fil som skal behandles senere i R (6 – 7). Et skjermbilde av en koloni som gjengis som en 3D-visning, er gitt (6). For trinn 2 til 6 ikonene som finnes i PickCells grensesnittet på tidspunktet for å skrive denne artikkelen er gitt ved siden av trinnet indeksen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig5.jpg"> Figur 5: representative resultater for to forskjellige transkripsjon faktorer og Micropattern former Binned romlig kart for mESC vokst for 48 h på (A) Disc formet micropatterns eller (B) ring formet micropatterns. For hver Micropattern form vises kart over celle tetthet, uavhengig av celle fenotype, til venstre med en blå fargeskala. Så for hver markør (Tbra på øverste rad og Id1 på nederste rad), tre forskjellige kart er gitt, fra venstre til høyre: celle tetthet kart over markøren uttrykker celler bare (terskel basert analyse), kart over den gjennomsnittlige markøren intensitet (log2) og kart over standardavviket til markør intensiteten. Intensitet er gitt som vilkårlig fluorescens enheter. For hvert kart blir den Micropattern formen gitt som en hvit kontur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ECM-type</td>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Fibronektin</td>
			<td>Matrise for kjeller membran</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Konsentrasjon</td>
			<td>ECM-konsentrasjon</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>20 μg/mL</td>
			<td>200 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poloksamer 407 konsentrasjon</td>
			<td>500 μg/mL</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Testet med</td>
			<td>mESC</td>
			<td>ja</td>
			<td>ja</td>
			<td>ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>mEpiSC</td>
			<td>nei</td>
			<td>ja</td>
			<td>ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Serum fritt medium</td>
			<td>nei</td>
			<td>ja</td>
			<td>ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: testede konsentrasjoner av poloksamer 407 og ECM. Denne tabellen gir en oversikt over konsentrasjonene av ECM og poloksamer 407 som vi testet i laboratoriet vårt. For hver ECM/poloksamer 407-kombinasjon, vises celletypen som mønsteret ble oppnådd på, i tillegg til om kulturen inneholdt serum eller ikke. mESC = mus embryonale stilk cellen, mEpiSC = mus epiblast stilk cellen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prosedyre</td>
			<td>Observasjon</td>
			<td>Mulig problem</td>
			<td>Løsning</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">Micropatterning</td>
			<td rowspan="3">Lavt celle feste</td>
			<td>upassende ECM/poloksamer 307 konsentrasjon ratio</td>
			<td>Øke forholdet ECM/poloksamer 307 konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celle Vedleggs tid er for kort</td>
			<td>Øke inkubasjonstid til å gi nok tid til cellene til riktig holder seg til mønstre (trinn 3,4). For å optimalisere dette trinnet kan kontroll av cellene under et mikroskop bidra til å oppdage en endring i celle morfologi som indikerer at cellene har begynt å følge.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vasker for intens (trinn 3,6)</td>
			<td>Når du skifter medium, unngå pipettering medium direkte på chips. I stedet forsiktig Pipet mediet på veggene i brønnen i stedet</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Celler holder mellom mønstrene</td>
			<td>upassende ECM/poloksamer 307 konsentrasjon ratio</td>
			<td>Reduser forholdet ECM/poloksamer 407 konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid for celle vedlegg er for lang</td>
			<td>Reduser inkubasjonstiden (trinn 3,4).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vasker ineffektiv (trinn 3,6)</td>
			<td>Risting platen kraftig er vanligvis tilstrekkelig til å løsne cellene i overkant. For celletyper som har en tendens til å forholde seg sterkt til chip, pipettering direkte på brikken kan forbedre utfallet. Øke antall vasker kan også hjelpe, spesielt for å sikre at ingen celle forblir flytende i mediet etter dette trinnet.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Celler følger ikke strengt mønster formen</td>
			<td>' Inkompatibel ' celle type og mønster geometri</td>
			<td>Planlegg/Utform flere geometri/størrelser som skal legges på photomask for å kunne teste og identifisere den optimale mønsterstørrelsen for en gitt mønster form og celle type. Vennligst se delen "begrensninger" i diskusjonen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ikke-optimale Foto mønstre, dette kan diagnostiseres ved å observere skarpheten på det autofluorescence signalet. Mønster grenser skal se skarpe ut som i fig. 2. Hvis kantene på mønstrene ser uklare ut, må bilde mønster trinnet forbedres.</td>
			<td>Uskarpe mønster kanter indikerer at plast lysbildet ikke var nært nok til overflaten av masken under belysnings trinnet. Sørg for at bitene som holder lysbildene til photomask, er jevne, og at en konstant og tilstrekkelig trykk påføres forsamlingen under belysnings prosedyren.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Flekker</td>
			<td rowspan="2">Ikke-homogene flekker</td>
			<td>antistoff inkubasjonstid for kort</td>
			<td>Øke antistoff inkubasjonstid (opptil 24h ved romtemperatur)</td>
		</tr>
<tr>
<td>kolonier flatet under montering prosedyre</td>
			<td>Monter Micropattern lysbilder i et kammer som chamlide eller cytoo-kamre for å utføre både immunostaining og bildebehandling uten behov for montering av cellene. Dette vil bedre bevare koloniene 3D-struktur.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frakobling av kolonier under farge prosedyren</td>
			<td>Dewetting av chip</td>
			<td>La det være nok medium eller bruk 2 Pipetter, ett for å fjerne mediet og det andre for å legge til den nye løsningen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koloniene vises skåret under mikroskopet</td>
			<td>kolonier ble skåret mens du monterer brikken på mikroskopi Slide</td>
			<td>Vær veldig forsiktig når du monterer sjetongene. Alternativt, montere micropatterns lysbilder inne en kammeret som chamlide eller cytoochambers å utføre begge to immunostaining og tenkelig uten behovet for montering cellene. Dette bevarer også kolonien Ultrastructure.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: feilsøkingsveiledning. Denne tabellen gir en oversikt over mulige sub-optimale utfall. De potensielle kildene til problemene er også listet opp sammen med anbefalte løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Metoden som presenteres her bruker micropatterning sammen med kvantitativ bildebehandling for å avdekke romlig organisering innen pattedyr kulturer. Teknikken er enkel å etablere i et standard cellebiologi laboratorium og tilbyr et medgjørlig system for å studere mønstre in vitro.

Kartlegging av emergent romlig organisering av pattedyrceller bruker Micropatterns og kvantitativ Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Denne metoden gjør det mulig å manipulere og kvantifisere hvordan cellene organiserer kollektivt. Dette er viktig fordi vi kan modellere mønster i in vitro og disentangle signaler tett skrevet in vivo. Teknikken krever minimalt spesialutstyr, slik at det kan etableres i et standard biologilaboratorium, og det er kvantitativt, noe som gjør det mulig å finne sub-visuelle mønsterhendelser.Denne metoden kan enkelt brukes på et hvilket som helst cellesystem der mønster kan dukke opp og oppdage ikke-tilfeldige mønstre av differensiering, spredning og celle-til-celle konkurranse. Hovedtrekket med denne metoden er systematisk optimalisering av mikropatteringsparametere for nye celletyper. Mønsterstørrelse og -form, matrisetype og celle vedheftstid er for eksempel mønsterstørrelse og -form.Bruk hansker, legg et stykke laboratoriefilm i bunnen av en 10-centimeter firkantet petriskål. Bruk et hullslag på 12 millimeter til å kutte hydrofobe plastsklier for å lage 12 millimeter-rundt dekselslips, og legg dekselslipper i en ny petriskål. Bruk pinsett til å fjerne beskyttelsesfilmen forsiktig fra dekselslippene.Plasser fotomasken på en ren og stabil overflate, krom side opp, og legg til en to-mikroliter dråpe dobbeltdestillert vann i posisjonen til ønsket chip design. Trykk forsiktig på et deksel som glir på dråpen og plasser holderen på toppen av plastskliene. Fest forsiktig denne sandwichen med klemmer for å opprettholde plastbitene i kontakt med fotomasken.Plasser enheten i en ultrafiolett ozonlampe omtrent to centimeter fra lyskilden i en 10-minutters belysning. På slutten av belysningsperioden, ta tak i smørbrødet med fotomasken nederst og fjern forsiktig klemmene samtidig som du opprettholder trykket med den ene hånden for å hindre at lysbildene beveger seg rundt mens de demonterer smørbrødet. Når alle klemmene er fjernet, fjerner du holderen, pass på at alle plastbitene fortsatt er på masken og ikke sitter fast på holderen, og legger dobbeltdestillert vann til sponene for å forsiktig løsne sponene fra fotomasken.Plasser de fotomønstrede sjetongene i matrisedeponeringskammeret, opplyst side opp, og legg til 200 mikroliter beleggoppløsning på hver brikke. Deretter legger du til en tre centimeter petriskål fylt med dobbeltdestillert vann til kammeret for å begrense fordampning ved fire grader Celsius over natten. For såing av embryonale celler på sjetongene, vask potetgullene med to minst fem minutters vasker i friske, sterile PBS per vask, før du dispenserer en gang ti til de femte cellene i 200 mikroliter av riktig cellekulturmedium på hver chip.Lukk deretter såingskammeret. Inkuber i en time for å la cellene holde seg til sjetongene. Når cellene har festet, fyll brønnene på en multibrønnplate med 500 mikroliter varmt medium per brønn, og bruk sterile pinsett for å overføre chips til individuelle platebrønner.Rist platen kraftig for å løsne eventuelle ikke-tiltalende celler, og skift umiddelbart supernatanten med friskt, varmt medium. Kontroller deretter under mikroskopet for å observere om mønsteret er synlig. 48 timer etter deres plating, bør cellene danne tette kolonier som følger nøye formen på mønstrene.La sjetongene i platen, fjern alt, men akkurat nok medium for å hindre at sponene tørker, og legger til minst 500 mikroliter paraformaldehyd eller PFA-basert fikseringsløsning per brønn. Etter ti minutter, vask brønnene kort tre ganger med vaskeløsning, etterfulgt av en vask med 50-millimolar ammoniumklorid fortynnet i vaskeløsning for å slukke gjenværende PFA crosslinking aktivitet. Etter siste vask, behandle prøvene med blokkeringsløsning i minst 30 minutter.For immunstaining av chip kulturer, overføre chips til en farging kammer celle side opp, og umiddelbart legge til 100 mikroliter av den primære antistoffløsning av interesse for hver chip. Etter en time på en roterende plattform ved romtemperatur, vask potetgullene tre ganger med vaskeløsning som demonstrert, og inkubere sponene med de riktige sekundære antistoffene i en time på den roterende plattformen. På slutten av den sekundære antistoffinkubasjonen vasker du sponene tre ganger i vaskeløsning og monterer brikken på et mikroskopisklie med 20 mikroliter av et hvilket som helst standard monteringsmedium.Hvis du vil se for deg sjetongene, må du først justere skannehastigheten, bildeoppløsningen, rammesnittet og detektorgevinsten for å identifisere en optimal mellom bildekvaliteten og bildetiden. Deretter skaffe bilder av hver chip. Når alle bildene er anskaffet, installerer og kjører DupCells etter dokumentasjonen som er tilgjengelig på nettet, oppretter et nytt eksperiment og importerer bildene til programmet.Bruk Nessys-modulen til å segmentere kjernene basert på atomkonvoluttsignalet. Bruk den grunnleggende segmenteringsmodulen til å identifisere mønsterets autofluorescence-signal. Klikk deretter Fullfør"og vent til alle bildene skal behandles.Hvis du vil opprette kjerneobjekter og beregne grunnleggende objektfunksjoner, starter du modulen Intrinsic Features fra oppgavelinjen og lukker Ellipsoid Montør- og Surface Extractor-panelene for å holde panelet Grunnleggende funksjoner åpne. Velg kjernen"som objekttype, og velg det angitte prefikset som er gitt for de segmenterte bildene. Klikk deretter på Compute", og vent til alle bildene skal behandles.På dette stadiet må flere funksjoner skrives inn i kjerner før du eksporterer dataene for vår analyse. Hvis du for eksempel vil lagre navnet på bildet hver kjerne tilhører som et Nucleus-attributt, klikker du Data"og Nytt attributt"og velger kjerne"i popup-dialogen. Klikk OK"velg Samle inn data fra andre objekter som er koblet til noden", og klikk neste"I venstre panel, velg Bilde"og dobbeltklikk på avhørsmerket for å angi bildenoden som mål for banen.Utvid Reduksjonsoperasjon-ruten, og velg Hent en"Utvid ruten Tilgjengelig attributt og velg Navn-attributtet. Klikk deretter Endre"og Neste"Skriv inn bildenavn, trykk tab-tasten, og klikk Fullfør"Eksporter deretter dataene til en tabulatordelt verdifil. For vår analyse kan du sløyfe de eksporterte dataene til datamappen i R-Script-mappen.Åpne Vårt Studio"og åpne binned kartmalen R-Script"Sett deretter arbeidsmappen til kildefilplasseringen, og kjør skriptet for å generere tetthetskart. På en time etter cellesåing kan den enkelte cellekulturen klappe ikke være helt samløpet som cellene sprer seg over tid. Mønstrene vil imidlertid bli fullstendig kolonisert med bare svært få celler utenfor klebende overflater.Mønster som ikke er klart opptil to timer etter såing indikerer en feil i prosedyren. Den romlige innesperringen av mus embryonale stamceller på store disker eller ringmikromønstre styrer mønsteret av en underpopulasjon av celler som uttrykker den mesodermale brachyury markøren. For eksempel, når musen embryonale stamceller dyrkes på store mikromønstre, er brachyury-positive celler fortrinnsvis begrenset til periferien av mønsteret der den lokale celletettheten er den laveste.Dette mønsteret er bekreftet av kartet over hjerne-brachyury intensitet. Disse dataene viser at metoden kan avsløre subvisuell informasjon som inspeksjon av en koloni er ikke tilstrekkelig til å identifisere noen form for romlig organisasjon i markør for interesseuttrykk. Dette forklares spesielt av den viktige koloni-til-kolonivariabiliteten.Teknikken viser også at det ikke finnes noe påviselig mønster for hemmer av DNA-bindende som kan tyde på at T-mønster ikke drives av beinmorfogenetisk proteinsignalering i denne sammenhengen. Husk alltid hvilken side av dekselet slip har eliminert og belagt, og også være sikker på at cellene har riktig festet før vasking av overflødige celler. Denne metoden gjør det mulig å studere miljøsignalene som er viktige for å veilede selvorgan organisering av celler, og kan også informere matematiske modeller som hjelper oss bedre under rudimental mønster.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generering av Aggregater av mus embryonale stamceller som Vis Symmetry Breaking, Polarisering og Emergent Collective Behaviour<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing celler i GFP-transgene Sebrafisk Bruke Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent stamceller for undersøkelser romlige organiseringen av differensiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Bestilling av Dynamic Expression data fra Detaljert Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-funksjon studier i mus embryonale stamceller Bruke recombinase-mediert Cassette Veksling

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...