Name: mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Bu iş Bir Sör Henry Wellcome sonrası Doktora Bursu (WT100133 için), bir Wellcome Trust kıdemli Bursu (WT103789AIA S.L.) ve bir Wellcome Trust doktora öğrencilik (108906/z/15/z D.W.) tarafından finanse edildi. Biz de Dr manuel thery için photopatterning tekniği uyarlama hakkında onun tavsiyesi için minnettarız.

<ol>
	<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells.">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioengineering:+building+from+stem+cell+biology.">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing.">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning.">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells.">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micropatterning in cell biology. Pt. A. , (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo.">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366 (2017).</li><li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells.">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li><li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+signaling+thresholds+in+&#8220;engineered+stem+cell+niches&#8221;+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens.">Manipulation of signaling thresholds in &#8220;engineered stem cell niches&#8221; identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438 (2009).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization.">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells.">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).</li><li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li><li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation.">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li><li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., R&#252;ther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells.">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li><li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicistronic+targeting+constructs:+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression.">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nessys:+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D.">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872 (2018).</li><li>Weiswald, L. -. B., Guinebreti&#232;re, J. -. M., Richon, S., Bellet, D., Saubam&#233;a, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres:+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy.">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106 (2010).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li><li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-explorer:+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens.">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).</li><li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium.">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li><li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology.">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning.">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839 (2018).</li><li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms.">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).</li><li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Lamins+a+and+B1.">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level.">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos.">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li></ol>

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Burada hücrelerin kültürlerinde acil desenlemeyi analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Basitleştirilmiş bir mikrodesen yaklaşımı, hücre kolonilerinin şeklini ve boyutunu standardizmek için kullanılır ve bu kolonilerde desenlerin algılanmasını ve ölçülmesini sağlayan görüntü analiz araçları ve R scriptleri sunuyoruz.
Önerdiği boru hattı, yazarları kültür koşullarına odaklanarak, ticari olarak kullanılabilen mikrodesenleri kullanarak, ESC kolonilerinde yeniden üretilebilen germ katmanı oluşumu elde etmek için önceden yayımlanan bir yöntem31 ' e benzer. in vitro erken gastrülasyon olayların çalışması. Amacımız, hücrelerin kolektif organizasyonunun sadece istatistiksel analizden sonra belirgin hale gelmesine neden olan model oluşumunun keşfi için genelleştirilebilir bir boru hattı sağlamaya odaklanmıştır. Bu nedenle, çoklu koloniler üzerinde 3D alanda nükleer pozisyonun doğru tanımlanması ve analizini sağlayan sağlam bir görüntü analizi iş akışı sağlıyoruz (Ayrıca bkz. tartışma). Biz de topluluk için yararlı olacağını umuyoruz uzun vadede ticari çözümler için daha esnek ve ucuz bir alternatif sunan basit bir ev mikrodesen yaklaşımı geliştirmeye karar verdik.
Son olarak, bu makalenin revizyonu sırasında, R betiklerine benzer desen analizi için yeni bir paket32serbest bırakıldı. Bu yeni paket, yüksek verimlilik görüntüleme platformlarından elde edilebilir giriş olarak hücre özelliklerinin tablolarını kabul eder. Biz bu olasılığı kendimizi test değil olsa da bu yeni pakete bir giriş olarak ilke olabilir bizim protokolün 7 adımda oluşturulan çekirdekler özellikleri tablo inanıyoruz.
Yöntemin diğer hücre türlerine ve koloniye geometrilerine adaptability
Biz serum varlığında pluripotent hücrelerin kültürlerinde Mezodermal transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkması eğitim bağlamında bu yaklaşımı sunuyoruz. Ancak bu yöntem ECM/poloxamer 407 konsantrasyonlarını optimize etmek için gerekli olabilir, ancak diğer hücre türlerine ve serum içermeyen kültürlere kolayca uyarlanabilir (test konsantrasyonları için Tablo 1 ve bir sorun giderme kılavuzu için Tablo 2 ' ye bakın). Yöntem ayrıca, daha büyük veya daha küçük boyutlarda mikrodesenler ve Kullanıcı ihtiyaçlarına göre şekiller geniş bir yelpazede adapte edilebilir. Ancak, yöntemi oluştururken, tüm şekil/hücre türü kombinasyonları en iyi olduğunu farkında olmak önemlidir. Örneğin, mesc Express yüksek seviyeleri E-cadherin33,34 bu hücrelerin ECM yoksun alanları kapsayan kolektif yapıları oluşturmak için etkinleştirme. Bu hücreler kesinlikle keskin açılarla geometrileri takip etmez veya desen küçük delikler içerir. Örneğin dikkat edin, Şekil 3B'de, hücreler merkezi alanı kolonizasyon sürecinde. Bizim elimizde küçük bir merkezi alan mESC halka şekilli koloniler oluşturmak için zorlamaz. Bu nedenle, test etmek ve en uygun boyutları ve seçim hücre türü için uygun olacak eğrilik belirlemek muktedir fotomask tasarlarken geometrilerin bir çeşitlilik dahil etmek için tavsiye edilir.
Dikkate almak için bir diğer önemli faktör, deneme uzunluğu ve hücrelerin proliferasyon oranı. Bazı hızla Proliferasyona hücre türleri için (pluripotent hücreleri dahil) Bu birçok gün içinde mikrodesenler üzerinde hücreleri korumak için zor olabilir (mesc için üç gün maksimum). Ayrıca, mikrodesenler üzerinde hücrelerin tohumlama her zaman optimum her koloni için oluşmaz, bu yüzden yedek olması için kolonilerin aşırı tohum tavsiye edilir.
Avantaj ve desen algılama yönteminin sınırlamaları
Yöntemin belirli bir avantajı, birden fazla çoğaltma kolonilerinden gelen görüntü analizi sonuçlarını birleştirerek "ortalamayı" çoğaltmayı algılama yeteneğidir (Şekil 5). Bu, bireysel kolonilerin kontrollerinden belirgin olmayan desen olaylarını ortaya çıkarabilir. Bu ' ortalama ' yaklaşımının bir dezavantajı, örneğin küçük noktalar veya dar çizgiler için tekrarlayan kalıpların belirli türlerini kaçırmasıdır. Ancak, bu tür desen yerine dikkatle seçilmiş desen boyutları8kombinasyonu ile ortaya çıkabilir. Ayrıca, burada açıklanan görüntü analizi ardışık düzen kolonik değişkenlik seviyesini araştırmak için imkanı sunan hem tek hücreli hem de koloni çözünürlükte nicel veriler sağlar (Şekil 5) veya birden fazla komşu analizi gerçekleştirmek için ölçekler10.
Ortalama yöntemin bir diğer önemli avantajı da algılama kanalları mevcut fluorophores ile sınırlı kalmadan birçok işaretçileri tercihli konumu harita fırsatı sunuyor olmasıdır. Nitekim, biz burada sunulan çalışmalar farklılaşma sadece iki belirteçleri kullanmak rağmen, yeteneği koloniler standartlaştırmak ve özü "Ortalama" desenler mümkün kolonilerin farklı setleri dağıtım haritaları birlikte sırayla karşılaştırmak için yapar birbirine işaretçilerin Genelleştirilmiş uzamsal ilişkilerini ortaya çıkarmak için.
Ayrıca, burada bizim odak farklılaşma işaretçileri çalışma olmuştur rağmen, analiz yöntemi nükleer işaretçileri mevcut diğer biyolojik süreçleri incelemek için uzatılabilir. Örneğin, bir floresans mayası hücre döngüsü göstergesi35 (fuccı) içeren bir hücre satırının micropatterning nasıl koloni düzeyi geometrisi gruptaki hücre döngüsü olaylarını etkileyebilecek çalışma mümkün kılar.
Gelecekteki talimatlar
Yöntem orta verimlilik görüntü analizine imkan sağlar, ancak görüntü edinme Şu anda tam olarak otomatik değildir ve çok büyük deneyler için sınırlayıcı hale gelebilir. Kolonilerin düzenli düzenlemeleri mümkün olan tek hücreli ortalama20için geliştirilen ne benzer tam otomatize edinme rutinleri oluşturmak için yapmak gerekir. Ancak, bir koloni görüntü için gerekli alan boyutu büyük olasılıkla, mozaikleme gerektirdiğinden ve kolonilerin üç boyutlu olduğu için, sadece ilgili koloniler görüntüleme tarafından hem veri kümesi boyutunu ve edinme süresini azaltmak için son derece arzu edilir. Bu nedenle, gelecekteki çabaları ilgili kolonileri tanımlamak ve her örnek için görüntüleme koordinatları uyum mümkün bir ' akıllı ' mikroskop geliştirmek için adanmış olabilir. Bu sadece zaman ve çaba azaltmak değil, aynı zamanda potansiyel operatör önyargıları önlemek.
Çözümleme ardışık düzenlerini de Kullanıcı almak gereken adımlar sayısını azaltarak daha verimli hale gelebilir. Biz planları bir boru hattı oluşturma mekanizması oluşturmak ve R doğrudan bizim yazılım entegre etmek için (Ayrıca sorunları pickcells-API # 3 ve pickcells-rjava # 1 bizim kod depoları [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] sorun izci bakın). Analiz prosedürün tam otomasyonu zaman ve çaba azaltacak ve olası kullanıcı hatalarını kısıtlayacaktır.
Son olarak, analiz yöntemimizin hücresel deseninin dinamik yapısını henüz tam olarak yakalayamamaktadır. Bazı sınırlı dinamik bilgiler anlık görüntü görüntüleri8,10,36bir zaman serisi inceleyerek ayıklanabilir. Ancak, biz daha iyi desen nasıl ortaya anlamak istiyorsanız hücre nüfus geçmişini kaydetmek mümkün olmak çok arzu edilir. Bir sınırlama, 3B yoğun hücre popülasyonunda bireysel hücrelerin doğru izlenmesi çok zorlu bir görev37kalır. Bizim hücre algılama yöntemi nükleer zarf kullanır ve özellikle iyi yoğun ve çakışan hücre nüfusu28gerçekleştirir. Nükleer zarfın canlı gazetecileri28,38 ve micropatterning tekniğinin bir avantajı kolayca mevcut uzun süreli görüntüleme sırasında görüş alanı dışında hareket hücreleri önlemek için kullanılabilir olmasıdır. Genel olarak, hücrelerin otomatik izleme yakın zamanda kurulan araçların bir kombinasyonu kullanılarak ulaşılabilir olacak eminiz28,39,40 ve bu temel içine yeni Öngörüler getirmelidir kendi kendini organizasyon ilkeleri.

Memelinin sistemlerinde, desen hücrelerin kolektif davranışlarının acil bir özelliğidir ve böylece, hücreler1,2,3,4, uygun ipuçları sağlanırsa, desenler in vitro oluşturabilir 5 , 6. hücrelerin içsel yeteneğini ortaya çıkarmak için bir yolu kendi kendine-vitro düzenlemek için hücreleri oluşturmak için zorlamak için gruplar/koloniler tanımlanan şekiller ve boyutlar7,8,9,10 . Bunun sağlayan bir tekniği micropatterning11. Micropatterning, hücre içi matrisin (ECM) moleküllerinin bir yüzeye yatırılan konumunu tam olarak tanımlamanızı mümkün kılar. Bu, sırayla hücrelerin nasıl uyabileceği ve bu nedenle hücrelerin nasıl dağınık şekilde düzenlendiği kontrol eder.
Micropatterning çok sayıda uygulama ile bir tekniktir, örneğin, micropatterning farklılaşma öncesinde ilk koşulların standardizasyonu sağlar12. Önemlisi, micropatterning kolayca boyutu, şekil ve hücre kolonilerinin aralığını kontrol etmek mümkün kılar ve bu özellik, morphogen veya fiziksel ipuçları için hücrelerin toplu yanıt sorgulamayı amaçlayan deneyler hazırlamak için kullanılabilir7 , 8 , 10 ' dan fazla , 13 ' ü , 14 , 15 , 16 , 17 yaşında.
Çeşitli micropatterning yöntemleri geliştirilmiştir11. Photopatterning teknikleri belki18kurmak için en kolay yöntemlerdir. Tek hücrelerin şeklini kontrol etmek için kullanılabilir gibi bu yaklaşımlar da hassasiyet avantajı var18,19,20. Ancak, onlar da dahil olmak üzere pahalı özel ekipman gerektirir bir spin coater, bir plazma odası ve bir UVO (UV-ozon) temizleyici hangi genellikle kolay standart biyoloji laboratuvarlarında mevcut değildir. Tekniğin kabulü kolaylaştırmak için, biz sadece UVO lamba gerektirmek için protokol adapte. Biz makas veya istenilen biçime bir delik Punch ile kesilebilir ticari olarak kullanılabilir plastik slaytlar başlar.
Mikrokalıplarının önemli bir yardımcı programı, kolonileri bireysel kolonileri birden fazla çoğaltır arasında karşılaştırmak için standartlaştırmak etme yeteneğidir. Bu, bu kolonilerin içinde hangi ölçüde desen oluşumunun yeniden üretilebilirliğini sormayı ve Pattern sürecinin sağlamlığını etkileyen faktörleri keşfetmeyi mümkün kılar. Daha da önemlisi, birden fazla standartlaştırılmış koloniler arasında "Ortalama" kalıplarının ölçülmesi, aksi takdirde belirgin olmayacaktır desen süreçleri ortaya çıkarabilir. Standardize koloniler üzerinde desen ölçmek mümkün olmanın avantajı doğru tek hücre düzeyinde, ideal protein ifadesi ölçmek mümkün olmaya bağlıdır. Ancak, mikrodesenler üzerinde hücreler genellikle sıkıca paketlenmiş, yüksek doğruluk ile segment zor hale. Hücreler genellikle üç yerine iki boyut kendilerini organize ve algılamak ve segmentasyon sırasında üç boyutlu (3B) bilgileri korumak için zor olabilir. Hücreler başarıyla bölümlere ayrıldıktan sonra, sonuç veri kümelerinden desen bilgilerini ayıklamak için Hesaplamalı Yöntemler gereklidir.
Bu sorunların üstesinden gelmelerine yardımcı olmak için segmentasyon ve görüntü analiz araçları geliştirdik. Bu analiz yöntemi yalnızca ücretsiz ve açık kaynaklı yazılım kullanır ve komut satırı veya programlama bilgisini uygulamak için gerektirmez. Burada yöntemi göstermek için, biz fare embriyonik kök kullanın (mES) kendiliğinden erken farklılaşma brachyury bir marker ifade hücreleri (tbra)21,22. Hiçbir belirgin uzamsal düzenleme görsel olarak algılanabilir iken, yöntem kolonilerde T + hücrelerin Tercihli konumlandırma bir harita oluşturulması sağlar. Ayrıca bu tbra deseni, Idon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu23doğrudan bir okuma ifade hücrelerin tercihli bir lokalizasyonu yokluğunda kontrastlar gösterir. Ayrıca, yöntemin geçerli sınırlamalarını ve bu tekniğin diğer deneysel sistemlere nasıl adapte edilebilir olduğunu da tartışıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Master quartz anti-reflective chromium photomask</td>
			<td>Toppan Photomask</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Nunclon Delta</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Donkey Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Nuclear pore complex</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24609</td>
			<td>Mouse monoclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Id1</td>
			<td>Biocheck</td>
			<td>37-2</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lamin B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>Rabbit polyclonal, use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbra</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2085</td>
			<td>Goat ployclonal, use 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			5% Donkey Serum 
			0.003% Sodium Azide 
			In PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGR8 mESC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Reference: Mountford et al. PNAS, 1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>4% PFA diluted in washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>LayoutEditor</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://layouteditor.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor Software</td>
			<td>Klayout</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.klayout.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC Culture medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>GMEM 
			10% FCS 
			100 U/ml LIF 
			100 nM 2-mercaptoethanol 
			1&#215; non-essential amino acids, 
			2 mM L- glutamine 
			1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl 50mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (immunostaining)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in 200ml of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (tissue culture)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8591</td>
			<td>CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVO cleaner</td>
			<td>Jetlight, USA</td>
			<td>42-220</td>
			<td>CAUTION: Follow manufacturer&#8217;s safety recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.1% TritonX-100 
			0.01% Pluronic F-127 
			In PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the emergent spatial organization of mammalian cells using micropatterns and quantitative imaging

Biyolojide temel bir amaç, gelişim sırasında kalıplarının nasıl ortaya çıktığını anlamıdır. Çeşitli gruplar, kök hücreler dağınık bir şekilde mikrodesenler üzerine kapalı olduğunda desenlerin in vitro olarak elde edilebildiği, böylece tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunan deneysel modeller kurmak göstermiştir, in vitro, biyolojik temel ilkeleri Organizasyon.
Burada metodoloji kendi uygulanması açıklanmaktadır. Biz standart bir hücre biyoloji laboratuarında yöntemi kurmak daha kolay hale getirmek için özel ekipman ihtiyacını azaltmak için bir fotoğraf desen tekniği adapte. Ayrıca, standart şekiller ve boyutlarda koloniler içindeki hücrelerin alt nüfuslarının Tercihli pozisyonlanmasını tam olarak ölçmek için ücretsiz, açık kaynaklı ve kolay kurulabilir bir görüntü analizi çerçevesi geliştirdik. Bu yöntem, hücrelerin görünüşte düzensiz nüfuslarında bile desen olayların varlığını ortaya çıkarmak mümkün kılar. Teknik, nicel öngörüler sağlar ve belirli bir desen sürecinde ortamın (örn. fiziksel ipuçları veya endojen sinyalizasyon) etkilerini ayrıştıracak şekilde kullanılabilir.

Burada açıklanan fotoğraf deseni yöntemi, kültürlü hücreleri tanımlanmış şekiller ve boyutlarda kolonilere tam olarak düzenlemenize olanak sağlar. Bu prosedürün başarısı, Şekil 2a'da gösterildiği gibi fotomask tasarımına göre küme olacak şekilde hücre tohumlama prosedürü (adım 3,7) hemen sonra açıkça belirgin olmalıdır. Hücre tohumlama sonra 1 saat, bireysel desenler tam confluent olmayabilir (desen başına sadece birkaç hücre), ancak, hücreler zaman içinde çoğalırlar gibi, desenler tamamen yapışkan yüzeyler dışında sadece çok az hücre ile kolonize olacak (Şekil 2B). Kültürün tam görünümünü hücre satırı bağımlı olacaktır. Örneğin, mESC formu kubbeli şekilli koloniler10. Hücre tohumlama prosedürün başarısızlığı gösterir sonra desen 1 ila 2 h açık değildir bir çip (Şekil 2C, d).
Büyük ve kalın koloniler bazen homojen leke yapmak için zor olabilir. Biz düzeltmek ve bu antikor penetrasyon artırabilir gibi bir adımda (Bölüm 4) hücreleri penetrabilize öneririz29. Bu nedenle, seçilmiş olan fixatif çözümün bir deterjan içerdiğinden dolayı. Şekil 3 , immünostesden sonra beklenen floresan sinyalini gösterir. Parlak ID3 pozitif hücrelerin kolonilerin yoğun bölgelerinde (parlak NPC bölgeleri) bulundukları dikkat edin (Şekil 3A). Bu gibi ipuçları antikor boyama prosedürü kalitesini değerlendirmek için yararlıdır. Ayrıca mevcut tekniği ile oluşturulan mikrodesenler autofluorescent olduğunu dikkat edin. Bu sinyal (Şekil 3A, B sol çoğu görüntü), analiz aşamasında kolonileri birbirleriyle dağınık şekilde kaydetmek ve Şekil 5' te gösterilen sonuçları oluşturmak için yararlıdır. Örnek bir 405 nm lazer ile heyecan ve bu kanal bu amaç için boyama olmadan bırakılmalıdır zaman otofloresans sinyali genellikle parlak. Şekil 3 aynı zamanda hücrelerin farklı şekillerin desenlerinde tam olarak nasıl kısıtlı olduğunu gösterir.
Görüntüleme verilerinin analizi, laboratuvarımızda (Blin ve al., hazırlık aşamasında) geliştirilen ücretsiz ve açık kaynaklı bir yazılım olan PickCells 'da gerçekleştirilir. Bu yazılım, nesne hesaplamak için (Şekil 4-2,4-4) vesegmentli nesneleri (Şekil 4-3, 4-5) segmentlere ayırmak için Konfokal görüntüleri (Şekil 4-1), okumak ve sıralamak için görüntü analiz modülleri içerir koordinatları veya Ortalama Yoğunluk gibi özellikleri (Şekil 4-6) ve verileri dışa aktarmak için (Şekil 4-7, 4-8). Daha da önemlisi, özellikle micropatterns üzerinde yetiştirilen hücreler gibi hücrelerin yoğun ve heterojen nüfusu için uygun olan Nessys28 denilen sağlam bir nükleer segment yöntemi geliştirdik (Şekil 3). Şekil 4 -2 her hücrenin doğru benzersiz bir renk kimliği verilen nessys modülünün temsili bir çıkış gösterir. Yalnızca en az düzenleme gerekli olmalıdır, ancak düzenleme Kullanıcı buna karar vermelidir mümkündür (Şekil 4-3). Son olarak PickCells veri görselleştirmek için görselleştirme modülleri bir dizi sağlar. Şekil 4-6' d a bir örnek verilmiştir: halka şeklinde bir koloni, çekirdeklerin z ekseni boyunca konumlarına göre renk kodlu olduğu 3B olarak işlenir. Analiz PickCells 'de doğrulandıktan sonra, Şekil 530' da gösterildiği gibi (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) adresinde bulunan komut dosyalarını kullanarak R 'de uzamsal eşlemeleri oluşturmak için veri ihraç edilebilir.
Son zamanlarda mesc 'nin küçük (30.000 μm2) disk veya elips mikrodesenlerinin uzamsal kısıtlanması, Mezodermal Marker tbra10' ı ifade eden hücrelerin alt popülasyonunun desenlerini yönlendirecektir. Böylece, burada bizim yöntemi göstermek için, Tbra deseni büyük kolonilerde (90.000 μm2) BMP sinyalizasyon etkilenir olabilir eğer sormak. Şekil 5A mesc büyük disk mikrodesenler üzerinde yetiştirilen gösterir, tbra + hücreler tercihen desen çevre (tbra + Yoğunluk Haritası), nerede yerel hücre yoğunluğu en düşük olduğu sınırlıdır ( Şekil 5A sol mavi harita bakın ). Tbra 'nın bu deseni, ortalama Tbra yoğunluğunun haritasına göre onaylanmıştır.
Bu veriler, yöntem alt görsel bilgileri gösterebilir gösterir. Nitekim, Şekil 3' ten, bir koloninin görsel gözetimi tbra ifadesinde herhangi bir uzamsal organizasyonun belirlenmesi için yeterli değildir. Bu özellikle önemli koloni tarafından ölçülebilir ve Şekil 5Asağ en panelinde gösterilen koloni değişkenliği tarafından açıklanmıştır.
Teknik aynı zamanda hiçbir algılanamayan desen var olduğunu gösterir ID+ (BMP sinyalizasyon hedefi), T desenleme BMP bu bağlamda sinyalizasyon tarafından tahrik değil gösterebilir.
Micropatterning mümkün neredeyse herhangi bir geometri benimsemeye koloniler zorlamak için yapar. Bu, sistemin çeşitli geometriler için nasıl yanıt verdiğini sorgulamak için özellikle yararlıdır. Örneğin, koloninin merkezinde bir morfojen degradesi yaratılırsa kolonide bir delik yaratmanın bu degradeyi bozmasına neden olabilir. İlginçtir ki hala daha az sağlam bir şekilde (Şekil 5B) bir halka mikrodesen üzerinde paterning gözlemlemek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig1.jpg"> Şekil 1: yönteme genel bakış. Yöntemin ana adımlarını gösteren diyagram. Her adım için, tahmini süreyi görevin adı altında belirtilir ve bir şematik yordamın amacını gösterir. Kullanılabilir olduğunda ilgili bir rakam için bir başvuru da sağlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig2.jpg"> Şekil 2: kültür görünümü 1 h ve 48 h mikrodesenler hücreleri tohumlama sonra. MESC Brightfield görüntüleri mikrodesenler üzerine diktir. (a) beklenen hücre organizasyonu 1 saat tohumlama sonra, desenler açıkça tanımlanabilir olmalıdır. (b) kültür 48 h sonra beklenen sonuç. mesc çoğaldı ve hala kesinlikle desen şekilleri ile sınırlıdır. (c-d) Mümkün olmayan en iyi sonuçlar, ya çok az hücre slayt (c) veya hücreler arasında (d) arasında uyur çevre dışında plastik uyması. Sorun giderme kılavuzu için Tablo 2 ' ye bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig3.jpg"> Şekil 3: mikrodesenler üzerinde yetiştirilen immünostik kolonilerin temsilcisi Konfokal görüntüler. (A) IDD ve nükleer gözenek kompleksi veya (B) tbra ve LaminB1 için immünofluorescence sonrası temsilci mesc kolonileri. Her boyama için, bir disk micropattern üzerinde yetiştirilen bir koloni ve bir halka mikrodesen üzerinde yetiştirilen bir koloni gösterilir. Bireysel kanallar gri ölçekli görüntüler olarak sağlanır. Micropattern (405 nm lazer uyarma) net otomatik floresan sinyali dikkat edin. Ölçek çubuğu 50 μm temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın</a> .
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig4.jpg"> Şekil 4: görüntü analiz prosedürün akış çizelgesi. 3B Konfokal görüntülerin listesi analiz için PickCells 'a aktarılır (1). Bu örnek, iki farklı şekil (disk ve yüzük Şekil 2' de olduğu gibi) ile bir deneme gösterir. Görüntü adlandırma kuralı soldaki gösterilir ve PickCells sağdaki arabirim. Sonra, Nessys modülü otomatik olarak çekirdeğini segmentlere ayırmak için kullanılır (2). Ekran görüntüsünde, her çekirdek doğru segmentasyon gösteren benzersiz bir renk verilir. Desenin otofloresans de bu kez, ' temel segmentasyon ' modülü (4) kullanarak, bölümlenmiştir. Arka plan mavi ve beyaz sinyalin desen şekli olarak tanımlanacaktır. Bölümlere ayrılmış şekiller daha sonra doğru segmentasyon sağlamak için görsel olarak denetlenir ve segment düzenleyici modülünü (3 – 5) kullanarak gerekirse düzenlenebilir. Ekran görüntüleri algılanan şekillerin anahatlarını gösterir. Pembe ve sarı şekiller düzenlenmiştir. Son olarak, nesneler özellikleri hesaplanır ve daha sonra R (6 – 7) işlenmek üzere dosyaya verilir. 3B görünüm olarak işlenen bir koloninin ekran görüntüsü sağlanır (6). 2 ile 6 arasındaki adımlar için, bu makaleyi yazma sırasında PickCells arabiriminde bulunan simgeler adım dizininin yanında verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig5.jpg"> Şekil 5: iki farklı transkripsiyon faktörü ve mikrodesen şekilleri için temsilci sonuçları (A) disk şekilli mikrodesenler veya (B) halka şekilli mikrodesenler için 48 h için yetiştirilen mesc için Binned uzamsal harita. Her mikrodesen şekli için, hücre fenotipinden bağımsız olarak hücre yoğunluğunun Haritası sol tarafta mavi renk ölçeğinde gösterilir. Daha sonra her marker için (üst satırda Tbra ve alt satırda ID3), üç farklı haritalar, soldan sağa sağlanır: hücre yoğunluğu Haritası işaret hücreleri sadece (eşik tabanlı analiz), ortalama Marker yoğunluğu Haritası (log2) ve harita işaret yoğunluğunun standart sapması. Yoğunlukları, rasgele floresan üniteleri olarak verilir. Her harita için mikro desen şekli beyaz bir anahat olarak verilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ECM tipi</td>
			<td>Jelatin</td>
			<td>Fibronektin</td>
			<td>Bodrum membran matris</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Konsantrasyon</td>
			<td>ECM konsantrasyonu</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>20 μg/mL</td>
			<td>200 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poloxamer 407 konsantrasyon</td>
			<td>500 μg/mL</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">İle test edildi</td>
			<td>mESC</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mesic</td>
			<td>No</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Serum ücretsiz orta</td>
			<td>No</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Poloksamer 407 ve ECM 'nin test edilmiş konsantrasyonları. Bu tablo, laboratuvarımızda test ettiğimiz ECM ve Poloksamer 407 konsantrasyonlarına genel bir bakış sağlar. Her ECM/poloxamer 407 kombinasyonu için, deseninin başarıyla elde edildiği hücre tipi, kültürün serum olup olmadığına bakılmaksızın gösterilir. mESC = fare embriyonik kök hücre, Mesic = fare epiblast kök hücresi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yordam</td>
			<td>Gözlem</td>
			<td>Olası sorun</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">Mikrodesenlama</td>
			<td rowspan="3">Düşük hücreli ataşman</td>
			<td>uygunsuz ECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranı</td>
			<td>ECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranını artırın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hücre eki süresi çok kısa</td>
			<td>Hücrelerde düzgün desenlerine uymak için yeterli zaman vermek için inkübasyon süresini artırın (adım 3,4). Bu adımı optimize etmek için, mikroskop altındaki hücreleri kontrol etmek, hücrelerin uyamaya başladığını belirten hücre morfolojisinde bir değişiklik saptamanıza yardımcı olabilir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çok yoğun yıkıyor (adım 3,6)</td>
			<td>Orta değiştirirken, doğrudan çiplerin üzerine pipetleme orta kaçının. Bunun yerine, yavaşça yerine kuyu duvarlarında orta pipet</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Hücreler desenler arasında uyur</td>
			<td>uygunsuz ECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranı</td>
			<td>ECM/poloxamer 407 konsantrasyon oranını azaltın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hücre eki süresi çok uzun</td>
			<td>İnkübasyon süresini azaltın (adım 3,4).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etkisiz yıkıyor (adım 3,6)</td>
			<td>Plaka sallama şiddetle genellikle fazla hücreleri ayırmak için yeterlidir. Çip için güçlü bir şekilde yapışmaya eğilimli hücre türleri için, doğrudan çipin üzerine pipetleme sonucu artırabilir. Yıkanmaları sayısını artırmak da yardımcı olabilir, özellikle hiçbir hücre bu adımdan sonra ortamda yüzen kalmasını sağlamak için.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Hücreler desen şeklini kesinlikle takip etmiyor</td>
			<td>' Uyumsuz ' hücre türü ve desen geometrisi</td>
			<td>Belirli bir desen şekli ve hücre türü için optimum desen boyutunu test etmek ve tanımlamak için photomask üzerine eklenecek çoklu geometrileri/boyutları planlayın/tasarlayın. Lütfen, tartışmada ' sınırlamalar ' bölümüne bakın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Optimum olmayan fotoğraf deseni, bu otomatik osilesan sinyalinin keskinliğini gözlemleyerek teşhis edilebilir. Desen sınırları Şekil 2 ' de olduğu gibi keskin görünmelidir. Kalıpların kenarlıkları bulanık görünüyorsa, fotoğraf deseni adımının geliştirilmesi gerekir.</td>
			<td>Bulanık desen kenarları, plastik kaydırmanın aydınlatma adımında maske yüzeyine yeterince yakın olmadığını gösterir. Fotoomask için slaytları tutan parçaların bile ve aydınlatma prosedürü sırasında montaj için sabit ve yeterli basınç uygulandığından emin olun.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Boy -ama</td>
			<td rowspan="2">Homojen olmayan boyama</td>
			<td>antikor inkübasyon süresi çok kısa</td>
			<td>Antikor kuluçk süresini artırın (Oda sıcaklığında 24 saate kadar)</td>
		</tr>
<tr>
<td>montaj prosedürü sırasında düzleştirilmiş koloniler</td>
			<td>Hücre montajı için ihtiyaç duymadan hem immünostasyon hem de görüntüleme yapmak için chamlid veya cytoo-Chambers gibi bir oda içinde mikro desen slaytlar monte edin. Bu daha iyi koloni 3D-yapı korumak olacaktır.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Boyama prosedürü sırasında koloniler ayırma</td>
			<td>Çipin dewetting</td>
			<td>Yeterli orta bırakın veya 2 pipetler kullanın, bir orta ve diğer taze çözüm eklemek için kaldırmak için</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koloniler mikroskop altında parçalanmış görünüyor</td>
			<td>mikroskobik slayt üzerinde çip monte ederken koloniler yamultulmuş edildi</td>
			<td>Yongaları monte ederken çok nazik olun. Alternatif olarak, mikrodesenler monte etmek için pah veya sitooda gibi bir odada hücrelerin montajı gerek kalmadan hem immünostalite hem de görüntüleme yapmak için slaytlar. Bu da koloni ultrastrine korur.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: sorun giderme kılavuzu. Bu tablo, olası alt optimal sonuçlara genel bir bakış sağlar. Sorunların potansiyel kaynakları da önerilen çözümlerle birlikte listelenir.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging at JoVE.com

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Bu yöntem, hücrelerin toplu olarak nasıl organize olduğunu manipüle etmeyi ve ölçmeyi mümkün kılar. Bu önemlidir, çünkü in vitro ve disentangle ipuçlarını in vivo ile sıkıca birleştirilmiş olarak modelleyebiliriz. Bu teknik, standart bir biyoloji laboratuvarında kurulmasına olanak tanıyan en az uzman ekipman gerektirir ve kantitatiftir ve alt-görsel desenleme olaylarının keşfini mümkün kılar.Bu yöntem, desenlemenin ortaya çıkabileceği herhangi bir hücre sistemine kolayca uygulanabilir ve rastgele olmayan farklılaşma, çoğalma ve hücreden hücreye rekabetinin modellerini keşfedebilir. Bu yöntemin ana yeni hücre tipleri için mikro desenleme parametrelerinin sistematik optimizasyonu dur. Örneğin, desen boyutu ve şekli, matris türü ve hücre yapışma süresi.Eldiven giyerek, 10 santimetre karelik petri kabının dibine bir parça laboratuvar filmi yerleştirin. Hidrofobik plastik slaytları kesmek için 12 milimetrelik bir delik delme kullanın ve kapak fişleri yeni bir Petri kabına yerleştirin. Koruyucu filmi kapak fişlerinden dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın.Fotoğraf maskesini temiz ve kararlı bir yüzeye yerleştirin, krom tarafını yukarı yada ve istenilen talaş tasarımına iki mikrolitrelik çift distile su ekleyin. Yavaşça damla üzerine bir kapak fişi basın ve plastik slaytlar üstüne tutucu yerleştirin. Fotoğraf maskesi ile temas halinde plastik parçaları korumak için kelepçeler ile dikkatle bu sandviç düzeltmek.10 dakikalık bir aydınlatma için ışık kaynağından yaklaşık iki santimetre bir ultraviyole ozon lambası montaj yerleştirin. Aydınlatma süresinin sonunda, alttaki fotoğraf maskesi ile sandviçi tutun ve bir yandan sandviçi sökerken kaydırakların hareket etmesini önlemek için basıncı korurken kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Tüm kelepçeler çıkarıldığında, tüm plastik parçaların maskeüzerinde hala durmasına ve tutucuya yapışmadığını göz önünde bulundurarak tutucuyu çıkarın ve cipslere çift distile su ekleyerek cipsleri fotoğraf maskesinden nazikçe ayırın.Fotoğraf desenli talaşları matris biriktirme odasının içine yerleştirin, ışıklı tarafı yukarı yada ve her yonganın üzerine 200 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir gecede dört santigrat derecede buharlaşmayı sınırlamak için odaya çift distile su ile dolu üç santimetrelik Petri kabı ekleyin. Embriyonik hücrelerin çiplerin üzerine tohumlanması için, her bir çipin üzerine uygun hücre kültürü ortamının 200 mikrolitresinde beşinci hücrelere bir kere on kere dağıtmadan önce, talaşları her bir çipte en az beş dakikalık yıkamalarda en az beş dakikalık yıkama ile yıkayın.Sonra tohumlama odasını kapatın. Hücrelerin çiplere yapışmasını sağlamak için bir saat kuluçkaya yat. Hücreler bağlandığında, çok kuyulu bir plakanın kuyularını her kuyuda 500 mikrolitre sıcak ortamla doldurun ve talaşları tek tek plaka kuyularına aktarmak için steril cımbız kullanın.Yapışmaz hücreleri ayırmak için tabağı şiddetle çalkalayın ve süpernatant'ı hemen taze, sıcak ortamla değiştirin. Daha sonra desenleme görünür olup olmadığını gözlemlemek için mikroskop altında kontrol edin. Kaplamalarından 48 saat sonra, hücreler desenlerin şeklini titizlikle takip eden yoğun koloniler oluşturmalıdır.Plaka da yongaları bırakarak, tüm ama sadece yeterli orta kurumasını yongaları önlemek için kaldırmak ve iyi başına paraformaldehit veya PFA tabanlı fiksasyon çözeltisi en az 500 mikrolitre ekleyin. On dakika sonra, kısaca yıkama çözeltisi ile kuyuları üç kez yıkayın, ardından 50 milimolar amonyum klorür ile yıkama çözeltisi seyreltilmiş artık PFA crosslinking aktivitesini söndürmek için. Son yıkamadan sonra, numuneleri en az 30 dakika boyunca engelleme solüsyonu ile tedavi edin.Çip kültürlerinin immünboyboyama için, bir boyama odası hücre tarafına yongaları aktarın ve hemen her çip ilgi birincil antikor çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında dönen bir platformda bir saat sonra, yongaları gösterildiği gibi yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın ve talaşları dönen platformda bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. İkincil antikor kuluçkasının sonunda, talaşları yıkama çözeltisinde üç kez yıkayın ve çipi herhangi bir standart montaj ortamının 20 mikrolitresi ile mikroskopi slaytına monte edin.Çipleri görüntülemek için, görüntü kalitesi ile görüntüleme süresi arasında optimum bir değer belirlemek için önce tarama hızını, görüntü çözünürlüğünü, kare ortalamasını ve dedektör kazançlarını ayarlayın. Sonra her çipgörüntüleri elde. Tüm görüntüler edinildiğinde, çevrimiçi olarak sunulan belgeleri takip eden PickCells'i yükleyin ve çalıştırın, yeni bir deneme oluşturun ve görüntüleri programa aktarın.Nükleer zarf sinyaline göre çekirdekleri segmente etmek için Nessys modüllerini kullanın. Desenin otofloresan sinyalini tanımlamak için temel segmentasyon modüllerini kullanın. Ardından Bitir"e tıklayın ve tüm görüntülerin işlenmesini bekleyin.Çekirdek nesneleri oluşturmak ve temel nesne özelliklerini hesaplamak için görev çubuğundan İçsel Özellikler modülünü başlatın ve yalnızca Temel Özellikler panelini açık tutmak için Elipsoid Aşındırıcı ve Yüzey Çıkarıcı panellerini kapatın. Nesne Türü olarak çekirdek"i seçin ve parçalı görüntüler için verilen önek'i seçin. Ardından İşlem"i tıklatın ve tüm görüntülerin işlenmesini bekleyin.Bu aşamada, analizlerimiz için verileri ihraç etmeden önce çekirdeklere ek özellikler yazılması gerekmektedir. Örneğin, her çekirdeğin ait olduğu resmin adını Nucleus Özniteliği olarak depolamak için, Açılan Pencere'de Veri"yi ve Yeni Öznitelik'i tıklatın ve çekirdeği seçin. Tamam"ı seç düğümüne bağlı diğer nesnelerden veri topla'yı tıklatın ve Sonraki"Sol panelde Resim'i seçin" seçeneğini tıklatın ve yol hedefi olarak görüntü düğümünü ayarlamak için sorgu işaretine çift tıklayın.Azaltma İşlemi bölmesini genişletin ve "Kullanılabilir Öznitelik bölmesini Genişlet ve Ad özniteliğini seçin. Ardından Değiştir"i ve Sonraki"Resim adını girin, Sekme tuşuna basın ve Bitiş"i tıklatın ve verileri sekmeyle ayrılmış bir değer dosyasına aktarın. Analizlerimiz için, dışa aktarılan verileri R-Script klasörünün veri klasörüne aktarın.Studio'muzu açın" ve binned harita şablonu R-Script açın"Sonra kaynak dosya konumuna çalışma dizini ayarlayın ve yoğunluk haritaları oluşturmak için komut dosyası çalıştırın. Hücre tohumlamadan bir saat sonra, hücreler zamanla çoğaldığı için hücre kültürü pattens tam olarak konca olmayabilir. Ancak, desenler tamamen yapışkan yüzeyler dışında sadece çok az hücre ile kolonize olacak.Tohumlamadan iki saat sonrasına kadar net olmayan desenleme, yordamın başarısız olduğunu gösterir. Fare embriyonik kök hücrelerinin büyük diskler veya halka mikro desenleri üzerindeki mekansal hapsi, mezodermal brakitür belirteçlerini ifade eden bir alt hücre popülasyonunun desenlenmesini yönlendirir. Örneğin, fare embriyonik kök hücreleri büyük disk mikro desenleri üzerinde büyüdüklerinde, brachyury-pozitif hücreler tercihen yerel hücre yoğunluğunun en düşük olduğu örüntünün çevresi ile sınırlıdır.Bu desenleme beyin-brachyury yoğunluğu haritası ile doğrulanır. Bu veriler, bir koloninin denetimi ilgi ifade belirteci mekansal organizasyonun herhangi bir biçimbelirlemek için yeterli değildir gibi yöntem in alt-görsel bilgileri ortaya çıkarabilir göstermektedir. Bu özellikle önemli koloni-koloni değişkenliği ile açıklanabilir.Bu teknik aynı zamanda DNA bağlayıcısı inhibitörü için saptanabilir bir desenolmadığını göstermektedir ve bu da T-desenlemenin bu bağlamda kemik morfogenetik protein sinyali ile yönlendirilemediğini gösterebilir. Kapak fişinin hangi tarafının ortadan kaldırıldığını ve kapladığını her zaman hatırlayın ve ayrıca hücrelerin fazla hücreleri yıkamadan önce düzgün bir şekilde yapışmış olduğundan emin olun. Bu yöntem, hücrelerin kendi kendini düzenlemesinde önemli olan çevresel ipuçlarının incelenmesine olanak sağlar ve aynı zamanda ilkel desenleme altında bize daha iyi yardımcı olan matematiksel modelleri de bilgilendirebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o<em&gt; İn Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...