Name: a freeze-thawing method to prepare chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogels without crosslinking agents and diflunisal release studies
Uploaded: 2020-01-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Polyvinyl alcohol Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies at JoVE.com

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم لc. Luzuriaga للدعم المقدم في قياسات العرض. ويشكر المؤلفون أيضا الوزارة الاقتصادية الاسبانيه للدعم المالي (مشروع MAT2014-59116-C2-2-R) و PIUNA (الرقم المرجعي 2018-15). ويود أصحاب البلاغ أيضا ان ينووا بالدكتور أمير مالدونادو من ديبارتامينتو دي فيسيكا-انسجام للحصول علي الدعم والتعليقات المفيدة والدكتور سي بوررويل-بارا من DIPM-انسجام للصور SEM و روبيو فارما y Asociados s. A de c. v. للحصول علي الدعم المالي. ويود السيد مي مارتينيز-باربوسا ان يشكر مشروعي كوناكو (المكسيك) رقم 104931 و 256753 ، إلى جانب الدعم المالي المقدم من الشركة الحمراء لprograma دي ريديس تيماسيكاز ديل كوناكيت () (). وأيضا المشروع USO316001081. MD فيغيروا-Pizano ترغب في الاعتراف CONACyT للحصول علي الدعم المالي (منحه دراسية 373321).

1. اعداد الهلام المائي تشيسان بولي
<ol><li>اعداد 2 ٪ (ث/ث) الشيتوزان و 10 ٪ (ث/ث) الحلول بولي. تذوب 0.2 غرام من الشيتوزان في 10 مل من 0.1 M CH3الحل cooh (تصفيتها سابقا) في درجه حرارة الغرفة والحفاظ علي الاستمرار الميكانيكية التحريك بين عشيه وضحيها. تذوب 1 غرام من بولي في 10 مل من الماء المقطر ويحرك في 80 د?...

طريقه التجميد-الذوبان هي عمليه مناسبه لاعداد الهلام المائي المتوافق بيولوجيا المركز في التطبيقات الطبية الحيوية أو الدوائية أو التجميلوالتي34،35،36. الميزة الأكثر اهميه لهذه الطريقة ، مقارنه مع غيرها من الأساليب المعروفة لاعداد الهلام ا?...

في الاونه الاخيره ، وقد اجتذبت المواد الهلامية اهتماما كبيرا في مجال الطب الحيوي لأنها شبكات ثلاثية الابعاد مع محتوي المياه العالية ولينه ومرنه ، حتى يتمكنوا من تقليد الانسجه الطبيعية بسهوله1. أيضا ، فانها لا تذوب في الوسط المائي في درجه الحرارة الفسيولوجية والحموضة ولكن تقديم تورم كبير2. يمكن للهيدروجيل ان يكون بمثابه السقالات الهندسية للانسجه ، ومنتجات النظافة ، والعدسات اللاصقة ، وضمادات الجروح. لأنها يمكن ان فخ والإفراج عن المركبات النشطة والمخدرات, يتم استخدامها كنظم تسليم المخدرات3. اعتمادا علي تطبيقها ، يمكن اجراء الهلام المائي من البوليمرات الطبيعية أو الاصطناعية ، أو مزيج من كليهما ، من أجل الحصول علي أفضل الخصائص4.
خصائص المواد الهلامية المائية هي نتيجة للعديد من العوامل الفيزيائية والكيميائية. علي المستوي المادي ، وهيكلها والمورفولوجية تعتمد علي المساميه ، وحجم المسام وتوزيع المسام5. علي المستوي الكيميائي والجزيئي ، ونوع البوليمر ، ومحتوي المجموعة ماء في سلسله البوليمر ، ونوع نقطه تشابك ، والكثافة عبر ربط هي العوامل التي تحدد قدره التورم والخواص الميكانيكية6،7.
ووفقا لنوع عامل الربط العابر المستخدم لتشكيل الشبكة ، تصنف المواد الهلامية المائية علي انها هيدروجيل كيميائي أو هيدروهلامي فيزيائي. وتنضم المواد الهلامية الكيميائية من خلال التفاعلات المتبادلة بين سلاسلها ، والتي تتشكل من خلال الاشعه فوق البنفسجية وأشعه جاما أو باستخدام عامل تشابك7،8. المواد الهلامية الكيميائية عاده ما تكون قويه ومقاومه ولكن ، عموما ، عامل الربط هو سام للخلايا وأزاله من الصعب ، لذلك تطبيقه محدود. [ان ث ون هند], طبيعيه هيدروهلام شكل بالتوصيل من البوليمر سلاسل من خلال تفاعلات [نون-زسلس], يتفادى الاستعمال من [كروينكويد] عاملات4,9. التفاعلات غير المتبادلة الرئيسية في الشبكة هي التفاعلات مسعور ، وقوات الكهرباء ، والتكميلية وحدود الهيدروجين7.
بولي (الكحول الفينيل) (فا ، الشكل 1ا) هو البوليمر الاصطناعية والقابلة للذوبان في الماء مع الأداء الميكانيكي ممتازة والتوافق الحيوي التي يمكن من تشعبي وكيل خاليه من الهيدروجيل من خلال طريقه تجميد الذوبان10،11. هذا البوليمر لديه القدرة علي تشكيل مناطق مركزه من الروابط الهيدروجين بين-OH مجموعات من سلاسل الخاصة بهم (المناطق البلورية) عندما يتم تجميد12. هذه المناطق البلورية بمثابه النقاط المتقاطعة في الشبكة ، ويتم الترويج لها من قبل اثنين من الاحداث: تقترب من سلاسل البوليمر عندما تتوسع المياه البلورية والتغييرات المطابقة بولي من النظائر إلى التوليف التوافقي خلال تجميد13. بسبب تجميد التجفيف ، يتم التسامي بلورات المياه ، وترك المساحات الفارغة التي هي المسام في هيدروجيل14. للحصول علي الهيدروجيل مع خصائص أفضل ، يمكن بسهوله الجمع بين بولي مع البوليمرات الأخرى.
وبهذا المعني ، تشكل الشيسان خيارا لأنها البوليمر الوحيدة من المصادر الطبيعية ذات الرسوم الايجابيه. يتم الحصول عليه من قبل deاسيتيل من كيتين وهو يتالف من مجموعات عشوائية من β-1 ، 4 مرتبطة د-الجلوكوزامين (وحده دياسياتيد) و N-اسيتيل-د-الجلوكوزامين (وحده اسيتيل)15،16 (الشكل 1ب). Chitosan هو القابلة للتحلل من قبل الانزيمات البشرية وانها متوافقة بيولوجيا. أيضا ، من خلال طبيعته الموجبة ، يمكن ان تتفاعل مع الشحنة السالبة لسطح الخلية ، وقد ارتبطت هذه الخاصية مع نشاطها المضاد للميكروبات17. هذا البوليمر من السهل لمعالجه; ومع ذلك ، خصائصها الميكانيكية ليست كافيه وتمت أضافه بعض المواد لتشكيل المجمعات مع خصائص أفضل.
النظر إلى الخصائص المحددة للشيسان وبولي ، فقد تم التوصل إلى التصنيع الناجح للهيدروجيل بواسطة طريقه التجميد-الذوبان2،18 لتجنب استخدام العوامل المتداخلة السامة. في تشيسان بولي الهلام المائي ، يتم أيضا تشكيل المناطق البلورية من بولي ، وسلاسل الشيتوزان متداخلة وتشكل روابط الهيدروجين بسيطه مع-NH2 مجموعات و-OH المجموعات في بولي. النهائي تشيسان-بولي هيدروجيل مستقر ميكانيكيا ، مع معدلات عاليه من التورم والسمية المنخفضة ، ومع تاثير مضاد للبكتيريا18. ومع ذلك ، تبعا لظروف التجميد المستخدمة في الاعداد (درجه الحرارة والوقت وعدد الدورات) ، قد تتغير الخصائص النهائية. وتفيد بعض الدراسات ان زيادة عدد دورات التجميد يقلل من درجه التورم ويزيد من قوه الشد19,20. ومن أجل تعزيز الشبكة ، استخدمت عوامل أخرى مثل أشعه غاما والاشعه فوق البنفسجية والعوارض الكيميائية بالاضافه إلى ذلك بعد التحضير للتجميد المذاب21،22،23. الهلام المائي مع نسبه الشيتوزان اعلي لديها شبكه أكثر مساميه وقدره تورم عاليه ولكن اقل قوه والاستقرار الحراري. وفي هذا السياق ، من المهم النظر في تهيئه الظروف الملائمة للحصول علي الهلام المائي المناسب لتطبيقها المستهدف.
والغرض من هذا العمل هو تقديم بالتفصيل كيف ان ظروف التجميد (درجه الحرارة من تجميد وعدد من الدورات) تؤثر علي الخصائص النهائية للهيدروجيل CS-بولي. وجري تقييم أطياف الاشعه تحت الحمراء ، والخصائص المورفولوجية والمساميه ، وقدره التورم ، فضلا عن القدرة علي تحميل المخدرات والإفراج عنها. وفي الدراسات الخاصة بالإصدار ، استخدم ديرسب (الشكل 1ج) كدواء نموذجي ، بسبب حجمه المناسب للهيكل الهيدروجيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan medium molecular weight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448877</td>
			<td>Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diflunisal (2&#39;-4&#39;-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cressington Sputter Coater 108 auto</td>
			<td>TED PELLA INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryodos Lyophilizator</td>
			<td>Telstar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FT-IR spectroscopy</td>
			<td>Nicolet iS50</td>
			<td>in ATR mode</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromeritics Autopore IV 9500</td>
			<td>Micromeritics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Pemtron SS-300LV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Agilent 8453</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a freeze-thawing method to prepare chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogels without crosslinking agents and diflunisal release studies

تشيسان-بولي (الكحول الفينيل) يمكن ان تنتج المواد الهلامية المائية من خلال طريقه تجميد الذوبان دون استخدام عوامل الربط السامة. وتقتصر تطبيقات هذه النظم علي خصائصها (مثل المساميه ، والمرونة ، والقدرة علي التورم ، وتحميل المخدرات ، والقدرة علي الإفراج عن المخدرات) ، التي تعتمد علي شروط التجميد ونوع ونسبه البوليمرات. يصف هذا البروتوكول كيفيه اعداد الهلام المائي من الشيتوزان وبولي (الكحول الفينيل) في 50/50 w/w ٪ من تكوين البوليمر ومتفاوتة درجه حرارة التجمد (-4 درجه مئوية ،-20 درجه مئوية ،-80 درجه مئوية) وتجميد الذوبان دورات (4 ، 5 ، 6 دورات تجميد). وتم الحصول علي أطياف الاشعه تحت الحمراء ، وبيانات الرسم المجهري وقياس الجرعات من الهلام المائي. أيضا ، تم تقييم قدره التورم والمخدرات التحميل والإفراج عن ديرسب. تظهر النتائج من الرسوم البيانية المجهرية SEM وقياس الحرارة ان حجم المسام ينخفض ، في حين ان المساميه يزيد في درجات الحرارة المنخفضة. وكانت نسبه التورم اعلي عند درجه حرارة التجمد الصغرى. وقد تم دراسة الإفراج عن ديرسب يسال من الهلام المائي. جميع الشبكات الحفاظ علي الإفراج عن المخدرات لمده 30 ساعة ، وقد لوحظ ان اليه نشر بسيطه تنظم الإفراج عن diرسب يسال وفقا لنماذج كورسميير-بيبباس وهيجغوتشي.

اعداد الهلام المائي وقد تم الحصول علي الهلام المائي chitosan-بولي في-4 درجه مئوية ،-20 درجه مئوية و-80 درجه مئوية مع 4 دورات تجميد و-80 درجه مئوية مع 5 و 6 دورات تجميد بواسطة المبلغ عنها سابقا تجميد الذوبان الطريقة2. وكانت جميع الهلام المائي متجانسة وشبه شفاف?...

Watch this Scientific Journal Video about A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Polyvinyl alcohol Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies at JoVE.com

A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Polyvinyl alcohol Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies

يتم استخدام طريقه تجميد-الذوبان لإنتاج تشيسان بولي (الكحول الفينيل) المواد الهلامية المائية دون العوامل المتقاطعة. لهذا الأسلوب ، من المهم النظر في ظروف التجميد (درجه الحرارة ، وعدد من دورات) ونسبه البوليمر ، والتي يمكن ان تؤثر علي خصائص وتطبيقات الهلام المائي التي تم الحصول عليها.

طريقه تجميد الذوبان لتحضير شيسان-بولي (الكحول الفينيل) المواد الهلامية دون الربط بين العوامل ودراسات الإفراج عن ديرسب

Chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogels can be produced by the freeze-thawing method without using toxic crosslinking agents. The applications of these ...

هذا البروتوكول مهم لأن طريقة ذوبان التجميد لدينا هي عملية مناسبة لإعداد الهيدروجيلات القابلة للملاءمة بيولوجياً للاستخدام في التطبيقات الطبية الحيوية أو الصيدلانية أو التجميلية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها لا تستخدم عوامل الربط المتقاطعة الكيميائية التي يمكن أن تسبب عيبًا خلقيًا. أيضا، شرط التجميد المستخدمة في هذه الطريقة السيطرة على الممتلكات النهائية من الهيدروجيل مثل درجات.ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الهيدروجيل مع تطبيقات أخرى. هذا لا تستخدم لعلاج تلوث المياه. في الواقع، يمكن استخدامه لإنتاج حبات البوليمر المستخدمة كحاويات المياه لثقافة جديدة.من المهم أن التجانس تماما حل البوليمر أنه يقيس. خلاف ذلك ، فإن الهيدروجيل تقدم نقاط تكسير. أيضا، يجب أن تكون حذرا مع أوقات التجميد في كل دورة.لبدء هذا الإجراء حل 0.2 غرام من الشيتوزان و 10 ملليلتر من حمض الخليك 0.1 المولر في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على التحريك الميكانيكية المستمرة بين عشية وضحاها لإعداد محلول 2٪ من الشيتوزان. في اليوم التالي، قم بحل غرام واحد من PVA و 10 ملليلتر من الماء المقطر ويحرك عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. استخدام مُحرك مغناطيسي لخلط كمية متساوية من كلا الحلين في درجة حرارة الغرفة حتى تكون متجانسة.صب المخاليط على أطباق بيتري. اترك العينات عند الضغط الجوي لمدة ساعتين حتى اغدغ. تجميد الهيدروجيل في ناقص أربع درجات مئوية، ناقص 20 درجة مئوية، أو ناقص 80 درجة مئوية لمدة 20 ساعة وأربع دورات.تجميد هيدروجيل آخر في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 20 ساعة باستخدام إما خمس أو ست دورات تجميد. بعد دورة التجميد الثالثة، اغسل الهيدروجيلات بالماء الأيونيد. في نهاية دورة التجميد الماضي تجميد الهيدروجين في ناقص 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ويحرك لمزيد من التوصيف.عندما تكون على استعداد لأداء FT-IR توصيف مكان قطعة صغيرة من الهيدروجيل في مقياس الطيف FT-IR في وضع ATR. خذ الطيف FT-IR من 4000 إلى 600 أطوال موجية. أولاً، قطع أقراص من الهيدروجيل يبلغ قطرها 13 ملليمتراً وارتفاعها 10 ملليمترات.وزنهم. احتضان الأقراص في 50 ملليلتر من المياه الأيونية في 25 درجة مئوية في حين تهتز. كل 30 دقيقة إزالة العينة من المتوسطة.لطخة العينة للقضاء على أي المياه الزائدة ووزنها. ثم حساب درجة تورم وتنفيذ المجهر الإلكترونية وعدم التماثل المسام كما هو مبين في بروتوكول النص. قبل التحميل، إعداد أربعة لترات من محلول Diflunisal في 15 ملليغرام للتر الواحد ويحرك بين عشية وضحاها.تأكيد تركيز المحلل بواسطة الأشعة فوق البنفسجية-فيس الطيفي. ثم تنتفخ 400 ملليغرام من عينات هيدروجيل المجففة تجميد وستة ملليلتر من الماء المقطر لمدة 24 ساعة. للتحميل، تعبئة قارورة مع 50 ملليلتر من محلول Diflunisal والحفاظ على 25 درجة مئوية مع اثارة مستمرة.غمر كل هيدروجيل متضخم في القارورة. بعد ذلك، خذ 2 ملليلتر aliquots من الحل Diflunisal المتبقية في أوقات مختلفة من أجل تحديد منطقة هضبة المنحنى. بعد 24 ساعة، استبدل الحل بأخرى جديدة.قياس امتصاص كل aliquot في 252 نانومتر وتحديد تركيز Diflunisal الحاضر في الحل باستخدام منحنى المعايرة من Diflunisal. تحديد كمية Diflunisal الاحتفاظ بها في الهيدروجيل وكفاءة التغليف على النحو المبين في بروتوكول النص. ثم تجميد الهيدروجيلات المحملة في ناقص 80 درجة مئوية وlyophilize لهم في ناقص 50 درجة مئوية.لإطلاق المخدرات، غمر 300 ملليغرام من الهيدروجيل المجففة Diflunisal محملة و 50 ملليلتر من الفوسفات العازلة في درجة الH 7.4 وعند 25 درجة مئوية. الحفاظ على التحريك المستمر. سحب اثنين من aliquots ملليلتر في أوقات مختلفة واستبدالها بوسيط جديد للحفاظ على حجم ثابت.تحديد Diflunisal أطلقت الطيفية في 252 نانومتر وفقا لمنحني المعايرة. بعد ذلك، استدر آلية إطلاق المخدرات السائدة في الهيدروجيل كما هو موضح في بروتوكول النص. هنا يتم إعداد الهيدروجيل CSPVA دون وكلاء crosslinking باستخدام طريقة التجميد ذوبان الجليد.يُظهر الطيف FT-IR سبع إشارات مميزة لكل من البوليمرات. تظهر جميع الهيدروجيل CSPVA سطحًا شديد المسامية ويتم ملاحظة التغيرات المميزة وفقًا لظروف الإعداد. الهيدروجيل أعدت في ناقص أربع درجات مئوية تمثل أكبر المسام.ويبدو أن الهيدروجيلات التي أعدت عند درجة حرارة 80 درجة مئوية ناقصة لديها شبكة أكثر سهولة ويبدو أن عدد دورات التجميد يعزز المسام الأكثر تحديداً ودائرية. ومع ذلك، Hydrogels أعدت مع ست دورات تجميد في ناقص 80 درجة مئوية تظهر نفاذية أقل من تلك التي أعدت مع أربع دورات تجميد في ناقص 80 درجة مئوية ربما بسبب tortuosity عالية، والتي انعكست في انخفاض حجم التسلل الكلي. في تورم السلوك الهيدروجيل استيعاب كميات كبيرة من الماء بسرعة، والاحتفاظ عشرة أضعاف وزنها في الساعات الخمس الأولى وتصل إلى 15 مرة وزنها بعد 20 ساعة.عند مراقبة تأثير درجة الحرارة ، يُرى أن الهيدروجيل الذي تم إعداده بأربع دورات تجميد عند ناقص 80 درجة مئوية يظهر قدرة تورم أقل في الساعات الخمس الأولى. لا ينظر إلى عدد من دورات تجميد لخلق أي اختلافات في أي وقت. يتم الحفاظ على الحركية الافراج عن Diflunisal من الهيدروجيل لمدة 30 ساعة في جميع الحالات مع hydrogel أعدت مع أربع دورات تجميد في ناقص 80 درجة مئوية ، والإفراج عن أعلى كمية.لا يوجد فرق في الإفراج بين الهيدروجيل المعدة مع أربع دورات تجميد في ناقص 80 درجة مئوية والهيدروجيل أعدت مع ست دورات تجميد في ناقص 80 درجة مئوية. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو شروط التجميد. يجب أن تبدأ من ما يقرب من ثلاث دورات التجميد من أجل الحصول على الهيدروجيل كاملة، شكلت.ويمكن الجمع بين هذه الطريقة والخلايا لثقافة لتقييم التوافق الحيوي في المختبر. ويمكن أيضاً أن تقترن بدراسات للتدهور. بعد تطوير هذه الإجراءات أدركنا أنه يمكننا استكشاف إمكانية دمج البوليمرات الأخرى في الخليط أو حتى المركبات الطبيعية مثل الألوة فيرا.ومن شأن ذلك أن يسمح لنا بدمج خصائص جديدة في هذه المواد.

a-freeze-thawing-method-to-prepare-chitosan-polyvinyl-alcohol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

وتوليف الهلاميات المائية functionalized RGD-كأداة للتطبيقات العلاجية

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are composed of two components: hydrophobically modified cellulose as the network polymer and self-assembled core-shell nanoparticles that act as non-covalent cross linkers through dynamic, multivalent interactions. These methods describe both the formation of these self-assembled nanoparticles through nanoprecipitation as well as the formulation and mixing of the two components to form hydrogels with tunable mechanical properties. The use of dynamic light scattering (DLS) and rheology to characterize the quality of the synthesized materials is also detailed. Finally, the utility of these hydrogels for drug delivery, biopharmaceutical stabilization, and cell encapsulation and delivery is demonstrated through in vitro experiments to characterize&#160;drug release, thermal stability, and cell settling and viability. Due to its biocompatibility, injectability, and mild gel formation conditions, this hydrogel system is a readily tunable platform suitable for a range of biomedical applications.

This protocol describes the synthesis and formulation of injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogel biomaterials. Applications of these materials for drug delivery, biopharmaceutical stabilization, and cell encapsulation and delivery are demonstrated.

حقن فوق الجزيئية البوليمر نانوجسيمات هيدروجيلس لتطبيقات توصيل الخلايا والمخدرات

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...