Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
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作者感谢利亚·阿达迪教授、乔纳森·埃雷兹教授和Yael Politi博士进行了富有成果的讨论。这项研究得到了以色列科学基金会(ISF)的支持,赠款1150/14。

1. 碳酸钙结晶
<ol><li>控制准备和优化
	<ol><li>准备干净的玻璃片。使用相同的清洁程序清洁玻璃器皿。<ol>
<li>使用钻石笔切割玻璃显微镜幻灯片,使其适合 96 孔板的井。 注:5 毫米 x 5 毫米件应适合。</li>
			<li>将玻璃片放入装有三重蒸馏水 (TDW) 的烧杯中,以便水覆盖玻璃滑梯,并在浴缸声波器中声波 10 分钟。</li>
			<li>将水浸上,加入乙醇以覆盖玻璃滑梯,并在沐浴声波器中声波10分钟。</...

<ol>
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本文介绍的方法旨在以有机添加剂的存在形成碳酸钙晶体,并评估有机生物聚合物对碳酸钙晶体在体外形态和结构的影响。该方法基于在有机添加剂存在时形成的晶体与控制实验中形成的方解石晶体的比较。我们已经展示了如何使用扩散方法形成碳酸钙晶体,如何使用光学和电子显微镜来描述其形态,如何使用拉曼光谱来描述其结构,以及如何确定有机含量(重量/重量百分比)的晶体。
<p class="jove_cont...

生物矿化是在有机分子存在的情况下形成矿物质,通常与生物体的功能和/或结构作用有关。生物矿化可以是细胞内,如在磁化细菌1或细胞外形成磁铁矿,如在海胆尖峰2中形成碳酸钙,与胶原蛋白相关的羟基磷灰石骨骼3和与牙齿4中的阿美激素相关的釉质。生物矿化是一个复杂的过程,它依赖于生物体中的许多参数。因此,为了简化所研究的系统,有必要评估单独组件对过程的影响。在许多情况下,生物矿化是由细胞外生物聚合物的存在引起的。这里介绍的方法的用途如下:(1)利用蒸汽扩散方法在体外存在分离的生物聚合物的情况下形成碳酸钙晶体。(2)研究生物聚合物对碳酸钙形态和结构的影响。
在有机添加剂存在的情况下,在体外沉淀碳酸钙的三种主要方法采用5,6。第一种方法,我们将称为溶液方法,是基于混合可溶性盐的钙(例如,CaCl 2)与碳酸盐的可溶性盐(如碳酸钠)。混合过程可以通过多种方式进行:在反应器内,有三个细胞,由多孔膜7分离。在这里,每个外层细胞都含有可溶性盐,而中心细胞包含一种溶液,其添加剂需要测试。当钙和碳酸盐的浓度超过其溶解度产物时,钙和碳酸盐从外部扩散到中细胞,导致低溶性碳酸钙沉淀,Ksp = [Ca2]CO32-*另一种混合方法是双喷射程序8。在这种方法中,每个可溶性盐从单独的注射器注射到含有添加剂的搅拌溶液中,其中碳酸钙沉淀。在这里,注射,因此混合速率得到了很好的控制,与以前的混合由扩散控制的方法相反。
第二个用于结晶CaCO3的方法是北野方法9。此方法基于碳酸盐/碳酸氢平衡 (2HCO3- (aq) + Ca 2+(aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO3 (s) + CO 2(g) + H2O (l)。在这里,CO2以固体形式冒泡成含有 CaCO3的溶液,将平衡向左移动,从而溶解碳酸钙。未溶解的碳酸钙被过滤,所需添加剂被添加到富含碳酸氢酸盐的溶液中。然后允许CO2蒸发,从而将反应向右移动,在添加剂的存在下形成碳酸钙。
第三种碳酸钙结晶方法,我们将在这里描述,是蒸汽扩散法10。在此设置中,溶解在氯化钙溶液中的有机添加剂以粉末形式放置在靠近碳酸铵的封闭室中。当碳酸铵粉末分解成二氧化碳和氨时,它们扩散到含有钙离子的溶液中(例如CaCl2),碳酸钙沉淀(见图1为图)。 碳酸钙晶体可以通过缓慢降水或快速沉淀生长。对于缓慢沉淀,将含有CaCl2溶液中的添加剂的溶液放置在碳酸铵粉末旁边的干燥器中。在协议中描述的长度的快速沉淀中,添加剂溶液和碳酸铵都放在一个多孔板中。慢降水方法会产生更少的成核中心和更大的晶体,而快速沉淀将导致更多的成核中心和更小的晶体。
上述方法的技术复杂性、控制水平和降水过程速率各不相同。混合方法需要双射流和三芯系统的特殊设置 6。在混合方法中,其他可溶性计数器离子(例如,Na +、Cl-)6的存在是不可避免的,而在 Kitano 方法中,钙和(碳酸)碳酸盐是溶液中唯一的离子,并且不涉及附加离子的存在计数器离子(例如,Na=, Cl-)。此外,混合方法需要相对较大的体积,因此不适合使用昂贵的生物聚合物。双喷头的优点是可以控制溶液注入速率,与其他方法相比,它是一个快速的过程。
Kitano 方法和蒸汽扩散法的优点是碳酸钙的形成通过 CO2扩散成/出 CaCl2溶液,从而可以探测较慢的成核和沉淀过程11,12.此外,通过CO2扩散形成的碳酸钙可能类似于体内13、14、15的钙化过程。在这种方法中,形成定义良好和分离的晶体16。最后,可以测试单个或多个生物聚合物对碳酸钙形成的影响。这使得系统研究一系列添加剂浓度对碳酸钙形成的影响,以及生物聚合物混合物的研究 - 所有这些都以受控方式进行。该方法适用于大量浓度和大量添加剂。使用的最低体积约为50μL,因此,当可用生物聚合物数量有限时,这种方法是有利的。最大体积取决于更大的孔板的可访问性,或将包含 CaCl2的板或烧杯插入的干燥器。下面描述的方法已经优化,在96孔板中工作,生物聚合物被选为蛋白质TapA17。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

生物矿化是在有机分子存在的情况下形成矿物质,通常与生物体的功能和/或结构作用有关。这是一个复杂的过程,因此,需要一个简单的体外系统来了解分离分子对生物矿化过程的影响。在许多情况下,生物矿化是由细胞外基质中的生物聚合物引导的。为了评价分离生物聚合物在体外对方解石的形态和结构的影响,我们采用蒸汽扩散法对碳酸钙、扫描电子显微镜和微拉曼进行表征,和紫外线可见光(UV/Vis)的吸收度,用于测量晶体中生物聚合物的数量。在这种方法中,我们将溶解在氯化钙溶液中的分离生物聚合物暴露于来自碳酸固体铵分解的气态氨和二氧化碳中。在达到碳酸钙溶解度产物的条件下,形成碳酸钙沉淀物和晶体。碳酸钙具有不同的多态性,其热力学稳定性不同:非晶碳碳酸钙、大石、阿拉贡石和方解石。在没有生物聚合物的情况下,在清洁条件下,碳酸钙主要以方解石的形式存在,这是碳酸钙最热力学稳定多态的。该方法考察了生物聚合物添加剂对碳酸钙晶体形态和结构的影响。在这里,我们通过研究细胞外细菌蛋白TapA,来演示碳酸钙晶体的形成。具体来说,我们专注于实验设置和表征方法,如光学和电子显微镜以及拉曼光谱学。

实验设置的示意图如图1所示。简单地说,利用扩散法在96孔板中形成碳酸钙晶体,并测试生物聚合物对碳酸钙晶体形态和结构的影响。在这些实验中,碳酸铵被分解成氨和CO2,扩散成碳酸钙溶液,导致碳酸钙晶体的形成(图1和图2)。
通过比较使用(控制)添加剂和无(控制)的碳酸钙晶体,评估生物聚合物的效果。?...

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Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

生物聚合物添加剂中碳酸钙的形成

我们描述了在生物聚合物存在的情况下形成的碳酸钙晶体的沉淀和表征方案。

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

我们的协议描述了一个简单的体外系统，用于研究分离分子对碳酸钙的形态和结构的影响。在生物分子 I 测试价格昂贵或数量少的情况下，以及需要缓慢的碳酸钙沉淀的情况下，这种技术是有利的。此外，它允许在相同的条件下同时探测多个降水实验。首先，准备控制实验。使用三蒸馏水和乙醇清洁玻璃碎片和玻璃器皿。使用钻石笔切割玻璃显微镜幻灯片的碎片，以便它们适合 96 井板的井。将玻璃杯放在烧杯中，加三蒸馏水，使水覆盖玻璃滑梯。在沐浴声波器中声波 10 分钟。把水去。加入乙醇覆盖玻璃滑梯，并在沐浴声波器中再次声波10分钟。然后，用氮气流干燥滑梯和玻璃器皿，并在空气等离子清洁剂中放置 10 分钟，功率为 130 瓦。在烟气罩中，用碳酸铵粉末填充96孔板角的油井，并使用铝箔密封板。用石蜡膜盖住铝箔。使用氮气清洁任何残留的碳酸铵。将先前切割和清洁的玻璃碎片放入离中心最近的五个不同的孔中。每一个带有玻璃片的玻璃填充 100 微升氯化钙溶液，用三蒸馏水制成，梯度增加 10、20、30、40 和 50 毫摩尔。接下来，用针头刺穿每个含有碳酸铵的井盖三次。将盖子放回去，用石蜡薄膜密封边界，并在孵化器中保持18摄氏度20小时。在孵育过程中，碳酸铵分解成氨和二氧化碳，扩散成氯化钙溶液，形成碳酸钙晶体。孵育后，小心地打开烟罩内的盖子，并使用循环去除水空气界面上形成的晶体。使用钳子将玻璃碎片转移到装有双蒸馏水的烧杯中，进行短浸。然后，从烧杯中取出样品，并使用双面胶带将玻璃片固定到培养皿的底部。用纸巾擦拭接触滑梯边框的干水。盖住培养皿，并放在干燥器中 24 小时。使用直立光学显微镜观察玻璃片上形成的晶体，放大倍数为 10 到 40 倍。观察到的菱形晶体很可能是钙化物。如果除了菱形晶体外，溶液中还含有最有可能的圆石球形晶体，请重复结晶协议，确保正确执行清洁步骤。此外，确保除专用井以外的板区没有碳酸铵。氯化钙的最佳浓度是根据富含光滑面的钙化物晶体的样品确定的，没有瓦塔石晶体。首先，清洁玻璃滑梯和玻璃器皿，如前所述。在烟气罩中，将碳酸铵粉末放在 96 井板的角落。在每个发生降水的井中，放置一块被切割和清洁的玻璃片。准备控制井。进入两口控制井，移液器90微升25毫摩尔三酯缓冲液在pH8，辅以100毫摩尔氯化钠。然后加入10微升0.5摩尔氯化钙库存溶液。然后，在pH8下将添加剂蛋白TapA的浓度调整为10微摩尔TapA、100毫摩尔氯化钠和25毫摩尔三酯缓冲液。通过添加 90 微升添加剂溶液来准备含添加剂井。在含有含浓度的孔中加入10微升0.5摩尔氯化钙库存溶液，以达到先前确定的50毫摩尔氯化钙的最佳浓度。在含有碳酸铵的井盖上用孔准备板，并像以前一样在 18 摄氏度下孵育。孵育后，像之前一样在培养皿中准备玻璃片，将盘子放在干燥器中24小时。要量化碳酸钙沉淀物中添加剂的质量百分比，首先验证所用添加剂的消光系数。然后，使用微平衡来称量晶体形成的玻璃碎片。之后，用1.2毫升0.1摩尔醋酸溶液将玻璃的晶体刮入eppe管中。漩涡短暂，然后将管子放入声波器中，使样品声波化，直到晶体消失。样品在室温下储存24小时。刮掉晶体后，称量玻璃滑梯。测量蛋白质添加剂的 1.2 毫升声波溶液的紫外线吸光度 A。使用啤酒-兰伯特方程计算其浓度 c。L 是 cuvette 内的光路。要计算晶体中添加剂的质量，请使用等式，c 倍 v 等于 m，如果浓度以每毫升毫克为单位。如果浓度以摩尔/升为单位，则计算应用 c 倍 v 等于 n 的摩尔。然后使用分子量计算添加剂的质量。计算晶体中添加剂的重量百分比。M 是添加剂的质量，增量 m s 是从玻璃片上刮下来的碳酸钙晶体的质量。SEM 图像显示了具有平滑方方的合适控件与由步骤组成的面的方解石晶体之间的比较。球形晶体是瓦多石。成功且不成功的对照实验产生了拉曼光谱，分别显示了钙化物和瓦特罗石的典型光谱。拉曼移位在1080厘米左右的分裂是瓦石最明显的特征。碳酸钙的晶体在Tata的存在下形成，与控制晶体不同。形成了一个由多个钙化物微晶组成的复杂的球面碳酸钙总成。在Tata存在的情况下形成的晶体的拉曼光谱与方解石光谱相似。TapA 的吸水光谱和不含添加剂的控制在酸中晶体溶解后进行测量。TapA 的质量百分比被确定为 1.8 正负 0.2% 关键，在测试添加剂对碳酸钙形成的影响之前，必须遵循清洁步骤，并确保达到控制标准。此外，从井中去除粉末状的碳酸铵含量为重要。碳酸铵分解成氨和二氧化碳。如果吸入氨是有毒的，因此碳酸铵只应在烟罩内处理。为了评估晶体的内部形态和结构，您可以使用聚焦离子束对其进行剖分，用透射电子显微镜对部分进行图像，并测量各部分沿线特定位置的电子衍射模式。该技术以前曾用于研究各种分子对碳酸钙的形态和结构的影响。我们详细阐述了这种生物聚合物的方法，这种聚合物是由生物膜中的细菌细胞产生的。这将是有趣的进行额外的研究与不同的细菌菌株产生的其他生物聚合物。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

保利的微波辅助功能化（乙二醇）和On-树脂链聚合反应，并形成水凝胶的肽使用

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

科研

化学

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

生物分子有序结构由短肽的自组装形成

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

放射性标记和磷酸肌醇的细胞水平的定量高效液相色谱耦合流动闪烁

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

使用酶法，化学（甲基化）和物理（质谱，核磁共振）技术，植物墙Heteroxylans测序

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

蛋白质生物缀合物的合成<em&gt;通过</em&gt;半胱氨酸马来酰亚胺化学

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

上成膜钙钛矿型混合制造方法，电子结构和太阳能电池性能的影响

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

钌线粒体钙吸收抑制剂的合成与评价

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

局部钙离子梯度对大泡囊膜重塑的响应

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

由 F− 310 Nm 支队所示的阴离子光电子成像

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

结合金 (III.) 对牛血清白蛋白不同构象的 Luminophore 形成

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...