Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan eRez og Dr. Yael politi for frugtbare diskussioner. Denne forskning er blevet støttet af den israelske videnskabs fond (ISF), Grant 1150/14.

1. krystallisering af calciumcarbonat
<ol><li>Forberedelse og optimering af kontrol
	<ol><li>Forbered rene glas stykker. Brug den samme rengøringsprocedure til at rengøre glasvarer.<ol>
<li>Brug en diamant pen til at klippestykker af en glasmikroskop slide, så de passer i en brønd af en 96-brønd plade. Bemærk: 5 mm x 5 mm stykker skal i høj grad passe.</li>
			<li>Placer glas stykkerne i et bæger med tredobbelt destilleret vand (TDW), så vandet dækker glas gliderne og soniker i et bad soni...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).</li><li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).</li><li>Page, M. G., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion:+Application+in+Mesocrystal+Assembly.">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth &amp; Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li><li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate.">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li><li>Sedl&#225;k, M., Antonietti, M., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals.">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li><li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+aragonite+synthesis.">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li><li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asprich+mollusk+shell+protein:+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization.">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li><li>Gehrke, N., C&#246;lfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment.">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth &amp; Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li><li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3.">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li><li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Calcite+(Calcium+Carbonate)+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon.">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527 (1973).</li><li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon,+Oncorhynchus+kisutch.">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure.">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li><li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications.">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li><li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mollusc+larval+shell+formation:+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite.">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li><li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3/chitin-whisker+hybrids:+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension.">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583 (2010).</li><li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies.">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li></ol>

Den metode, der er beskrevet her, har til formål at danne calciumkarbonat krystaller i tilstedeværelse af organiske tilsætningsstoffer og evaluere effekten af organiske Biopolymerer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller in vitro. Metoden er baseret på sammenligningen af de krystaller, der dannes i tilstedeværelsen af de organiske tilsætningsstoffer, til de calcit krystaller, der dannes i kontrol forsøget. Vi har vist, hvordan man bruger diffusions metoden til dannelse af calciumkarbonat kryst...

Biomineralisering er dannelsen af mineraler i tilstedeværelsen af organiske molekyler, der ofte er forbundet med funktionelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Biomineralisering kan være intracellulær, som i dannelsen af magnetit inde i magnetotaktiske bakterier1, eller ekstracellulære, som i dannelsen af calciumcarbonat i søpindsvin pigge2, af hydroxyapatit, der er relateret til kollagen i knogler3 og emalje, der er forbundet med amelogenin i tænder4. Biomineralisering er en kompleks proces, der afhænger af mange parametre i den levende organisme. For at forenkle det undersøgende system er det derfor nødvendigt at evaluere virkningen af særskilte komponenter på processen. I mange tilfælde induceres Biomineralisering af tilstedeværelsen af ekstracellulære biopolymere. Formålet med den her fremlagte metode er følgende: (1) at danne calciumkarbonat krystaller i tilstedeværelse af isolerede biopolymere in vitro, ved hjælp af en damp diffusions metode. (2) at undersøge Biopolymerer virkning på morfologien og strukturen af calciumcarbonat.
Der anvendes tre hovedmetoder til frem fældelse af calciumcarbonat in vitro ved tilstedeværelse af organiske tilsætningsstoffer på5,6. Den første metode, som vi vil referere til som løsningsmetode, er baseret på blanding af et opløseligt salt af calcium (f. eks. CaCl2) med et opløseligt salt af karbonat (f. eks. natriumkarbonat). Blande processen kan udføres på flere måder: inde i en reaktor med tre celler, der er adskilt af porøse membraner7. Her indeholder hver af de ydre celler et opløseligt salt, og den centrale celle indeholder en opløsning med det tilsætningsstof, der skal testes. Calcium og karbonat diffus fra den ydre til den midterste celle, hvilket resulterer i udfældningen af det mindre opløselige calciumcarbonat, når koncentrationerne af calcium og carbonat overstiger deres opløselighed, KSP = [ca2 +] [co3 2-]. En ekstra blandingsmetode er dobbelt jet-proceduren8. Ved denne metode injiceres hvert opløseligt salt fra en separat sprøjte til en omrørt opløsning, der indeholder tilsætningsstoffet, hvor calciumcarbonat udfældes. Her er injektionen og derfor blandings hastigheden velkontrolleret, i modsætning til den tidligere metode, hvor blandingen styres ved diffusion.
Den anden metode, der bruges til at krystallisere CaCO3 , er Kitano-metoden9. Denne metode er baseret på ligevægt mellem karbonat/hydrogencarbonat (2hco3- (aq) + ca2 +(aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO3 (s) + Co2 (g) + H2O (l)). Her er CO2 bukkede i en opløsning, der indeholder CaCO3 i en fast form, flytte balancen til venstre og derfor opløse calciumcarbonat. Det uopløste calciumcarbonat filtreres, og de ønskede additiver tilsættes til den bicarbonat-rige opløsning. CO2 får derefter lov til at fordampe og derved flytte reaktionen til højre og danne calciumcarbonat ved tilstedeværelse af tilsætningsstofferne.
Den tredje metode til calciumcarbonat krystallisering, som vi vil beskrive her, er damp diffusion metode10. I denne opsætning anbringes det organiske tilsætningsstof, opløst i en opløsning af calciumchlorid, i et lukket kammer nær ammonium karbonat i pulverform. Når ammonium karbonat pulver nedbrydes til kuldioxid og ammoniak, diffus de i opløsningen indeholdende calciumioner (fx CaCl2), og calciumcarbonat er fældet (Se figur 1 for illustration). Calciumkarbonat krystaller kan vokse ved langsom nedbør eller ved hurtig nedbør. Til den langsomme nedbør anbringes en opløsning, der indeholder tilsætningsstoffet i CaCl2 , i en ekssikkator ved siden af ammonium karbonat pulveret. I den hurtige nedbør, der er beskrevet udførligt i protokollen, anbringes både additiv opløsningen og ammonium karbonat tættere sammen i en multi-brønd plade. Den langsomme nedbør metode vil producere færre nukleation Centre og større krystaller, og den hurtige nedbør vil resultere i flere kimdannelse Centre og mindre krystaller.
De metoder, der er beskrevet ovenfor, adskiller sig i deres tekniske kompleksitet, i kontrolniveauet og i satsen for udfældnings processen. Blandings metoden kræver en speciel opsætning6 for både dobbelt jet og tre-cellet system. I blandings metoden er tilstedeværelsen af andre opløselige modoner (f. eks. na+, CL-)6 uundgåelig, hvorimod i Kitano-metoden er calcium og (BI) carbonat de eneste ioner i opløsning, og det indebærer ikke tilstedeværelsen af yderligere (f. eks. na+, CL-). Desuden kræver blandings metoden relativt store volumener, og derfor egner den sig ikke til at arbejde med dyre biopolymere. Fordelen ved den dobbelte jet er, at det er muligt at kontrollere satsen for opløsning injektion, og at det er en hurtig proces i forhold til andre metoder.
Fordelen ved Kitano-metoden og damp diffusions metoden er, at dannelsen af calciumcarbonat styres ved diffusion af CO2 til/fra en CaCl2 -opløsning, hvilket gør det muligt at sonde langsommere nukleation og nedfældnings processer 11 , 12. Desuden kan dannelse af calciumcarbonat ved diffusion af co2 ligne forkalknings processer i vivo13,14,15. I denne metode, veldefinerede og adskilte krystaller dannes16. Endelig kan virkningen af enkelt eller flere biopolymere på dannelsen af calciumcarbonat testes. Dette muliggør en systematisk undersøgelse af virkningen af en række additiv koncentrationer på dannelse af calciumcarbonat samt en undersøgelse af blandinger af biopolymere-alle udført på en kontrolleret måde. Denne metode er velegnet til brug med et stort udvalg af koncentrationer og volumener af tilsætningsstoffer. Den minimale mængde, der anvendes, er ca. 50 μL, og derfor er denne metode fordelagtig, når der er en begrænset mængde af de tilgængelige biopolymere. Den maksimale volumen afhænger af tilgængeligheden af en større brønd plade eller af den ekssikkator, hvori pladen eller bægerglasset med CaCl2 skal indsættes. Metoden beskrevet nedenfor er blevet optimeret til at arbejde i en 96-brønd plade med en biopolymer valgt til at være proteinet TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

Biomineralisering er dannelsen af mineraler i tilstedeværelsen af organiske molekyler, der ofte er forbundet med funktionelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Det er en kompleks proces, og derfor er et enkelt, in vitro-system påkrævet for at forstå effekten af isolerede molekyler på biomineraliserings processen. I mange tilfælde er Biomineralisering instrueret af biopolymere i den ekstracellulære matrix. For at evaluere effekten af isolerede Biopolymerer på morfologien og strukturen af calcit in vitro, har vi brugt damp diffusions metoden til udfældning af calciumcarbonat, scanning elektronmikroskopi og Micro Raman til karakterisering, og ultraviolet-synlig (UV/Vis) absorbans til måling af mængden af en biopolymer i krystallerne. I denne metode udsætter vi de isolerede Biopolymerer, opløst i en calciumchloridopløsning, for gasformigt ammoniak og kuldioxid, der stammer fra nedbrydningen af fast ammonium karbonat. Under de betingelser, hvor opløselighed produktet af calciumcarbonat er nået, dannes calciumcarbonat bundfald og krystaller. Calciumcarbonat har forskellige polymorffer, der adskiller sig i deres termodynamiske stabilitet: amorfe calciumcarbonat, vaterite, aragonite, og calcite. I fravær af biopolymere, under rene betingelser, calciumcarbonat er for det meste til stede i calcit form, som er den mest termodynamisk stabil polymorph af calciumcarbonat. Denne metode undersøger effekten af biopolykemeje tilsætningsstoffer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller. Her viser vi protokollen gennem studiet af et ekstracellulært bakterielt protein, TapA, på dannelsen af calciumkarbonat krystaller. Specifikt fokuserer vi på den eksperimentelle opsætning, og karakterisering metoder, såsom optisk og elektronmikroskopi samt Raman spektroskopi.

En skematisk af den eksperimentelle opsætning er vist i figur 1. Kort sagt anvendes diffusions metoden for at danne calciumkarbonat krystaller i 96-brønd plader og teste effekten af Biopolymerer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller. I disse forsøg nedbrydes ammoniumcarbonat til ammoniak og CO2, som diffus til calciumkarbonat opløsninger, hvilket resulterer i dannelsen af calciumkarbonat krystaller (figur 1 og <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Calcium karbonat dannelse i nærvær af Biopolykemeje tilsætningsstoffer

Vi beskriver en protokol til udfældning og karakterisering af calciumkarbonat krystaller, der dannes i nærværelse af biopolymere.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Vores protokol beskriver et simpelt in vitro-system, for at undersøge effekten af isolerede molekyler på morfologi og struktur af calciumcarbonat. Denne teknik er fordelagtig i tilfælde, hvor biomolekyler jeg test er dyre, eller fås i små mængder, samt når langsom calciumcarbonat nedbør er påkrævet. Desuden, det gør det muligt at sonde flere nedbør eksperimenter under de samme betingelser på én gang.Først skal du forberede kontroleksperimentet. Brug tredobbelt destilleret vand og ethanol til at rense glasstykker og glasvarer. Brug en diamantpen til at skære stykker af et glasmikroskop dias, så de passer ind i en brønd af en 96-brønd plade.Placer glasstederne i et bægerglas med tredobbelt destilleret vand, så vandet dækker glasrutsjebanerne. Sonikere i et bad sonicator i 10 minutter. Dekantere vandet.Tilsæt ethanol til at dække glasdias, og sonikere igen i et bad sonicator i 10 minutter. Tør derefter objektglassene og glasvarerne med en strøm af nitrogengas, og læg dem i et luftplasmarenser i 10 minutter ved 130 watt. I en røghætte fyldes brøndene i hjørnerne af en 96-brøndplade med ammoniumcarbonatpulver og forsegler pladen med aluminiumsfolie.Dæk folien med paraffinfilm. Rengør eventuelt resterende ammoniumcarbonat ved hjælp af nitrogengas. Placer de tidligere skåret og rengøres glasstykker i fem forskellige brønde tættest på midten.Fyld hvert godt forsynet med et glasstykke med 100 mikroklienter calciumchloridopløsning, der er fremstillet med tredobbelt destilleret vand ved en stigende gradient på 10, 20, 30, 40 og 50 millimolarkoncentrationer. Dernæst punktere dækslet af hver af de brønde, der indeholder ammoniumcarbonat tre gange med en nål. Sæt låget tilbage, forsegle grænserne med paraffin film, og holde det på 18 grader Celsius i en kuvøse i 20 timer.Under inkubationen nedbrydes ammoniumcarbonat til ammoniak og kuldioxid, som spredes til calciumchloridopløsninger, hvilket resulterer i formationens calciumcarbonatkrystaller. Efter inkubationen skal du åbne låget forsigtigt inde i en røghætte og bruge en løkke til at fjerne de krystaller, der dannes ved vand-luft-grænsefladen. Brug en pincet til at overføre glasstykkerne til et bægerglas, der indeholder dobbelt destilleret vand til en kort dukkert.Fjern derefter prøverne fra bægeret, og brug dobbeltsidet tape til at fastgøre glasstykkerne på bunden af petriskålen. Tør for meget vand, der rører ved kanterne af diaset, med vævsservietter. Dæk petriskålen, og læg den i en ekssiccator i 24 timer.Overhold de krystaller, der dannes på glasstykkerne, med et opretstående optisk mikroskop ved 10 til 40 gange forstørrelse. De observerede rhombohedralkrystaller er mest sandsynligt calcite. Hvis der ud over de rhombohedralkrystaller, opløsningen indeholder sfæriske krystaller, som er mest sandsynligt vaterit, gentag krystallisering protokol, og sørg for, at rengøringen trin udføres korrekt.Sørg desuden for, at der ikke er ammoniumcarbonat i andre områder af pladen end de dedikerede brønde. Den optimale koncentration for calciumchlorid bestemmes i henhold til prøven rig med glatte facetterede calcitkrystaller uden vateritkrystaller. Til at begynde, rengør glasdias og glasvarer som gjort tidligere.I en røghætte, sted ammoniumcarbonat pulver i hjørnerne af en 96-brønd plade. I hver brønd, hvor nedbør vil forekomme, skal du placere et glas stykke, der blev skåret og rengjort. Forbered kontrol brøndene.I to kontrolblyde pipetteres 90 mikroliter af 25 millimolar Tris buffer ved pH 8, suppleret med 100 millimolar natriumchlorid. Derefter tilsættes 10 mikroliter af 0,5 molar calciumchlorid lageropløsning. Juster derefter koncentrationen af additivprotein TapA til 10 mikromolar TapA, 100 millimolar natriumchlorid og 25 millimolar Tris buffer ved pH 8.Tilbered tilsætningsstoffet, der indeholder brønde, ved at tilsætte 90 mikroliter af tilsætningsstoffet. Der tilsættes 10 mikroliter 0,5 molar calciumchloridbestandopløsning til tilsætningsstoffet, der indeholder brønde, for at opnå den optimale koncentration ved 50 millimolar calciumchlorid, der tidligere er bestemt. Forbered pladen med huller på dækslet over brønde, der indeholder ammoniumcarbonat, og inkubere ved 18 grader Celsius som tidligere gjort.Efter inkubation, forberede glasstykker i en petriskål som gjort før, og læg skålen i en ekssiccator i 24 timer. For at kvantificere masseprocenten af tilsætningsstofferne i calciumcarbonatudfælderne skal det anvendte tilsætningsstof først kontrolleres. Brug derefter en mikrobalance til at veje glasstykkerne, hvor krystallerne dannedes.Derefter skrabes krystallerne fra glasset i et eppe rør med 1,2 milliliter 0,1 molar eddikesyreopløsning. Vortex kort, og derefter placere røret i en sonicator at sonikere prøven, indtil krystallerne forsvinder. Prøven opbevares ved stuetemperatur i 24 timer.Afvej glasrutsjebanen efter skrabning af krystallerne. UV-absorbans A af den 1,2 milliliter sonikerede opløsning måles ved 280 nanometer til proteintilsætningsstoffet. Brug Øl-Lambert ligningen til at beregne dens koncentration c.L er den optiske vej inde i cuvette. For at beregne massen af tilsætningsstoffer i krystallen, skal du bruge ligningen, c gange v lig m, hvis koncentrationen er i milligram per milliliter. Hvis koncentrationen er i modermærker per liter, derefter beregne modermærker anvende c gange v lig med n.Brug derefter molekylvægten til at beregne massen af tilsætningsstofferne. Vægtprocenten af tilsætningsstofferne i krystallerne beregnes. M er massen af tilsætningsstoffer, og delta m s, er massen af calciumcarbonat krystaller, der blev skrabet af glasset stykke.SEM billeder viser sammenligningen mellem en ordentlig kontrol med glatte calcite ansigter, og calcite krystaller med ansigter, der består af trin. De sfæriske krystaller er vaterit. De vellykkede og mislykkede kontrolforsøg resulterede i Raman spektroskopi, der viser den typiske spektre af calcite og vaterite henholdsvis.Opdelingen af Raman skift på omkring 1080 per centimeter er den mest indlysende egenskab ved vaterite. Krystallerne af calciumcarbonat dannet i overværelse af TapA, adskiller sig fra kontrolkrystallerne. En kompleks sfærisk calciumcarbonat samling, der består af flere calcit mikrokrystaller blev dannet.Raman spektret af krystaller dannet i overværelse af TapA, svarer til spektret af calcite. De absorberende spektrum af TapA, og kontrol uden tilsætningsstoffet, blev målt efter opløsning af krystaller i syre. Masseprocenten af TapA blev bestemt til at være 1,8 plus eller minus 0,2%Det er vigtigt at følge rengøringstrinnene omhyggeligt og for at sikre, at kontrolstandarderne er opfyldt, før de tester tilsætningsstoffernes effekt på dannelsen af calciumcarbonat.Desuden er det vigtigt at fjerne overskydende ammoniumcarbonat i pulverform fra brøndene. Ammoniumcarbonat nedbrydes til ammoniak og kuldioxid. Ammoniak er giftigt ved indånding, og derfor bør ammoniumcarbonat kun håndteres i en røghætte.For at evaluere krystallernes interne morfologi og struktur kan du dele dem ved hjælp af en fokuseret ionstråle, afbilde sektionerne med et transmissionselekniskmikroskop og måle elektrondiffraktionens mønstre fra bestemte steder langs sektionerne. Denne teknik er tidligere blevet brugt til at undersøge virkningen af forskellige molekyler på morfologi og struktur af calciumcarbonat. Vi har udviklet denne metode til biopolymerer, der produceres af bakterieceller i biofilm.Det vil være interessant at udføre yderligere undersøgelser med andre biopolymerer produceret af forskellige bakteriestammer.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisteret Funktionalisering af poly (ethylenglycol) og On-harpiks peptider til i Chain Polymeriseringer og Hydrogel Dannelse

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioaktiv mærkning og kvantificering af cellulære niveauer af phosphoinositider af højtryksvæskekromatografi-koblede Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekventering af Plant Wall Heteroxylans Brug Enzymatisk, Chemical (Methylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

Indflydelse af Hybrid perovskit Fabrication Metoder på film Formation, Elektronisk Struktur og Solar Cell ydeevne

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Sammenfatning og evaluering af en Ruthenium-baserede mitokondrie Calcium Uptake hæmmer

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membran remodellering af gigantiske vesikler i svar til lokaliserede Calcium Ion forløb

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron billeddannelse af anioner illustreret ved 310 Nm udstationering af F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophore dannelse i forskellige konformationer af bovint serumalbumin ved Binding af Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...