Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

De auteurs willen Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan Erez en Dr. Yael Politi bedanken voor de vruchtbare besprekingen. Dit onderzoek werd gesteund door de Israëlische Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.

1. kristallisatie van calcium carbonaat
<ol><li>Controle voorbereiding en optimalisatie
	<ol><li>Maak schone glazen stukken. Gebruik dezelfde reinigingsprocedure om het glaswerk te reinigen.<ol>
<li>Gebruik een diamant pen om stukjes van een glazen Microscoop Slide te knippen zodat ze in een put van een 96-well plaat passen. Opmerking: 5 mm x 5 mm stukken moeten grotendeels passen.</li>
			<li>Plaats de glazen stukken in een bekerglas met drievoudig gedestilleerd water (TDW) zodat water de glaasjes ...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).</li><li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).</li><li>Page, M. G., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion:+Application+in+Mesocrystal+Assembly.">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth &amp; Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li><li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate.">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li><li>Sedl&#225;k, M., Antonietti, M., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals.">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li><li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+aragonite+synthesis.">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li><li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asprich+mollusk+shell+protein:+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization.">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li><li>Gehrke, N., C&#246;lfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment.">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth &amp; Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li><li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3.">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li><li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Calcite+(Calcium+Carbonate)+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon.">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527 (1973).</li><li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon,+Oncorhynchus+kisutch.">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure.">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li><li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications.">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li><li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mollusc+larval+shell+formation:+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite.">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li><li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3/chitin-whisker+hybrids:+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension.">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583 (2010).</li><li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies.">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li></ol>

De hier beschreven methode is gericht op het vormen van calciumcarbonaat kristallen in de aanwezigheid van organische additieven en het evalueren van het effect van organische biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen in vitro. De methode is gebaseerd op de vergelijking van de kristallen gevormd in de aanwezigheid van de organische additieven aan de calciet kristallen gevormd in de controle-experiment. We hebben laten zien hoe we de diffusie methode gebruiken om de calciumcarbonaat krista...

Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Biomineralisatie kan intracellulaire, zoals in de vorming van magnetiet binnen magnetotactische bacteriën1, of extracellulaire, zoals in de vorming van calciumcarbonaat in zee--egels spikes2, van hydroxyapatiet die is gerelateerd met collageen in botten3 en glazuur die wordt geassocieerd met amelogenin in tanden4. Biomineralisatie is een complex proces dat afhangt van vele parameters in het levende organisme. Daarom is het, om het onderzochte systeem te vereenvoudigen, noodzakelijk om het effect van afzonderlijke componenten op het proces te evalueren. In veel gevallen wordt biomineralisatie geïnduceerd door de aanwezigheid van extracellulaire biopolymeren. Het doel van de hier gepresenteerde methode is als volgt: (1) het vormen van calciumcarbonaat kristallen in aanwezigheid van geïsoleerde biopolymeren in vitro, met behulp van een damp diffusie methode. (2) om het effect van de biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen.
In de aanwezigheid van organische additieven worden in vitro drie methoden gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat in de nabijheid van5,6. De eerste methode, die wij als oplossingsmethode noemen, is gebaseerd op het mengen van een oplosbaar zout calcium (bv. CaCl2) met een oplosbaar zout van carbonaat (bv. natriumcarbonaat). Het mengproces kan op verschillende manieren worden uitgevoerd: binnen een reactor met drie cellen die worden gescheiden door poreuze membranen7. Hier bevat elk van de buitenste cellen een oplosbaar zout en de centrale cel bevat een oplossing met het te testen toevoegingsmiddel. Calcium en carbonaat diffuus van de buitenste naar de middelste cel, resulterend in het neerslaan van het minder oplosbare calciumcarbonaat wanneer de concentraties van calcium en carbonaat hun oplosbaarheids product overschrijden, KSP = [CA2 +] [co3 2-]. Een extra Meng methode is de double-Jet procedure8. Bij deze methode wordt elk oplosbaar zout van een afzonderlijke injectiespuit geïnjecteerd in een geroerd oplossing die het toevoegingsmiddel bevat, waarbij calciumcarbonaat neervalt. Hier, de injectie en dus de mengsnelheid is goed gecontroleerd, in tegenstelling tot de vorige methode waarbij menging wordt geregeld door diffusie.
De tweede methode die gebruikt wordt om CaCO3 te kristalliseren is de Kitano methode9. Deze methode is gebaseerd op het carbonaat/waterstof carbonaat-evenwicht (2hco3- (AQ) + CA2 +(AQ) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Hier wordt CO2 in een vaste vorm in een oplossing met CaCO3 gebubbeld, waardoor het evenwicht naar links verschuift en het calciumcarbonaat daardoor oplost. Het onopgeloste calciumcarbonaat wordt gefilterd en de gewenste additieven worden toegevoegd aan de bicarbonaat-rijke oplossing. CO2 mag dan verdampen, waardoor de reactie naar rechts verschuift en calciumcarbonaat ontstaat in aanwezigheid van de additieven.
De derde methode van kristallisatie van calciumcarbonaat, die we hier zullen beschrijven, is de damp diffusiemethode10. In deze opstelling wordt het organische toevoegingsmiddel, opgelost in een oplossing van calciumchloride, in een gesloten kamer in de buurt van ammoniumcarbonaat in een poedervorm geplaatst. Wanneer ammoniumcarbonaat poeder in kooldioxide en ammoniak ontbindt, worden ze diffuus in de oplossing die calciumionen bevat (bv. CaCl2), en wordt calciumcarbonaat neergeprecipiteerd (Zie afbeelding 1 voor illustratie). De calciumcarbonaat kristallen kunnen groeien door langzame neerslag of door snelle neerslag. Voor de langzame neerslag wordt een oplossing die het toevoegingsmiddel in CaCl2 -oplossing bevat, in een exsiccator naast het ammoniumcarbonaat-poeder geplaatst. Bij de snelle neerslag, beschreven in de lengte van het Protocol, worden zowel de additieve oplossing als het ammoniumcarbonaat dichter bij elkaar geplaatst in een multi-well plaat. De langzame neerslag methode zal minder nucleatie centra en grotere kristallen produceren, en de snelle neerslag zal resulteren in meer nucleatie centra en kleinere kristallen.
De hierboven beschreven methoden verschillen in hun technische complexiteit, in het niveau van controle en in de snelheid van het neerslag proces. De Meng methode vereist een speciale set-up6 voor zowel de dubbele straal als het driecellige systeem. In de Meng methode is de aanwezigheid van andere oplosbare contra-ionen (bijv. na+, cl-)6 onvermijdelijk, terwijl in de Kitano-methode calcium en (BI) carbonaat de enige ionen in oplossing zijn en de aanwezigheid van extra tegen ionen (bijv. na+, cl-). Bovendien, de Meng methode vereist relatief grote volumes en daarom is het niet geschikt voor het werken met dure biopolymeren. Het voordeel van de dubbele straal is dat het mogelijk is om de snelheid van de oplossing injectie te regelen en dat het een snel proces is in vergelijking met andere methoden.
Het voordeel van de Kitano-methode en de damp diffusiemethode is dat de vorming van calciumcarbonaat wordt geregeld door diffusie van CO2 in/uit een CACL2 -oplossing, waardoor tragere nucleatie-en neerslag processen kunnen worden sonde 11 , 12. Bovendien kan de vorming van calciumcarbonaat door diffusie van co2 lijken op calcificatie processen in vivo13,14,15. In deze methode worden goed gedefinieerde en gescheiden kristallen gevormd16. Ten slotte kan het effect van enkelvoudige of meervoudige biopolymeren op de vorming van calciumcarbonaat worden getest. Dit maakt een systematische studie mogelijk van het effect van een reeks additieve concentraties op de vorming van calciumcarbonaat, evenals een studie van mengsels van biopolymeren-allemaal uitgevoerd op een gecontroleerde manier. Deze methode is geschikt voor gebruik met een groot aantal concentraties en volumes additieven. Het minimale gebruikte volume is ongeveer 50 μL en daarom is deze methode voordelig wanneer er een beperkte hoeveelheid beschikbare biopolymeren is. Het maximale volume is afhankelijk van de toegankelijkheid van een grotere goed plaat, of de exsiccator waarin de plaat of beker die CaCl2 bevat, moet worden ingebracht. De hieronder beschreven methode is geoptimaliseerd voor het werken in een 96-put plaat met een biopolymeer gekozen als de proteïne TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Het is een complex proces en daarom is een eenvoudig, in vitro systeem nodig om het effect van geïsoleerde moleculen op het biomineralisatie proces te begrijpen. In veel gevallen wordt biomineralisatie geregisseerd door biopolymeren in de extracellulaire matrix. Om het effect van geïsoleerde biopolymeren op de morfologie en de structuur van calciet in vitro te evalueren, hebben we de damp diffusiemethode gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat, het scannen van elektronenmicroscopie en micro Raman voor de karakterisering, en ultraviolette-zichtbare (UV/VIS) extinctie voor het meten van de hoeveelheid biopolymeer in de kristallen. Bij deze methode worden de geïsoleerde biopolymeren, opgelost in een calciumchloride oplossing, blootgesteld aan gasvormige ammoniak en koolstofdioxide die afkomstig zijn van de afbraak van massief ammoniumcarbonaat. Onder de omstandigheden waarin het oplosmiddel van calciumcarbonaat wordt bereikt, worden precipiteert calciumcarbonaat en kristallen gevormd. Calciumcarbonaat heeft verschillende polymorfen die verschillen in hun thermodynamische stabiliteit: amorfe calciumcarbonaat, vaterite, aragoniet, en calciet. Bij afwezigheid van biopolymeren, onder schone omstandigheden, is calciumcarbonaat meestal aanwezig in de calciet vorm, wat de meest thermodynamisch stabiele polymorf van calciumcarbonaat is. Deze methode onderzoekt het effect van de biopolymere additieven op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen. Hier demonstreren we het protocol door de studie van een extracellulair bacterieel eiwit, TapA, op de vorming van calciumcarbonaat kristallen. Specifiek richten we ons op de experimentele opstelling, en karakterisatie methoden, zoals optische en elektronenmicroscopie evenals Raman-spectroscopie.

Een schematische weergave van de experimentele opstelling is afgebeeld in Figuur 1. In het kort wordt de diffusie methode gebruikt om calciumcarbonaat kristallen in 96-well Plates te vormen en het effect van biopolymeren op de morfologie en structuur van de calciumcarbonaat kristallen te testen. Bij deze experimenten wordt ammoniumcarbonaat ontleed in ammoniak en CO2, die zich verspreiden in oplossingen van calciumcarbonaat, wat resulteert in de vorming van calciumcarbonaat krista...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

We beschrijven een protocol voor de precipitatie en karakterisering van calciumcarbonaat kristallen die vormen in de aanwezigheid van biopolymeren.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Ons protocol beschrijft een eenvoudig in vitro systeem, om het effect van geïsoleerde moleculen op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen. Deze techniek is voordelig in gevallen waarin de biomoleculen die ik test duur zijn, of beschikbaar in kleine hoeveelheden, evenals wanneer langzame calciumcarbonaat neerslag nodig is. Bovendien maakt het mogelijk om meerdere neerslag-experimenten onder dezelfde omstandigheden tegelijk te onderzoeken.Bereid eerst het controle-experiment voor. Gebruik drievoudig gedestilleerd water en ethanol om glasstukken en glaswerk schoon te maken. Gebruik een diamantpen om stukken van een glazen microscoop dia te snijden, zodat ze passen in een put van een 96-put plaat.Plaats de glazen plaatsen in een beker met drievoudig gedestilleerd water, zodat het water de glazen glijbanen bedekt. Sonicate in een bad sonicator voor 10 minuten. Decanteer het water.Voeg ethanol toe om de glazen platen te bedekken en sonicate opnieuw in een bad sonicator voor 10 minuten. Droog vervolgens de glijbanen en het glaswerk met een stroom stikstofgas en plaats ze 10 minuten lang in een luchtplasmareiniger bij 130 watt. Vul in een rookkap de putten op de hoeken van een 96-putplaat met ammoniumcarbonaatpoeder en verzegel de plaat met aluminiumfolie.Bedek de folie met paraffinefilm. Reinig eventueel restcaracariumcarbonaat met stikstofgas. Plaats de eerder gesneden en gereinigde glazen stukken in vijf verschillende putten het dichtst bij het centrum.Vul elk goed met een glazen stuk met 100 microliter calciumchlorideoplossing bereid met drievoudig gedestilleerd water bij een toenemend gradiënt van 10, 20, 30, 40 en 50 millimolar concentraties. Vervolgens, punctie de cover van elk van de putten met ammonium carbonaat drie keer met een naald. Zet het deksel terug, verzegel de grenzen met paraffinefilm en houd het 20 uur op 18 graden Celsius in een couveuse.Tijdens de incubatie wordt ammoniumcarbonaat afgebroken tot ammoniak en kooldioxide, die zich verspreiden in calciumchlorideoplossingen, wat resulteert in de vorming van calciumcarbonaatkristallen. Na de incubatie opent u het deksel voorzichtig in een rookkap en gebruikt u een lus om de kristallen te verwijderen die bij de waterluchtinterface zijn gevormd. Gebruik een pincet om de glazen stukken over te brengen in een beker met dubbel gedestilleerd water voor een korte duik.Verwijder vervolgens de monsters uit het bekerglas en gebruik dubbelzijdige tape om de glazen stukken op de bodem van de petrischaal te bevestigen. Droog overmatig water dat de randen van de glijbaan raakt, met weefseldoekjes. Bedek de petrischaal en plaats deze 24 uur in een desiccator.Observeer de kristallen gevormd op de glazen stukken met een rechtopstaande optische microscoop op 10 tot 40 keer vergroting. De waargenomen rhombohedral kristallen zijn waarschijnlijk calciet. Als in aanvulling op de rhombohedral kristallen, de oplossing bevat bolvormige kristallen die waarschijnlijk vateriet, herhaal het kristallisatie protocol, ervoor te zorgen dat de reinigingsstap correct wordt uitgevoerd.Zorg er bovendien voor dat er geen ammoniumcarbonaat is in andere gebieden van de plaat dan de speciale putten. De optimale concentratie voor calciumchloride wordt bepaald volgens het monster rijk met gladde gefaceteerde calciet kristallen zonder vateriet kristallen. Om te beginnen, schone glazen platen en glaswerk zoals eerder gedaan.In een rookkap, plaats ammonium carbonaat poeder in de hoeken van een 96-put plaat. In elke put waar neerslag zal optreden, plaats een glazen stuk dat werd gesneden en gereinigd. Bereid de controleputten voor.In twee controleputten, pipet 90 microliters van 25 millimolar Tris buffer bij pH 8, aangevuld met 100 millimolar natriumchloride. Voeg vervolgens 10 microliter van 0,5 molaire calciumchloridevoorraadoplossing toe. Pas vervolgens de concentratie additief eiwit TapA aan op 10 micromolar TapA, 100 millimolar natriumchloride en 25 millimolar Tris-buffer bij pH 8.Bereid het additief met putten door 90 microliters van de additieve oplossing toe te voegen. Voeg 10 microliter calciumchloridebestandsoplossing van 0,5 moler calciumchloride toe aan het eerder vastgestelde additief dat putten bevat om de optimale concentratie bij 50 millimolar calciumchloride te bereiken. Bereid de plaat met gaten op de cover over putten met ammoniumcarbonaat, en uitbroeden op 18 graden Celsius zoals eerder gedaan.Na incubatie, bereid de glazen stukken in een petrischaal zoals eerder gedaan, en plaats de schotel in een desiccator voor 24 uur. Om het massapercentage van de additieven in de calciumcarbonaat neerslaan te kwantificeren, controleert u eerst de uitstervingscoëfficiënt van het gebruikte toevoegingsmiddel. Gebruik vervolgens een microbalans om de glazen stukken te wegen waar de kristallen zich hebben gevormd.Schraap daarna de kristallen van het glas in een eppebuis met 1,2 milliliter 0,1 molaire azijnzuuroplossing. Vortex kort, en plaats de buis in een sonicator om het monster sonicate totdat de kristallen verdwijnen. Bewaar het monster 24 uur op kamertemperatuur.Weeg de glazen glijbaan na het afschrapen van de kristallen. Meet de UV-absorptie A van de 1,2 milliliter gesononiceerde oplossing op 280 nanometer voor het eiwitadditief. Gebruik de Beer-Lambert vergelijking om de concentratie c te berekenen.L is het optische pad in de cuvette. Om de massa van de additieven in het kristal te berekenen, gebruik de vergelijking, c keer v is gelijk aan m, als de concentratie in milligram per milliliter is. Als de concentratie is in moedervlekken per liter, bereken dan de moedervlekken van toepassing c keer v gelijk aan n.Gebruik vervolgens het molecuulgewicht om de massa van de additieven te berekenen. Bereken het gewichtspercentage van de additieven in de kristallen. M is de massa van de additieven, en delta m s, is de massa van de calciumcarbonaat kristallen die werden geschraapt uit het glas stuk.SEM-afbeeldingen tonen de vergelijking tussen een goede controle met gladde calcietvlakken en kalkkristallen met vlakken die uit stappen bestaan. De bolvormige kristallen zijn vateriet. De succesvolle en mislukte controle-experimenten resulteerden in Raman spectroscopie, met de typische spectra van calciet en vateriet respectievelijk.De splitsing van de Raman-ploeg rond 1080 per centimeter is het meest voor de hand liggende kenmerk van vateriet. De kristallen van calciumcarbonaat gevormd in aanwezigheid van TapA, onderscheiden zich van de controlekristallen. Een complexe bolvormige calciumcarbonaat assemblage, samengesteld uit meerdere calciet microkristallen werd gevormd.Het Raman-spectrum van de kristallen gevormd in aanwezigheid van TapA, is vergelijkbaar met het spectrum van calciet. De absorberende spectrums van TapA, en de controle zonder het additief, werden gemeten na ontbinding van de kristallen in zuur. Het massapercentage van TapA werd vastgesteld op 1,8 plus of min 0,2%Het is van cruciaal belang om de reinigingsstappen zorgvuldig te volgen, en om ervoor te zorgen dat de controlenormen worden voldaan voordat het testen van het effect van de additieven op de vorming van calciumcarbonaat.Daarnaast is het belangrijk om een teveel aan ammoniumcarbonaat in poedervorm uit de putten te verwijderen. Ammoniumcarbonaat ontleedt in ammoniak en kooldioxide. Ammoniak is giftig bij inademing, en daarom mag ammoniumcarbonaat alleen in een rookkap worden behandeld.Om de interne morfologie en structuur van de kristallen te evalueren, u ze doorsneden met behulp van een gerichte ionenstraal, de secties met een transmissieelektronmicroscoop in beeld brengen en de patronen van de elektronendiffractie van specifieke locaties langs de secties meten. Deze techniek is eerder gebruikt om het effect van verschillende moleculen op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen. We hebben deze methode uitgewerkt om biopolymeren die worden geproduceerd door bacteriële cellen in biofilms.Het zal interessant zijn om aanvullende studies uit te voeren met andere biopolymeren geproduceerd door verschillende bacteriële stammen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

Invloed van Hybrid Perovskite fabricagemethoden on Film Formation, Electronic Structure en Zonnecel prestaties

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Synthese en evaluatie van een Ruthenium gebaseerde mitochondriale Calcium opname Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron beeldvorming van anionen geïllustreerd door 310 Nm detachement van F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophore formatie in verschillende conformaties van bovien serumalbumine door Binding van Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...