Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
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Les auteurs tient à remercier le professeur Lia Addadi, le professeur Jonathan Erez et le Dr Yael Politi pour leurs discussions fructueuses. Cette recherche a été soutenue par la Fondation israélienne pour la science (ISF), subvention 1150/14.

1. Cristallisation de carbonate de calcium
<ol><li>Préparation et optimisation du contrôle
	<ol><li>Préparer des morceaux de verre propres. Utilisez la même procédure de nettoyage pour nettoyer la verrerie.<ol>
<li>Utilisez un stylo diamant pour couper des morceaux d'une lame de microscope en verre afin qu'ils s'adaptent dans un puits d'une plaque de 96 puits. REMARQUE : Les pièces de 5 mm x 5 mm doivent s'adapter en grande partie.</li>
			<li>Placez les morceaux de verre dans un bécher avec ...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. 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La méthode décrite ici vise à former des cristaux de carbonate de calcium en présence d'additifs organiques et à évaluer l'effet des biopolymères organiques sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium in vitro. La méthode est basée sur la comparaison des cristaux formés en présence des additifs organiques aux cristaux de calcite formés dans l'expérience de contrôle. Nous avons montré comment utiliser la méthode de diffusion pour former les cristaux de carbonate de calcium, comm...

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. La biominéralisation peut être intracellulaire, comme dans la formation de magnétite à l'intérieur des bactéries magnétotaxiques1, ou extracellulaires, comme dans la formation de carbonate de calcium dans les pointes d'oursins2, d'hydroxyapatite qui est liée au collagène dans os3 et de l'émail qui est associé à l'amélogénine dans les dents4. La biominéralisation est un processus complexe qui dépend de nombreux paramètres dans l'organisme vivant. Par conséquent, afin de simplifier le système à l'étude, il est nécessaire d'évaluer l'effet des composants distincts sur le processus. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est induite par la présence de biopolymères extracellulaires. Le but de la méthode présentée ici est le suivant: (1) Pour former des cristaux de carbonate de calcium en présence de biopolymères isolés in vitro, en utilisant une méthode de diffusion de vapeur. (2) Étudier l'effet des biopolymères sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium.
Trois méthodes principales pour précipiter le carbonate de calcium in vitro en présence d'additifs organiques sont utilisées5,6. La première méthode, que nous appellerons la méthode de solution, est basée sur le mélange d'un sel soluble de calcium (par exemple, CaCl2) avec un sel soluble de carbonate (par exemple, carbonate de sodium). Le processus de mélange peut être effectué de plusieurs façons: à l'intérieur d'un réacteur avec trois cellules qui sont séparées par des membranes poreuses7. Ici, chacune des cellules extérieures contient un sel soluble et la cellule centrale contient une solution avec l'additif à tester. Calcium et carbonate diffusent de l'extérieur à la cellule moyenne, ce qui entraîne la précipitation du carbonate de calcium moins soluble lorsque les concentrations de calcium et de carbonate dépassent leur produit de solubilité, Ksp -[Ca2'][CO 3) 2-]. Une méthode de mélange supplémentaire est la procédure de double-jet8. Dans cette méthode, chaque sel soluble est injecté à partir d'une seringue séparée à une solution agitée contenant l'additif, où le carbonate de calcium se précipite. Ici, l'injection et donc le taux de mixage est bien contrôlé, contrairement à la méthode précédente où le mélange est contrôlé par diffusion.
La deuxième méthode utilisée pour cristalliser CaCO3 est la méthode Kitano9. Cette méthode est basée sur l'équilibre carbonate/hydrogène carbonate (2HCO3- (aq) ' Ca 2' (aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO 3(s) ' CO 2(g) ' H2O (l)). Ici, le CO2 est regroupé dans une solution contenant CaCO3 sous une forme solide, déplaçant l'équilibre vers la gauche et dissolvant ainsi le carbonate de calcium. Le carbonate de calcium non dissous est filtré et les additifs désirés sont ajoutés à la solution riche en bicarbonate. Le CO2 est ensuite autorisé à s'évaporer, déplaçant ainsi la réaction vers la droite, formant du carbonate de calcium en présence des additifs.
La troisième méthode de cristallisation du carbonate de calcium, que nous décrirarons ici, est la méthode de diffusion de vapeur10. Dans cette configuration, l'additif organique, dissous dans une solution de chlorure de calcium, est placé dans une chambre fermée près du carbonate d'ammonium sous forme de poudre. Lorsque la poudre de carbonate d'ammonium se décompose en dioxyde de carbone et en ammoniac, elle se diffuse dans la solution contenant des ions de calcium (p. ex. CaCl2), et le carbonate de calcium est précipité (voir la figure 1 pour illustrer). Les cristaux de carbonate de calcium peuvent se développer par des précipitations lentes ou par des précipitations rapides. Pour les précipitations lentes, une solution contenant l'additif dans la solution CaCl2 est placée dans un dessiccateur à côté de la poudre de carbonate d'ammonium. Dans les précipitations rapides, décrites en longueur dans le protocole, la solution additive et le carbonate d'ammonium sont rapprochés dans une plaque multi-puits. La méthode des précipitations lentes produira moins de centres de nucléation et de cristaux plus gros, et les précipitations rapides se traduiront par plus de centres de nucléation et de cristaux plus petits.
Les méthodes décrites ci-dessus diffèrent dans leur complexité technique, dans le niveau de contrôle et dans le taux du processus de précipitation. La méthode de mélange nécessite une configuration spéciale6 pour le double jet et le système à trois cellules. Dans la méthode de mélange, la présence d'autres contre-ions solubles (p. ex., Na,Cl-) 6 est inévitable, alors que dans la méthode Kitano, le calcium et le carbonate (bi) sont les seuls ions en solution et il n'implique pas la présence de contre ions (p. ex., Na,Cl-). En outre, la méthode de mélange nécessite des volumes relativement importants et, par conséquent, il n'est pas approprié pour travailler avec des biopolymères coûteux. L'avantage du double jet est qu'il est possible de contrôler le taux d'injection de solution et qu'il s'agit d'un processus rapide par rapport à d'autres méthodes.
L'avantage de la méthode Kitano et de la méthode de diffusion de vapeur est que la formation de carbonate de calcium est contrôlée par la diffusion du CO2 dans/hors d'une solution CaCl2, permettant ainsi de sonder des processus de nucléation et de précipitation plus lents 11 Ans, états-unis ( , 12. En outre, la formation de carbonate de calcium par diffusion du CO2 peut ressembler à des processus de calcification in vivo13,14,15. Dans cette méthode, des cristaux bien définis et séparés sont formés16. Enfin, l'effet d'un ou plusieurs biopolymères sur la formation de carbonate de calcium peut être testé. Cela permet une étude systématique de l'effet d'une série de concentrations additives sur la formation de carbonate de calcium ainsi qu'une étude des mélanges de biopolymères - tous effectués de manière contrôlée. Cette méthode est adaptée à une utilisation avec une large gamme de concentrations et de volumes d'additifs. Le volume minimal utilisé est d'environ 50 l et donc cette méthode est avantageuse lorsqu'il y a une quantité limitée de biopolymères disponibles. Le volume maximal dépend de l'accessibilité d'une plus grande plaque de puits, ou du dessiccateur dans lequel la plaque ou le bécher contenant CaCl2 doivent être insérés. La méthode décrite ci-dessous a été optimisée pour travailler dans une plaque de 96 puits avec un biopolymère choisi pour être la protéine TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. Il s'agit d'un processus complexe et, par conséquent, un système simple, in vitro, est nécessaire pour comprendre l'effet des molécules isolées sur le processus de biominéralisation. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est dirigée par des biopolymères dans la matrice extracellulaire. Afin d'évaluer l'effet des biopolymères isolés sur la morphologie et la structure de la calcite in vitro, nous avons utilisé la méthode de diffusion de vapeur pour la précipitation du carbonate de calcium, la microscopie électronique à balayage et le micro Raman pour la caractérisation, et l'absorption ultraviolet-visible (UV/Vis) pour mesurer la quantité d'un biopolymère dans les cristaux. Dans cette méthode, nous exposons les biopolymères isolés, dissous dans une solution de chlorure de calcium, à l'ammoniac gazeux et au dioxyde de carbone qui proviennent de la décomposition du carbonate d'ammonium solide. Dans les conditions où le produit de solubilité du carbonate de calcium est atteint, le carbonate de calcium se précipite et des cristaux sont formés. Le carbonate de calcium a différents polymorphes qui diffèrent dans leur stabilité thermodynamique : carbonate de calcium amorphe, vaterite, aragonite et calcite. En l'absence de biopolymères, dans des conditions propres, le carbonate de calcium est principalement présent sous forme de calcite, qui est le polymorphe thermodynamiquement stable de carbonate de calcium. Cette méthode examine l'effet des additifs biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Ici, nous démontrons le protocole par l'étude d'une protéine bactérienne extracellulaire, TapA, sur la formation de cristaux de carbonate de calcium. Plus précisément, nous nous concentrons sur la mise en place expérimentale, et les méthodes de caractérisation, telles que la microscopie optique et électronique ainsi que la spectroscopie Raman.

Un schéma de la mise en place expérimentale est montré dans la figure 1. En bref, la méthode de diffusion est utilisée afin de former des cristaux de carbonate de calcium dans des plaques de 96 puits et de tester l'effet des biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Dans ces expériences, le carbonate d'ammonium est décomposé en ammoniac et co2, qui se diffusent en solutions de carbonate de calcium, ce qui entraîne la formation ...

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Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Formation de carbonate de calcium en présence d'additifs biopolymères

Nous décrivons un protocole pour la précipitation et la caractérisation des cristaux de carbonate de calcium qui se forment en présence de biopolymères.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Notre protocole décrit un système in vitro simple, pour étudier l’effet des molécules isolées sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium. Cette technique est avantageuse dans les cas où les biomolécules que je teste sont coûteuses, ou disponibles en petites quantités, ainsi que lorsque des précipitations lentes de carbonate de calcium sont nécessaires. En outre, il permet de sonder plusieurs expériences de précipitations dans les mêmes conditions à la fois.Tout d’abord, préparer l’expérience de contrôle. Utilisez de l’eau distillée triple et de l’éthanol pour nettoyer les morceaux de verre et la verrerie. Utilisez un stylo diamant pour couper des morceaux d’une lame de microscope en verre, de sorte qu’ils s’insèrent dans un puits d’une plaque de 96 puits.Placez les places en verre dans un bécher avec de l’eau distillée triple, de sorte que l’eau recouvre les glissières en verre. Sonicate dans un sonicator de bain pendant 10 minutes. Décanter l’eau.Ajouter de l’éthanol pour couvrir les toboggans en verre et sonifier à nouveau dans un sonicateur de bain pendant 10 minutes. Ensuite, séchez les glissières et la verrerie avec un jet de gaz azoté, et placez-les dans un nettoyeur de plasma d’air pendant 10 minutes à 130 watts. Dans un capot à vapeur, remplir les puits aux coins d’une plaque de 96 puits de poudre de carbonate d’ammonium et sceller la plaque à l’aide de papier d’aluminium.Couvrir le papier d’aluminium d’un film de paraffine. Nettoyez tout carbonate résiduel d’ammonium à l’aide de gaz azoté. Placez les morceaux de verre préalablement coupés et nettoyés dans cinq puits différents les plus proches du centre.Remplissez chaque puits portant un morceau de verre avec 100 microlitres de solution de chlorure de calcium préparé avec de l’eau distillée triple à un gradient croissant de 10, 20, 30, 40 et 50 millimolaires concentrations. Ensuite, perforez le couvercle de chacun des puits contenant du carbonate d’ammonium trois fois à l’aide d’une aiguille. Remettre le couvercle, sceller les bordures avec du film de paraffine, et le garder à 18 degrés Celsius dans un incubateur pendant 20 heures.Pendant l’incubation, le carbonate d’ammonium est décomposé en ammoniac et en dioxyde de carbone, qui se diffusent en solutions de chlorure de calcium, ce qui entraîne la formation de cristaux de carbonate de calcium. Après l’incubation, ouvrez soigneusement le couvercle à l’intérieur d’un capot de fumée et utilisez une boucle pour enlever les cristaux formés à l’interface eau-air. Utilisez une pince à épiler pour transférer les morceaux de verre dans un bécher contenant de l’eau distillée double pour une courte trempette.Ensuite, retirez les échantillons du bécher et utilisez du ruban adhésif à double face pour fixer les morceaux de verre sur le fond de la boîte de Pétri. Sécher l’eau excessive en touchant les bordures de la lame, avec des lingettes de tissu. Couvrir la boîte de Pétri et la placer dans un dessiccateur pendant 24 heures.Observez les cristaux formés sur les morceaux de verre avec un microscope optique droit à 10 à 40 fois grossissement. Les cristaux rhombohédral observés sont très probablement calcite. Si, en plus des cristaux rhombohédral, la solution contient des cristaux sphériques qui sont très probablement vaterite, répéter le protocole de cristallisation, en s’assurant que l’étape de nettoyage est effectuée correctement.En outre, assurez-vous qu’il n’y a pas de carbonate d’ammonium dans les zones de la plaque autres que les puits dédiés. La concentration optimale de chlorure de calcium est déterminée selon l’échantillon riche en cristaux de calcite à facettes lisses sans cristaux de vaterite. Pour commencer, nettoyez les toboggans en verre et la verrerie comme cela a été fait précédemment.Dans une hotte fumigène, placer la poudre de carbonate d’ammonium dans les coins d’une plaque de 96 puits. Dans chaque puits où il y aura des précipitations, placez un morceau de verre qui a été coupé et nettoyé. Préparer les puits de contrôle.Dans deux puits témoins, pipette 90 microlitres de 25 millimlaires Tris tampon au pH 8, complétée par du chlorure de sodium de 100 millimlaires. Ajouter ensuite 10 microlitres de 0,5 solution molaire de stock de chlorure de calcium. Ensuite, ajustez la concentration de la protéine additive TapA à 10 micromolaires TapA, chlorure de sodium de 100 millimlaires et tampon tris de 25 millimolaires au pH 8.Préparer l’additif contenant des puits en ajoutant 90 microlitres de la solution additive. Ajouter 10 microlitres de 0,5 solution molaire de stock de chlorure de calcium à l’additif contenant des puits pour atteindre la concentration optimale à 50 millimlaires de chlorure de calcium déterminé précédemment. Préparer la plaque avec des trous sur le couvercle sur les puits contenant du carbonate d’ammonium, et incuber à 18 degrés Celsius comme cela a déjà été fait.Après l’incubation, préparer les morceaux de verre dans une boîte de Pétri comme avant, et placer le plat dans un dessiccateur pendant 24 heures. Pour quantifier le pourcentage de masse des additifs dans les précipités de carbonate de calcium, vérifiez d’abord le coefficient d’extinction de l’additif utilisé. Ensuite, utilisez un microbalance pour peser les morceaux de verre où les cristaux se sont formés.Après cela, racler les cristaux du verre dans un tube eppe avec 1,2 millilitres de 0,1 solution d’acide acétique molaire. Vortex brièvement, puis placer le tube dans un sonicateur pour sonifier l’échantillon jusqu’à ce que les cristaux disparaissent. Conserver l’échantillon à température ambiante pendant 24 heures.Pesez la glissière de verre après avoir gratté les cristaux. Mesurer l’absorption UV A de la solution sonique de 1,2 millilitre à 280 nanomètres pour l’additif protéique. Utilisez l’équation Beer-Lambert pour calculer sa concentration c.L est le chemin optique à l’intérieur de la cuvette. Pour calculer la masse des additifs dans le cristal, utilisez l’équation, c fois v égale m, si la concentration est en milligrammes par millilitre. Si la concentration est dans les grains de beauté par litre, puis calculer les grains de beauté en appliquant c fois v égale n.Ensuite, utilisez le poids moléculaire pour calculer la masse des additifs. Calculer le pourcentage de poids des additifs dans les cristaux. M est la masse des additifs, et delta m s, est la masse des cristaux de carbonate de calcium qui ont été grattés sur le morceau de verre.Les images SEM montrent la comparaison entre un contrôle approprié avec des faces calcites lisses, et calcite cristaux avec des visages composés d’étapes. Les cristaux sphériques sont vaterites. Les expériences de lutte réussies et infructueuses ont abouti à la spectroscopie raman, montrant les spectres typiques de calcite et de vaterite respectivement.La division du changement raman à environ 1080 par centimètre est la caractéristique la plus évidente du vaterite. Les cristaux de carbonate de calcium formés en présence de TapA, sont distincts des cristaux de contrôle. Un assemblage sphérique complexe de carbonate de calcium, composé de microcrystals calcite multiples a été formé.Le spectre Raman des cristaux formés en présence de TapA, est similaire au spectre de calcite. Les spectres absorbants du TapA, et le contrôle sans additif, ont été mesurés après dissolution des cristaux dans l’acide. Le pourcentage de masse de TapA a été déterminé à 1,8 plus ou moins 0,2%Il est essentiel de suivre attentivement les étapes de nettoyage, et de s’assurer que les normes de contrôle sont respectées avant de tester l’effet des additifs sur la formation de carbonate de calcium.En outre, il est important d’éliminer tout excès de carbonate d’ammonium sous forme en poudre des puits. Le carbonate d’ammonium se décompose en ammoniac et en dioxyde de carbone. L’ammoniac est toxique s’il est inhalé et, par conséquent, le carbonate d’ammonium ne doit être manipulé qu’à l’intérieur d’un capot de fumée.Afin d’évaluer la morphologie interne et la structure des cristaux, vous pouvez les sectionner à l’aide d’un faisceau iion focalisé, l’image des sections avec un microscope électronique de transmission, et de mesurer les modèles de diffraction électronique à partir d’endroits spécifiques le long des sections. Cette technique a déjà été utilisée pour étudier l’effet de diverses molécules sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium. Nous avons élaboré cette méthode aux biopolymères qui sont produits par les cellules bactériennes dans les biofilms.Il sera intéressant d’effectuer des études supplémentaires avec d’autres biopolymères produits par différentes souches bactériennes.

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