Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Die Autoren danken Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan Erez und Dr. Yael Politi für fruchtbare Gespräche. Diese Forschung wurde von der Israeli Science Foundation (ISF), Stipendium 1150/14, unterstützt.

1. Calciumcarbonatkristallisation
<ol><li>Steuerungsvorbereitung und -optimierung
	<ol><li>Bereiten Sie saubere Glasstücke vor. Verwenden Sie das gleiche Reinigungsverfahren, um die Glaswaren zu reinigen.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Diamantstift, um Teile eines Glasmikroskopschlittens zu schneiden, so dass sie in einen Brunnen einer 96-Well-Platte passen. HINWEIS: 5 mm x 5 mm Stücke sollten weitgehend passen.</li>
			<li>Legen Sie die Glasstücke in einen Becher mit dreifach destilliertem Wasser (...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).</li><li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).</li><li>Page, M. G., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion:+Application+in+Mesocrystal+Assembly.">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth &amp; Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li><li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate.">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li><li>Sedl&#225;k, M., Antonietti, M., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals.">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li><li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+aragonite+synthesis.">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li><li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asprich+mollusk+shell+protein:+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization.">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li><li>Gehrke, N., C&#246;lfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment.">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth &amp; Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li><li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3.">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li><li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Calcite+(Calcium+Carbonate)+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon.">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527 (1973).</li><li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon,+Oncorhynchus+kisutch.">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure.">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li><li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications.">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li><li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mollusc+larval+shell+formation:+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite.">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li><li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3/chitin-whisker+hybrids:+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension.">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583 (2010).</li><li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies.">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li></ol>

Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, Kalziumkarbonatkristalle in Gegenwart organischer Additive zu bilden und die Wirkung organischer Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonatkristallen in vitro zu bewerten. Das Verfahren basiert auf dem Vergleich der Kristalle, die in Gegenwart der organischen Additive gebildet werden, mit den calcitkristallen, die im Kontrollexperiment gebildet wurden. Wir haben gezeigt, wie man die Diffusionsmethode zur Bildung der Calciumcarbonatkristalle verwendet,...

Biomineralisierung ist die Bildung von Mineralien in Gegenwart von organischen Molekülen, die oft mit funktionellen und/oder strukturellen Rollen in lebenden Organismen zusammenhängen. Die Biomineralisierung kann intrazellulär sein, wie bei der Bildung von Magnetit in magnetotaktischen Bakterien1, oder extrazellulär, wie bei der Bildung von Calciumcarbonat in Seeigelspitzen2, von Hydroxyapatit, das mit Kollagen in Knochen3 und von Zahnschmelz, der mit Amelogenin in den Zähnen assoziiert ist4. Biomineralisierung ist ein komplexer Prozess, der von vielen Parametern im lebenden Organismus abhängt. Um das untersuchte System zu vereinfachen, ist es daher notwendig, die Auswirkungen separater Komponenten auf den Prozess zu bewerten. In vielen Fällen wird die Biomineralisierung durch das Vorhandensein extrazellulärer Biopolymere induziert. Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist wie folgt: (1) Calciumcarbonatkristalle in Gegenwart von isolierten Biopolymeren in vitro unter Verwendung einer Dampfdiffusionsmethode zu bilden. (2) Untersuchung der Wirkung der Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat.
Es werden drei Hauptmethoden zur Ausscheidung von Calciumcarbonat in vitro in Gegenwart organischer Zusatzstoffe verwendet5,6. Die erste Methode, die wir als Lösungsmethode bezeichnen werden, basiert auf dem Mischen eines löslichen Calciumsalzes (z.B. CaCl2) mit einem löslichen Salz aus Carbonat (z. B. Natriumcarbonat). Der Mischprozess kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden: in einem Reaktor mit drei Zellen, die durch poröse Membranen getrennt sind7. Hier bei jeder der äußeren Zellen befindet sich ein lösliches Salz und die Zentralzelle enthält eine Lösung mit dem zu prüfenden Additiv. Calcium und Karbonat diffundieren von der äußeren in die mittlere Zelle, was zur Ausfällung des weniger löslichen Calciumcarbonats führt, wenn die Konzentrationen von Kalzium und Karbonat ihr Löslichkeitsprodukt überschreiten, Ksp = [Ca2+][CO3 2-]. Eine zusätzliche Mischmethode ist das Doppelstrahlverfahren8. Bei diesem Verfahren wird jedes lösliche Salz aus einer separaten Spritze in eine Rührlösung injiziert, die den Zusatzstoff enthält, wo Kalziumkarbonat ausfällt. Hierbei ist die Injektion und damit die Mischrate gut kontrolliert, im Gegensatz zur bisherigen Methode, bei der das Mischen durch Diffusion gesteuert wird.
Die zweite Methode, die verwendet wird, um CaCO3 zu kristallisieren, ist die Kitano-Methode9. Diese Methode basiert auf dem Carbonat/Wasserstoffcarbonat-Gleichgewicht (2HCO3- (aq) + Ca2+(aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO 3(s) + CO 2(g) + H 2O (l)). Hier wird CO2 in eine Lösung geblasen, die CaCO3 in fester Form enthält, das Gleichgewicht nach links verschiebt und somit das Calciumcarbonat auflöst. Das ungelöste Calciumcarbonat wird gefiltert und die gewünschten Additive in die bicarbonatreiche Lösung aufgenommen. CO2 darf dann verdampfen, wodurch die Reaktion nach rechts verschoben wird, wodurch Kalziumkarbonat in Gegenwart der Additive gebildet wird.
Die dritte Methode der Calciumcarbonatkristallisation, die wir hier beschreiben werden, ist die Dampfdiffusionsmethode10. In diesem Aufbau wird der organische Zusatzstoff, gelöst in einer Lösung von Calciumchlorid, in einer geschlossenen Kammer in der Nähe von Ammoniumcarbonat in Pulverform gelegt. Wenn Ammoniumcarbonatpulver in Kohlendioxid und Ammoniak zerfällt, diffundieren sie in die Lösung, die Calciumionen enthält (z. B. CaCl2), und Calciumcarbonat wird ausgefällt (abbildung 1 siehe Abbildung). Die Calciumcarbonatkristalle können durch langsamen Niederschlag oder durch schnelle Niederschläge wachsen. Bei gleichzeitigem Niederschlag wird eine Lösung, die das Additiv in CaCl 2-Lösung enthält, in einen Trockentrockner neben dem Ammoniumcarbonatpulver gelegt. Bei der im Protokoll beschriebenen schnellen Ausfällung werden sowohl die Additivlösung als auch das Ammoniumcarbonat in einer Mehrbrunnenplatte näher beieinander platziert. Die Methode der langsamen Ausfällung wird weniger Keimzentren und größere Kristalle produzieren, und die schnelle Ausfällung wird zu mehr Kernzentren und kleineren Kristallen führen.
Die oben beschriebenen Methoden unterscheiden sich in ihrer technischen Komplexität, in der Kontrollebene und in der Rate des Fällungsprozesses. Die Mischmethode erfordert eine spezielle Einrichtung6 sowohl für den Doppelstrahl als auch für das Dreizellsystem. Bei der Mischmethode ist das Vorhandensein anderer löslicher Gegenionen (z. B. Na+, Cl-)6 unvermeidlich, während bei der Kitano-Methode Kalzium und (Bi)carbonat die einzigen Ionen in Lösung sind und es nicht das Vorhandensein zusätzlicher Gegenionen (z.B. Na+, Cl-). Darüber hinaus benötigt das Mischverfahren relativ große Volumina und eignet sich daher nicht für die Arbeit mit teuren Biopolymeren. Der Vorteil des Doppelstrahls ist, dass es möglich ist, die Rate der Lösungsinjektion zu kontrollieren und dass es ein schneller Prozess im Vergleich zu anderen Methoden ist.
Der Vorteil der Kitano-Methode und der Dampfdiffusionsmethode besteht darin, dass die Bildung von Calciumcarbonat durch Diffusion von CO2 in/aus einer CaCl 2-Lösung gesteuert wird, wodurch langsamere Keim- und Niederschlagsprozesse untersucht werden können. 11 , 12. Darüber hinaus kann die Calciumcarbonatbildung durch Diffusion vonCO2 Verkalkungsprozessen in vivo13,14,15ähneln. Bei dieser Methode werden gut definierte und getrennte Kristallegebildet 16. Schließlich kann die Wirkung einzelner oder mehrerer Biopolymere auf die Kalziumkarbonatbildung getestet werden. Dies ermöglicht eine systematische Untersuchung der Wirkung einer Reihe von Additivkonzentrationen auf die Calciumcarbonatbildung sowie eine Untersuchung von Mischungen von Biopolymeren - die alle kontrolliert durchgeführt werden. Dieses Verfahren eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Konzentrationen und Mengen von Additiven. Das minimale Volumen beträgt ca. 50 l und daher ist dieses Verfahren vorteilhaft, wenn eine begrenzte Menge der verfügbaren Biopolymere vorhanden ist. Das maximale Volumen hängt von der Zugänglichkeit einer größeren Wellplatte oder des Trockenmittels ab, in das die Platte oder der Becher, der CaCl2 enthält, eingesetzt werden soll. Das unten beschriebene Verfahren wurde für die Arbeit in einer 96-Well-Platte mit einem Biopolymer optimiert, das als Protein TapA17ausgewählt wurde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

Biomineralisierung ist die Bildung von Mineralien in Gegenwart von organischen Molekülen, die oft mit funktionellen und/oder strukturellen Rollen in lebenden Organismen zusammenhängen. Es ist ein komplexer Prozess und daher ein einfaches, in vitro, System erforderlich, um die Wirkung isolierter Moleküle auf den Biomineralisierungsprozess zu verstehen. In vielen Fällen wird die Biomineralisierung durch Biopolymere in der extrazellulären Matrix gesteuert. Um die Wirkung isolierter Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calcit in vitro zu bewerten, haben wir das Dampfdiffusionsverfahren zur Ausfällung von Calciumcarbonat, Rasterelektronenmikroskopie und Mikro Raman für die Charakterisierung, ultraviolett-sichtbare (UV/Vis) Absorption zur Messung der Menge eines Biopolymers in den Kristallen. Bei diesem Verfahren setzen wir die isolierten Biopolymere, die in einer Calciumchloridlösung gelöst werden, gasförmigem Ammoniak und Kohlendioxid aus, die aus der Zersetzung von festem Ammoniumcarbonat stammen. Unter den Bedingungen, unter denen das Löslichkeitsprodukt von Calciumcarbonat erreicht wird, bilden sich Calciumcarbonatausscheidungen und Kristalle. Calciumcarbonat hat verschiedene Polymorphe, die sich in ihrer thermodynamischen Stabilität unterscheiden: amorphes Calciumcarbonat, Vaterit, Aragonit und Calcit. In Ermangelung von Biopolymeren ist Calciumcarbonat unter sauberen Bedingungen meist in der Calcitform vorhanden, die das thermodynamisch stabileste Polymorph von Calciumcarbonat ist. Diese Methode untersucht die Wirkung der biopolymeren Additive auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonatkristallen. Hier zeigen wir das Protokoll durch die Untersuchung eines extrazellulären bakteriellen Proteins, TapA, über die Bildung von Calciumcarbonatkristallen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die experimentelleN Einrichtung und Charakterisierungsmethoden, wie optische und Elektronenmikroskopie sowie Raman-Spektroskopie.

Ein Schaltplan der Versuchseinrichtung ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, wird die Diffusionsmethode verwendet, um Calciumcarbonatkristalle in 96-Well-Platten zu bilden und die Wirkung von Biopolymeren auf die Morphologie und Struktur der Calciumcarbonatkristalle zu testen. In diesen Experimenten wird Ammoniumcarbonat inAmmoniak und CO2 zerlegt, die in Calciumcarbonatlösungen diffundieren, was zur Bildung von Calciumcarbonatkristallen führt (Abbildu...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Calciumcarbonatbildung in Gegenwart biopolymerer Additive

Wir beschreiben ein Protokoll zur Ausfällung und Charakterisierung von Calciumcarbonatkristallen, die sich in Gegenwart von Biopolymeren bilden.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Unser Protokoll beschreibt ein einfaches In-vitro-System, um die Wirkung isolierter Moleküle auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat zu untersuchen. Diese Technik ist vorteilhaft in Fällen, in denen die Biomoleküle, die ich teste, teuer oder in kleinen Mengen erhältlich sind, sowie wenn eine langsame Calciumcarbonatfällung erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht es, mehrere Niederschlagsexperimente unter den gleichen Bedingungen gleichzeitig zu untersuchen.Bereiten Sie zunächst das Kontrollexperiment vor. Verwenden Sie dreifach destilliertes Wasser und Ethanol, um Glasstücke und Glaswaren zu reinigen. Verwenden Sie einen Diamantstift, um Teile eines Glasmikroskopschlittens zu schneiden, so dass sie in einen Brunnen einer 96-Well-Platte passen.Legen Sie die Glasstellen in einen Becher mit dreifach destilliertem Wasser, so dass das Wasser die Glasrutschen bedeckt. Beschallen Sie in einem Bad Beschallungsgerät für 10 Minuten. Dekant das Wasser.Fügen Sie Ethanol hinzu, um die Glasglyse zu bedecken, und beschallen Sie wieder in einem Bad Beschallungsgerät für 10 Minuten. Dann trocknen Sie die Dias und das Glas mit einem Strom von Stickstoffgas, und legen Sie sie in einem Luftplasmareiniger für 10 Minuten bei 130 Watt. In einer Dunstabzugshaube die Brunnen an den Ecken einer 96-Well-Platte mit Ammoniumcarbonatpulver füllen und die Platte mit Aluminiumfolie versiegeln.Bedecken Sie die Folie mit Paraffinfolie. Reinigen Sie alle Restammoniumcarbonate mit Stickstoffgas. Legen Sie die zuvor geschnittenen und gereinigten Glasteile in fünf verschiedene Brunnen, die der Mitte am nächsten liegen.Füllen Sie jeden Brunnen mit einem Glasstück mit 100 Mikroliter Calciumchloridlösung, die mit dreifach destilliertem Wasser bei einem zunehmenden Gradienten von 10, 20, 30, 40 und 50 Millimolaren hergestellt wird. Als nächstes punktieren Sie die Abdeckung der einzelnen Brunnen, die Ammoniumcarbonat enthalten, dreimal mit einer Nadel. Den Deckel zurücklegen, die Ränder mit Paraffinfolie versiegeln und 20 Stunden lang bei 18 Grad Celsius in einem Brutkasten aufbewahren.Während der Inkubation wird Ammoniumcarbonat in Ammoniak und Kohlendioxid zerlegt, die zu Calciumchloridlösungen diffundieren, was zur Bildung von Calciumcarbonatkristallen führt. Nach der Inkubation öffnen Sie den Deckel vorsichtig in einer Dunstabzugshaube und entfernen Sie mit einer Schlaufe die kristallisierenden Kristalle an der Wasser-Luft-Schnittstelle. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Glasteile in einen Becher mit doppelt destilliertem Wasser für einen kurzen Tauchgang zu übertragen.Entfernen Sie dann die Proben aus dem Becher, und verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Glasstücke auf dem Boden der Petrischale zu befestigen. Trockenes übermäßiges Wasser, das die Ränder der Rutsche berührt, mit Gewebetüchern. Bedecken Sie die Petrischale und legen Sie sie 24 Stunden lang in einen Trockenhaus.Beobachten Sie die auf den Glasstücken gebildeten Kristalle mit einem aufrechten optischen Mikroskop bei 10- bis 40-facher Vergrößerung. Die beobachteten rhombohedralen Kristalle sind höchstwahrscheinlich Calcit. Wenn die Lösung zusätzlich zu den rhombohedralen Kristallen kugelförmige Kristalle enthält, die höchstwahrscheinlich vateritisch sind, wiederholen Sie das Kristallisationsprotokoll, um sicherzustellen, dass der Reinigungsschritt korrekt durchgeführt wird.Stellen Sie außerdem sicher, dass es in anderen Bereichen der Platte als den dafür vorgesehenen Brunnen kein Ammoniumcarbonat gibt. Die optimale Konzentration für Calciumchlorid wird nach der Probe ermittelt, die reich an glatten facettierten Calcitkristallen ohne Vateritkristalle ist. Reinigen Sie zunächst Glasschlitten und Glaswaren wie bisher.In einer Dunstabzugshaube Ammoniumcarbonatpulver in die Ecken einer 96-Well-Platte legen. Legen Sie in jedem Brunnen, in dem der Niederschlag auftritt, ein Glasstück, das geschnitten und gereinigt wurde. Bereiten Sie die Steuerbrunnen vor.In zwei Steuerbrunnen, Pipette 90 Mikroliter von 25 Millimolar Tris Puffer bei pH 8, ergänzt mit 100 Millimolar Natriumchlorid. Dann 10 Mikroliter 0,5 Mol Calciumchlorid-Stammlösung hinzufügen. Passen Sie dann die Konzentration des additiven Proteins TapA auf 10 mikromolare TapA, 100 Millimolar Natriumchlorid und 25 Millimolar Tris Puffer bei pH 8 an.Bereiten Sie den Zusatzstoff, der Brunnen enthält, durch Zugabe von 90 Mikrolitern der Additivlösung vor. Fügen Sie dem zuvor ermittelten Additiv mit Brunnen 10 Mikroliter 0,5 Molcalciumchlorid in den Zusatzstoff ein, der Brunnen enthält, um die optimale Konzentration bei 50 Millimolar Calciumchlorid zu erreichen. Bereiten Sie die Platte mit Löchern auf der Abdeckung über Brunnen mit Ammoniumcarbonat vor und brüten Sie wie bisher bei 18 Grad Celsius.Nach der Inkubation die Glasstücke wie zuvor in einer Petrischale zubereiten und 24 Stunden in einen Trockenschrank geben. Um den Massenanteil der Additive in den Calciumcarbonatausscheidungen zu quantifizieren, überprüfen Sie zunächst den Aussterbekoeffizienten des verwendeten Additivs. Verwenden Sie dann eine Mikrowaage, um die Glasstücke zu wiegen, wo sich die Kristalle gebildet haben.Danach die Kristalle aus dem Glas in ein Eppe-Rohr mit 1,2 Millilitern 0,1 Molessigsäurelösung kratzen. Wirbel kurz, und legen Sie dann die Röhre in einen Beschallungsgerät, um die Probe zu beschallen, bis die Kristalle verschwinden. Bewahren Sie die Probe 24 Stunden bei Raumtemperatur auf.Wiegen Sie die Glasrutsche nach dem Abkratzen der Kristalle. Messen Sie die UV-Absorption A der 1,2 Milliliter schallten Lösung bei 280 Nanometern für den Proteinzusatzstoff. Verwenden Sie die Beer-Lambert-Gleichung, um ihre Konzentration c zu berechnen.L ist der optische Pfad innerhalb der Küvette. Um die Masse der Additive im Kristall zu berechnen, verwenden Sie die Gleichung, c mal v gleich m, wenn die Konzentration in Milligramm pro Milliliter liegt. Wenn die Konzentration in Molproliter liegt, dann berechnen Sie die Maulwürfe, die c mal v gleich n anwenden.Verwenden Sie dann das Molekulargewicht, um die Masse der Additive zu berechnen. Berechnen Sie den Gewichtsprozentsatz der Additive in den Kristallen. M ist die Masse der Additive, und Delta m s, ist die Masse der Calciumcarbonatkristalle, die von der Glasscheibe abgekratzt wurden.SEM-Bilder zeigen den Vergleich zwischen einer richtigen Steuerung mit glatten Calcitflächen und Calcitkristallen mit Gesichtern, die aus Schritten bestehen. Die kugelförmigen Kristalle sind vaterite. Die erfolgreichen und erfolglosen Kontrollexperimente führten zur Raman-Spektroskopie, die die typischen Spektren von Calcit bzw. Vaterit zeigte.Die Teilung der Raman-Schicht bei rund 1080 Promille ist das offensichtlichste Merkmal von Vaterite. Die in Gegenwart von TapA gebildeten Kristalle von Calciumcarbonat unterscheiden sich von den Kontrollkristallen. Es entstand eine komplexe kugelförmige Calciumcarbonat-Baugruppe, die aus mehreren Calcit-Mikrokristallen besteht.Das Raman-Spektrum der Kristalle, die in Gegenwart von TapA gebildet werden, ähnelt dem Spektrum von Calcit. Die saugfähigen Spektren von TapA und die Kontrolle ohne Additiv wurden nach Auflösung der Kristalle in Säure gemessen. Der Massenprozentsatz von TapA wurde auf 1,8 plus oder minus 0,2% festgelegt. Es ist wichtig, die Reinigungsschritte sorgfältig zu befolgen und sicherzustellen, dass die Kontrollstandards erfüllt werden, bevor die Auswirkungen der Zusatzstoffe auf die Bildung von Calciumcarbonat getestet werden.Darüber hinaus ist es wichtig, überschüssiges Ammoniumcarbonat in pulverförmiger Form aus den Brunnen zu entfernen. Ammoniumcarbonat zersetzt sich in Ammoniak und Kohlendioxid. Ammoniak ist giftig, wenn es eingeatmet wird, und daher sollte Ammoniumcarbonat nur in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.Um die innere Morphologie und Struktur der Kristalle zu bewerten, können Sie sie mit einem fokussierten Ionenstrahl abbilden, die Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop abbilden und die Elektronenbeugungsmuster von bestimmten Stellen entlang der Abschnitte messen. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um die Wirkung verschiedener Moleküle auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat zu untersuchen. Wir haben diese Methode auf Biopolymere ausgearbeitet, die von Bakterienzellen in Biofilmen hergestellt werden.Es wird interessant sein, zusätzliche Studien mit anderen Biopolymeren durchzuführen, die von verschiedenen Bakterienstämmen produziert werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrowellen-unterstützte Funktionalisierung von Poly (Ethylenglycol) und On-Harz Peptide zur Verwendung in Kettenpolymerisationen und Hydrogelierung

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Forschung

Chemie

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

Einfluss von Hybrid Perowskit-Herstellungsverfahren auf Filmbildung, Elektronische Struktur und Leistung der Solarzelle

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelektronen Bildgebung von Anionen illustriert von 310 Nm Ablösung der F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...