Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Gli autori ringraziano il professor Lia Addadi, il professor Jonathan Erez e il dr. Yael Politi per le fruttuose discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Israeli Science Foundation (ISF), sovvenzione 1150/14.

1. Cristallizzazione carbonata di calcio di calcio
<ol><li>Preparazione e ottimizzazione dei controlli
	<ol><li>Preparare pezzi di vetro puliti. Utilizzare la stessa procedura di pulizia per pulire la vetreria.<ol>
<li>Utilizzare una penna a diamante per tagliare pezzi di un vetrino del microscopio in vetro in modo che si adattino in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti. NOTA: i pezzi da 5 mm x 5 mm devono adattarsi in gran parte.</li>
			<li>Mettere i pezzi di vetro in un becher con tripla acqua ...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).</li><li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).</li><li>Page, M. G., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion:+Application+in+Mesocrystal+Assembly.">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth &amp; Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li><li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate.">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li><li>Sedl&#225;k, M., Antonietti, M., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals.">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li><li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+aragonite+synthesis.">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li><li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asprich+mollusk+shell+protein:+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization.">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li><li>Gehrke, N., C&#246;lfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment.">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth &amp; Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li><li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3.">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li><li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Calcite+(Calcium+Carbonate)+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon.">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527 (1973).</li><li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon,+Oncorhynchus+kisutch.">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure.">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li><li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications.">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li><li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mollusc+larval+shell+formation:+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite.">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li><li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3/chitin-whisker+hybrids:+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension.">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583 (2010).</li><li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies.">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li></ol>

Il metodo qui descritto è volto a formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di additivi organici e a valutare l'effetto dei biopolimeri organici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio in vitro. Il metodo si basa sul confronto dei cristalli formati in presenza degli additivi organici ai cristalli di calcite formati nell'esperimento di controllo. Abbiamo dimostrato come utilizzare il metodo di diffusione per formare i cristalli di carbonato di calcio, come caratterizzare la loro mo...

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. La biomineralizzazione può essere intracellulare, come nella formazione di magnetite all'interno di batteri magnetotattici1, o extracellulare, come nella formazione di carbonato di calcio nei picchi di riccio di mare2, di idrossiapatite che è correlato con collagene in ossa3 e di smalto che è associato con amelogenin adenti4. La biomineralizzazione è un processo complesso che dipende da molti parametri nell'organismo vivente. Pertanto, al fine di semplificare il sistema in esame, è necessario valutare l'effetto di componenti separati sul processo. In molti casi, la biomineralizzazione è indotta dalla presenza di biopolimeri extracellulari. Lo scopo del metodo qui presentato è il seguente: (1) Formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di biopolimeri isolati in vitro, utilizzando un metodo di diffusione del vapore. (2) Studiare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura del carbonato di calcio.
Tre metodi principali per precipitare carbonato di calcio in vitro in presenza di additivi organici sono utilizzati5,6. Il primo metodo, che ci riferiremo come il metodo della soluzione, si basa sulla miscelazione di un sale solubile di calcio (ad esempio, CaCl2) con un sale di carbonato solubile (ad esempio, carbonato di sodio). Il processo di miscelazione può essere eseguito in diversi modi: all'interno di un reattore con tre cellule separate da membrane porose7. Qui, ciascuna delle cellule esterne contiene un sale solubile e la cella centrale contiene una soluzione con l'additivo da testare. Calcio e carbonato si diffondono dall'esterno alla cellula centrale, causando la precipitazione del carbonato di calcio meno solubile quando le concentrazioni di calcio e carbonato superano il loro prodotto di sobrietà, Ksp 2-]. Un ulteriore metodo di miscelazione è la procedura a doppio getto8. In questo metodo, ogni sale solubile viene iniettato da una siringa separata a una soluzione mescolata contenente l'additivo, dove precipita il carbonato di calcio. Qui, l'iniezione e quindi il tasso di miscelazione è ben controllato, in contrasto con il metodo precedente in cui la miscelazione è controllata dalla diffusione.
Il secondo metodo utilizzato per cristallizzare CaCO3 è il metodo Kitano9. Questo metodo si basa sull'equilibrio carbonato/idrogeno carbonato (2HCO3- (aq) - Ca2'(aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO 3(s) - CO 2(g) - H2O (l)). Qui, CO2 viene bollato in una soluzione contenente CaCO3 in una forma solida, spostando l'equilibrio a sinistra e quindi sciogliendo il carbonato di calcio. Il carbonato di calcio non disciolto viene filtrato e gli additivi desiderati vengono aggiunti alla soluzione ricca di bicarbonato. Co2 è quindi lasciato evaporare, spostando così la reazione a destra, formando carbonato di calcio in presenza degli additivi.
Il terzo metodo di cristallizzazione carbonata di calcio, che descriveremo qui, è il metodo di diffusione del vapore10. In questo set-up, l'additivo organico, sciolto in una soluzione di cloruro di calcio, viene posto in una camera chiusa vicino al carbonato di ammonio in forma di polvere. Quando la polvere di carbonato di ammonio si decompone in anidride carbonica e ammoniaca, si diffondono nella soluzione contenente ioni di calcio (ad esempio, CaCl2), e il carbonato di calcio è precipitato (vedere la figura 1 a illustrazione). I cristalli di carbonato di calcio possono crescere da precipitazioni lente o da precipitazioni veloci. Per la lenta precipitazione, una soluzione contenente l'additivo nella soluzione CaCl2 viene posta in un desiccatore accanto alla polvere di carbonato di ammonio. Nella precipitazione veloce, descritta in lunghezza nel protocollo, sia la soluzione additiva che il carbonato di ammonio vengono posizionati più vicini in una piastra multi-bene. Il metodo di precipitazione lenta produrrà meno centri di nucleazione e cristalli più grandi, e la precipitazione veloce si tradurrà in più centri di nucleazione e cristalli più piccoli.
I metodi sopra descritti differiscono nella loro complessità tecnica, nel livello di controllo e nella velocità del processo di precipitazione. Il metodo di miscelazione richiede un set-up speciale6 sia per il doppio getto che per il sistema a tre celle. Nel metodo di miscelazione, la presenza di altri controioni solubili (ad es., Na,Cl-)6 è inevitabile, mentre nel metodo Kitano, il calcio e il (bi) carbonato sono gli unici ioni in soluzione e non comporta la presenza di ulteriori ioni contatore (ad es., Na,Cl-). Inoltre, il metodo di miscelazione richiede volumi relativamente grandi e quindi non è adatto per lavorare con biopolimeri costosi. Il vantaggio del doppio getto è che è possibile controllare la velocità di iniezione della soluzione e che si tratta di un processo rapido rispetto ad altri metodi.
Il vantaggio del metodo Kitano e del metodo di diffusione del vapore è che la formazione di carbonato di calcio è controllata dalla diffusione di CO2 in una soluzione CaCl2, permettendo così di sondare processi di nucleazione e precipitazioni più lenti 11 Del sistema di , 12. Inoltre, la formazione di carbonato di calcio per diffusione di CO2 può assomigliare ai processi di calcificazione in vivo13,14,15. In questo metodo, i cristalli ben definiti e separati sono formati16. Infine, è possibile testare l'effetto di biopolimeri singoli o multipli sulla formazione di carbonato di calcio. Ciò consente uno studio sistematico dell'effetto di una serie di concentrazioni additive sulla formazione di carbonato di calcio, nonché uno studio di miscele di biopolimeri - il tutto eseguito in modo controllato. Questo metodo è adatto per l'uso con una vasta gamma di concentrazioni e volumi di additivi. Il volume minimo utilizzato è di circa 50 gradi e quindi questo metodo è vantaggioso quando c'è una quantità limitata di biopolimeri disponibili. Il volume massimo dipende dall'accessibilità di un pozzo più grande o dal desiccatore in cui devono essere inseriti la piastra o il becher contenente CaCl 2. Il metodo descritto di seguito è stato ottimizzato per lavorare in una piastra di 96 pozze con un biopolimero scelto per essere la proteina TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. Si tratta di un processo complesso e quindi è necessario un sistema semplice, in vitro, per comprendere l'effetto delle molecole isolate sul processo di biomineralizzazione. In molti casi, la biomineralizzazione è diretta da biopolimeri nella matrice extracellulare. Per valutare l'effetto dei biopolimeri isolati sulla morfologia e la struttura della calcite in vitro, abbiamo utilizzato il metodo di diffusione del vapore per la precipitazione del carbonato di calcio, la microscopia elettronica a scansione e il micro Raman per la caratterizzazione, e assorbimento visibile all'ultravioletto (UV/Vis) per misurare la quantità di un biopolimero nei cristalli. In questo metodo esponiamo i biopolimeri isolati, disciolti in una soluzione di cloruro di calcio, in ammoniaca gassosa e anidride carbonica che derivano dalla decomposizione del carbonato di ammonio solido. Nelle condizioni in cui viene raggiunto il prodotto di solubilità del carbonato di calcio, si formano precipitati e cristalli di carbonato di calcio. Il carbonato di calcio di calcio ha diversi polimorfi che differiscono nella loro stabilità termodinamica: carbonato di calcio amorfo, vaterite, aragonite e calcite. In assenza di biopolimeri, in condizioni pulite, il carbonato di calcio è presente principalmente nella forma di calcite, che è il polimorfo più termodinamicamente stabile del carbonato di calcio. Questo metodo esamina l'effetto degli additivi biopolimerici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. Qui, dimostriamo il protocollo attraverso lo studio di una proteina batterica extracellulare, TapA, sulla formazione di cristalli di carbonato di calcio. In particolare, ci concentriamo sull'impostazione sperimentale e sui metodi di caratterizzazione, come la microscopia ottica ed elettronica e la spettroscopia Raman.

Uno schema del set up sperimentale è illustrato nella Figura 1. In breve, il metodo di diffusione viene utilizzato per formare cristalli di carbonato di calcio in piastre di 96 pozze e testare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. In questi esperimenti, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e CO2, che si diffondono in soluzioni di carbonato di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di ...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Formazione carbonato di calcio in presenza di additivi biopolimerici

Descriviamo un protocollo per la precipitazione e la caratterizzazione di cristalli di carbonato di calcio che si formano in presenza di biopolimeri.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Il nostro protocollo descrive un semplice sistema in vitro, per studiare l'effetto di molecole isolate sulla morfologia e sulla struttura del carbonato di calcio. Questa tecnica è vantaggiosa nei casi in cui le biomolecole che test sono costose, o disponibili in piccole quantità, così come quando è richiesta una lenta precipitazione del carbonato di calcio. Inoltre, consente di sondare più esperimenti di precipitazione nelle stesse condizioni contemporaneamente.In primo luogo, preparare l'esperimento di controllo. Utilizzare acqua tripla distillata ed etanolo per pulire pezzi di vetro e vetreria. Usa una penna diamanta per tagliare pezzi di uno scivolo al microscopio di vetro, in modo che si adattino a un pozzo di una piastra da 96 pozzetti.Posizionare i posti di vetro in un becher con acqua distillata tripla, in modo che l'acqua copra gli scivoli di vetro. Sonicare in un sonicatore da bagno per 10 minuti. Decantare l'acqua.Aggiungere l'etanolo per coprire le diapositive di vetro e sonicare di nuovo in un sonicatore da bagno per 10 minuti. Quindi, asciugare le diapositive e le vetrerie con un flusso di gas azoto e posizionarle in un detergente per il plasma d'aria per 10 minuti a 130 watt. In una cappa aspirante, riempire i pozzi agli angoli di una piastra da 96 po 'con polvere di carbonato di ammonio e sigillare la piastra usando un foglio di alluminio.Coprire il foglio con pellicola di paraffina. Pulire qualsiasi carbonato residuo di ammonio utilizzando gas azoto. Posizionare i pezzi di vetro precedentemente tagliati e puliti in cinque diversi pozzi più vicini al centro.Riempire ogni pozzo recante un pezzo di vetro con 100 microlitri di soluzione di cloruro di calcio preparato con acqua distillata tripla ad un gradiente crescente di 10, 20, 30, 40 e 50 concentrazioni millimolari. Successivamente, forare la copertura di ciascuno dei pozzali contenenti carbonato di ammonio tre volte con un ago. Rimettere il coperchio indietro, sigillare i bordi con pellicola di paraffina e tenerlo a 18 gradi Celsius in un'incubatrice per 20 ore.Durante l'incubazione, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e anidride carbonica, che si diffondono in soluzioni di cloruro di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di calcio. Dopo l'incubazione, aprire accuratamente il coperchio all'interno di una cappa dei fumi e utilizzare un anello per rimuovere i cristalli formatisi nell'interfaccia acqua-aria. Utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi di vetro in un becher contenente acqua distillata doppia per un breve tuffo.Quindi, rimuovere i campioni dal becher e utilizzare il nastro a doppia mano per fissare i pezzi di vetro sul fondo della piastra di Petri. Asciugare l'acqua eccessiva toccando i bordi dello scivolo, con salviette tissutali. Coprire la piastra di Petri e posizionare in un essiccatore per 24 ore.Osservare i cristalli formati sui pezzi di vetro con un microscopio ottico verticale a 10-40 volte l'ingrandimento. I cristalli rommboedri osservati sono molto probabilmente calcite. Se oltre ai cristalli romboedrici, la soluzione contiene cristalli sferici che sono molto probabilmente vaterite, ripetere il protocollo di cristallizzazione, assicurandosi che la fase di pulizia sia eseguita correttamente.Inoltre, assicurarsi che non vi sia carbonato di ammonio in aree della piastra diverse dai pozzi dedicati. La concentrazione ottimale per il cloruro di calcio è determinata in base al campione ricco di cristalli di calcite sfaccettati lisci senza cristalli di vaterite. Per iniziare, pulire vetrini e vetrerie come fatto in precedenza.In una cappa aspirante, posizionare la polvere di carbonato di ammonio negli angoli di una piastra da 96 po '. In ogni pozzo in cui si verificheranno precipitazioni, posizionare un pezzo di vetro che è stato tagliato e pulito. Preparare i pozzi di controllo.In due pozzi di controllo, pipetta 90 microlitri di 25 millimolare Tris buffer a pH 8, integrati con cloruro di sodio 100 millimolare. Quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione di 0,5 molare di cloruro di calcio. Quindi, regolare la concentrazione di proteina additiva TapA a 10 tapa micromolare, cloruro di sodio millimolare 100 millimolare e tampone Tris millimolare a pH 8.Preparare l'additivo contenente pozzi aggiungendo 90 microlitri della soluzione additiva. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio molare all'additivo contenente pozzi per raggiungere la concentrazione ottimale a 50 millimolare di cloruro di calcio determinato in precedenza. Preparare la piastra con fori sul coperchio su pozzi contenenti carbonato di ammonio e incubare a 18 gradi Celsius come fatto in precedenza.Dopo l'incubazione, preparare i pezzi di vetro in una piastra di Petri come fatto prima e mettere il piatto in un essiccatore per 24 ore. Per quantificare la percentuale di massa degli additivi nel carbonato di calcio precipita, verificare innanzitutto il coefficiente di estinzione dell'additivo utilizzato. Quindi, utilizzare un microbilanciamento per pesare i pezzi di vetro in cui si sono formati i cristalli.Successivamente, raschiare i cristalli dal vetro in un tubo eppe con 1,2 millilitri di soluzione di acido acetico molare 0,1. Vortice brevemente, quindi posizionare il tubo in un sonicatore per sonicare il campione fino a quando i cristalli scompaiono. Conservare il campione a temperatura ambiente per 24 ore.Pesare lo scivolo di vetro dopo aver raschiato i cristalli. Misurare l'assorbanza UV A della soluzione sonicata da 1,2 millilitri a 280 nanometri per l'additivo proteico. Usa l'equazione di Beer-Lambert per calcolarne la concentrazione c.L è il percorso ottico all'interno della cuvetta. Per calcolare la massa degli additivi nel cristallo, utilizzare l'equazione, c per v è uguale a m, se la concentrazione è in milligrammi per millilitro. Se la concentrazione è in talpe per litro, calcolare le talpe applicando c per v uguale a n.Quindi utilizzare il peso molecolare per calcolare la massa degli additivi. Calcolare la percentuale di peso degli additivi nei cristalli. M è la massa degli additivi, e delta m s, è la massa dei cristalli di carbonato di calcio che sono stati raschiati dal pezzo di vetro.Le immagini SEM mostrano il confronto tra un controllo corretto con facce di calcite lisce e cristalli di calcite con facce composte da gradini. I cristalli sferici sono vaterite. Gli esperimenti di controllo riusciti e non riusciti portarono alla spettroscopia Raman, mostrando rispettivamente gli spettri tipici della calcite e della vaterite.La divisione dello spostamento raman a circa 1080 per centimetro è la caratteristica più evidente della vaterite. I cristalli di carbonato di calcio formatisi in presenza di TapA, sono distinti dai cristalli di controllo. Si formò un complesso assemblaggio sferico di carbonato di calcio, composto da più microcristalli di calcite.Lo spettro Raman dei cristalli formatisi in presenza di TapA, è simile allo spettro della calcite. Gli spettro assorbenti del TapA, e il controllo senza l'additivo, sono stati misurati in seguito alla dissoluzione dei cristalli nell'acido. La percentuale di massa di TapA è stata determinata in 1,8 più o meno 0,2%È fondamentale seguire attentamente le fasi di pulizia e assicurarsi che gli standard di controllo siano soddisfatti prima di testare l'effetto degli additivi sulla formazione di carbonato di calcio.Inoltre, è importante rimuovere qualsiasi eccesso di carbonato di ammonio in polvere dai pozzi. Il carbonato di ammonio si decompone in ammoniaca e anidride carbonica. L'ammoniaca è tossica se inalato e, pertanto, il carbonato di ammonio deve essere maneggiato solo all'interno di una cappa aspirante.Per valutare la morfologia interna e la struttura dei cristalli, è possibile sescolarli utilizzando un fascio ionico focalizzato, immaginare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione e misurare i modelli della diffrazione elettronica da posizioni specifiche lungo le sezioni. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per studiare l'effetto di varie molecole sulla morfologia e sulla struttura del carbonato di calcio. Abbiamo elaborato questo metodo ai biopolimeri prodotti da cellule batteriche nei biofilm.Sarà interessante eseguire ulteriori studi con altri biopolimeri prodotti da diversi ceppi batterici.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l&#39;uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Ricerca

Chimica

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

Influenza di ibridi metodi di fabbricazione perovskite sulla formazione cinematografica, struttura elettronica e le prestazioni delle celle solari

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Rimodellamento della membrana di vescicole giganti in risposta a gradienti di ioni calcio localizzata

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Imaging di fotoelettroni di anioni illustrato da 310 Nm distaccamento di F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame dell'oro

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...