Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
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著者らは、リア・アダディ教授、ジョナサン・エレス教授、ヤエル・ポリティ博士に実りある議論をしてくださったことに感謝したいと思います。この研究は、イスラエル科学財団(ISF)、助成金1150/14によって支援されています。

1. 炭酸カルシウム結晶化
<ol><li>制御の準備と最適化
	<ol><li>きれいなガラス片を準備します。同じクリーニング手順を使用して、ガラス製品をクリーニングします。<ol>
<li>ダイヤモンドペンを使用して、ガラス顕微鏡スライドの断片を96ウェルプレートの井戸に収まるようにします。 注:5ミリメートルx 5ミリメートルの部分は、主にフィットする必要があります。</li>
			<li>ガ?...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. 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L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. 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ここで説明する方法は、有機添加物の存在下で炭酸カルシウム結晶を形成し、インビトロで炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する有機生体高分子の影響を評価することを目的としている。この方法は、有機添加物の存在下で形成された結晶と対照実験で形成された石灰質結晶との比較に基づいている。拡散法を用いて炭酸カルシウム結晶を形成する方法、光学顕微鏡と電子顕微鏡を?...

バイオミネラリゼーションは、有機分子の存在下での鉱物の形成であり、多くの場合、生物の機能的および/または構造的役割に関連する。バイオミネラリゼーションは、磁気細菌1内のマグネタイトの形成のように細胞内であってもよいが、細胞外、ウニスパイク2における炭酸カルシウムの形成のように、コラーゲンに関連するヒドロキシアパタイトの骨3と歯4のアメロゲニンに関連するエナメル質の.バイオミネラリゼーションは、生物の多くのパラメータに依存する複雑なプロセスです。したがって、検討中のシステムを簡素化するためには、工程に対する別個の成分の影響を評価する必要がある。多くの場合、バイオミネラリゼーションは細胞外生体高分子の存在によって誘導される。ここで提示される方法の目的は、(1)インビトロで単離された生体高分子の存在下で炭酸カルシウム結晶を形成し、蒸気拡散法を用いる。(2)生体高分子が炭酸カルシウムの形態及び構造に及ぼす影響を研究する。
有機添加物の存在下でインビトロで炭酸カルシウムを沈殿させる3つの主要な方法が5,6を使用する。我々が溶液法として言及する最初の方法は、カルシウムの可溶性塩(例えば、CaCl2)と炭酸の可溶性塩(例えば、炭酸ナトリウム)を混合することに基づいている。混合プロセスは、いくつかの方法で行われてもよい:多孔質膜7によって分離された3つの細胞を有する反応器内。ここで、各外部細胞は可溶性塩を含み、中央細胞は試験対象の添加剤を含む溶液を含有する。カルシウムと炭酸塩が外側から中間細胞に拡散し、カルシウムと炭酸塩の濃度が溶解性を超えると可溶性の低い炭酸カルシウムの沈殿が生じ、K sp= [Ca 2+][CO3]2-]。追加の混合方法は、二重ジェット手順8である。この方法では、各可溶性塩を別々の注射器から添加剤を含む攪拌溶液に注入し、そこで炭酸カルシウムが沈殿する。ここで、注射およびしたがって混合速度は、混合が拡散によって制御される前の方法とは対照的に、よく制御される。
CaCO3を結晶化するために使用される第2の方法は、キタノ法9である。 この方法は、炭酸塩/水素炭酸塩平衡(2HCO3- (aq)+Ca2+(aq)CaCO <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> 3(s)+CO2(g)+H2O(l))に基づいている。 ここで、CO2を固体形態でCaCO3を含む溶液に泡立て、平衡を左にシフトさせ、炭酸カルシウムを溶解させる。未溶解炭酸カルシウムを濾過し、所望の添加剤を重炭酸塩豊富な溶液に添加します。CO2は次いで蒸発させ、それによって反応を右にシフトさせ、添加剤の存在下で炭酸カルシウムを形成する。
ここで説明する炭酸カルシウム結晶化の第3の方法は、蒸気拡散法10である。このセットアップでは、有機添加剤は、塩化カルシウムの溶液に溶解し、粉末状の炭酸アンモニウム近くの密閉室に配置される。炭酸アンモニウム粉末が二酸化炭素とアンモニアに分解すると、カルシウムイオンを含む溶液に拡散し(例えば、CaCl2)、炭酸カルシウムが析出します(図1参照)。 炭酸カルシウム結晶は、低速沈殿または速い沈殿によって成長することができます。低速沈殿のために、CaCl2溶液中の添加剤を含む溶液を炭酸アンモニウム粉末の隣のデシケータに入れます。プロトコルで長さに記載されている速い沈殿において、添加液と炭酸アンモニウムの両方がマルチウェルプレートに近づけられます。低速の降水法は、より少ない核生成中心とより大きな結晶を生成し、速い沈殿は、より多くの核生成中心と小さな結晶をもたらすでしょう。
上記の方法は、その技術的な複雑さ、制御レベル、および降水プロセスの速度で異なります。混合方法は、ダブルジェットと3セルシステムの両方に特別なセットアップ6を必要とします。混合方法では、他の可溶性カウンターイオン(例えば、Na +、Cl-)6の存在は避けられませんが、キタノ法では、カルシウムおよび(bi)炭酸塩は溶液中の唯一のイオンであり、追加の存在を伴いません。カウンターイオン(例えば、Na+、Cl-)。さらに、混合方法は比較的大量を必要とするため、高価なバイオポリマーの作業には適していません。ダブルジェットの利点は、溶液注入速度を制御することができ、他の方法と比較して迅速なプロセスであることです。
キタノ法と蒸気拡散法の利点は、炭酸カルシウムの形成がCaCl2溶液の中へのCO2の拡散によって制御されるため、より遅い核生成および沈殿プロセスをプローブできることです。11歳,12.さらに、CO2の拡散による炭酸カルシウム形成は、生体内13、14、15における石灰化プロセスに類似してもよい。この方法では、明確に定義された分離された結晶が16に形成される。最後に、炭酸カルシウム形成に対する単一または複数の生体高分子の効果を試験することができる。これにより、炭酸カルシウム形成に対する一連の添加剤濃度の効果の系統的研究と、バイオポリマーの混合物の研究が可能になります。この方法は、添加剤の濃度と量の広い範囲での使用に適しています。使用される最小容積はおよそ50 μLであるため、この方法は利用可能な生体高分子の限られた量がある場合に有利である。最大容積は、より大きなウェルプレートのアクセシビリティ、またはCaCl2を含むプレートまたはビーカーを挿入するデシケータに依存します。以下に説明する方法は、タンパク質TapA17として選択された生体高分子を有する96ウェルプレートで働くために最適化されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

バイオミネラリゼーションは、有機分子の存在下での鉱物の形成であり、多くの場合、生物の機能的および/または構造的役割に関連する。これは複雑なプロセスであり、したがって、単純なインビトロ、システムは、バイオミネラリゼーションプロセスに対する単離分子の影響を理解するために必要とされます。多くの場合、バイオミネラリゼーションは細胞外マトリックス中の生体高分子によって導けられる。単離された生体高分子がインビトロでのカルサイトの形態および構造に及ぼす影響を評価するために、炭酸カルシウムの沈殿、電子顕微鏡検査、マイクロラマンの沈殿に対する蒸気拡散法を用いて特性評価を行い、結晶中の生体高分子の量を測定するための紫外線可視(UV/Vis)吸光度。この方法では、単離された生体高分子を塩化カルシウム溶液に溶解し、固体炭酸アンモニウムの分解に起因する気体アンモニアおよび二酸化炭素に暴露する。炭酸カルシウムの溶解性積に達した条件下で、炭酸カルシウム沈殿物や結晶が形成されます。炭酸カルシウムは、熱力学的安定性が異なる異なる多形を有する:非晶質炭酸カルシウム、バセライト、アラゴネート、およびカルサイト。バイオポリマーが存在しない場合、クリーンな条件下では、炭酸カルシウムは、炭酸カルシウムの最も熱力学的に安定した多形であるカルサイト形態に主に存在する。この方法は、炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する生体高分子添加剤の影響を調べる。ここでは、細胞外細菌タンパク質TapAの研究を通じて、炭酸カルシウム結晶の形成に関するプロトコルを実証する。具体的には、実験設定と、光学顕微鏡や電子顕微鏡、ラマン分光法などの特性解析方法に焦点を当てています。

実験設定の概略図を図 1に示します。簡単に言えば、拡散法は、96ウェルプレートに炭酸カルシウム結晶を形成し、炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する生体高分子の影響を試験するために使用される。これらの実験では、炭酸アンモニウムがアンモニアとCO2に分解され、炭酸カルシウム溶液に拡散し、炭酸カルシウム結晶が形成される(図1</stron...

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Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

生体高分子添加剤の存在下における炭酸カルシウム形成

生体高分子の存在下で形成される炭酸カルシウム結晶の沈殿および特性形成のためのプロトコルについて述べた。

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

我々のプロトコルは、単離分子が炭酸カルシウムの形態および構造に及ぼす影響を研究するための、単純なin vitroシステムを記述する。この技術は、I試験する生体分子が高価である場合、または少量で入手可能である場合、ならびに遅い炭酸カルシウム沈殿が必要な場合に有利である。さらに、同じ条件下で複数の沈殿実験を一度にプローブすることができます。まず、制御実験を準備する。ガラス片やガラス製品を洗浄するために、三重蒸留水とエタノールを使用してください。ダイヤモンドペンを使用して、96ウェルプレートのウェルに収まるように、ガラス顕微鏡スライドの破片をカットします。ガラスの場所を三重蒸留水でビーカーに入れ、水がガラススライドを覆う。10分間バスソニケーターでソニッケート。水をデカントします。ガラススライドを覆うためにエタノールを追加し、10分間バスソニケーターで再び超音波処理します。次に、スライドとガラス製品を窒素ガスの流れで乾燥させ、130ワットで10分間空気プラズマクリーナーに入れます。ヒュームフードで、96ウェルプレートの角にある井戸に炭酸アンモニウム粉末を充填し、アルミホイルを使用してプレートを密封します。箔をパラフィンフィルムで覆います。窒素ガスを使用して残った炭酸アンモニウムを洗浄してください。以前にカットして洗浄したガラス片を、中央に最も近い5つの異なる井戸に入れます。10、20、30、40、および50ミリモル濃度の増加勾配で三重蒸留水で調製された塩化カルシウム溶液の100マイクロリットルでガラス片を持つ各井戸を充填します。次に、炭酸アンモニウムを含む各ウェルのカバーを針で3回穿刺する。蓋を戻し、パラフィンフィルムで国境を密封し、20時間保育器で摂氏18度に保ちます。インキュベーション中、炭酸アンモニウムはアンモニアと二酸化炭素に分解され、塩化カルシウム溶液に拡散し、炭酸カルシウム結晶が形成されます。インキュベーション後、蓋を慎重に煙のフードの内側に開け、ループを使用して水と空気の界面で形成された結晶を取り除きます。ピンセットを使用して、ガラス片を二重蒸留水を含むビーカーに移し、短いディップを行います。次に、ビーカーからサンプルを取り出し、両面テープを使用してガラス片をペトリ皿の底に固定します。乾燥した余分な水は、ティッシュワイプで、スライドの境界に触れる。ペトリ皿を覆い、デシケータに24時間置きます。ガラス片に形成された結晶を、10~40倍の倍率で直立光学顕微鏡で観察します。観察された菱形結晶は、最も可能性の高い方解石である。菱形結晶に加えて、溶液にバテライトである可能性が最も高い球状の結晶が含まれている場合は、結晶化プロトコルを繰り返し、洗浄ステップが正しく実行されていることを確認します。また、専用のウェル以外のプレートの領域に炭酸アンモニウムがないことを確認してください。塩化カルシウムの最適濃度は、バテライト結晶のない滑らかなファセットカルサイト結晶を豊富に含むサンプルに従って決定されます。まず、以前のようにガラススライドとガラス製品をきれいにしてください。ヒュームフードに炭酸アンモニウムパウダーを96ウェルプレートの角に置きます。降水が発生する各井戸に、カットされ、洗浄されたガラス片を配置します。コントロールウェルを準備します。2つの対照ウェルに、ピペット90マイクロリットルの25ミリモルトリスバッファーをpH8で、100ミリモル塩化ナトリウムを補う。その後、0.5モル塩化カルシウムストック溶液の10マイクロリットルを加えます。次に、添加タンパク質TapAの濃度を10ミクロモルTapA、100ミリモル塩化ナトリウム、および25ミリモルトリスバッファーpH8に調整します。添加液を90マイクロリットル添加して、ウェルを含む添加物を調製します。10マイクロリットルの0.5モル塩化カルシウムストック溶液を含む添加物に添加物に加え、以前に決定した50ミリモルの塩化カルシウムで最適濃度に達します。炭酸アンモニウムを含む井戸の上にカバーに穴を開けてプレートを準備し、以前に行われたように摂氏18度でインキュベートします。インキュベーション後、前に行われたようにペトリ皿にガラス片を準備し、24時間乾燥機に皿を置きます。炭酸カルシウム沈殿物中の添加剤の質量割合を定量化するために、まず使用する添加剤の消毒係数を確認する。次に、マイクロバランスを使用して、結晶が形成されたガラス片の重量を量る。その後、ガラスから0.1モル酢酸溶液の1.2ミリリットルのエッペチューブに結晶を削り取ります。渦を短時間、その後、結晶が消えるまでサンプルを超音波処理するために超音波処理器にチューブを配置します。試料を室温で24時間保存します。結晶を削り取った後、ガラススライドの重量を量ります。タンパク質添加剤用の280ナノメートルで1.2ミリリットル超音波処理溶液のUV吸光度Aを測定します。ビール-ランバート方程式を使用して、その濃度cを計算します。Lはキュベット内部の光路である。結晶中の添加剤の質量を計算するには、濃度がミリリットル当たりミリグラムである場合、c回vはmに等しい式を使用する。濃度が1リットル当たりのモルである場合、c倍vがnに等しいモルを計算する。その後、分子量を使用して添加剤の質量を計算します。結晶中の添加剤の重量パーセントを計算します。Mは添加剤の質量であり、デルタmsと、ガラス片から削り取った炭酸カルシウム結晶の質量である。SEM 画像は、滑らかな方解体の面を使用した適切なコントロールと、ステップで構成される面を持つ方解石結晶の比較を示しています。球形の結晶はバテライトです。成功した対照実験と成功した制御実験は、ラマン分光法をもたらし、それぞれ解石とバテライトの典型的なスペクトルを示した。約1080センチメートルでラマンシフトの分割は、バテライトの最も明白な特徴です。TapAの存在下で形成される炭酸カルシウムの結晶は、対照結晶とは異なる。複雑な球状炭酸カルシウムアセンブリ体を、複数の方解石マイクロ結晶から構成して形成した。TapAの存在下で形成される結晶のラマンスペクトルは、方解石のスペクトルに類似している。TapAの吸収性スペクトルを、添加剤を含まない制御と、酸中の結晶の溶解後に測定した。TapAの質量パーセントは1.8プラスマイナス0.2%であると判断された洗浄工程に注意深く従い、炭酸カルシウムの形成に対する添加剤の効果をテストする前に、制御基準が満たされていることを確認することが重要です。さらに、粉末状の炭酸アンモニウムをウェルから除去することが重要です。炭酸アンモニウムはアンモニアと二酸化炭素に分解します。アンモニアは吸入すると有毒であり、したがって、炭酸アンモニウムはヒュームフードの中でのみ処理する必要があります。結晶の内部形態や構造を評価するために、焦点を合わせたイオンビームを使用して断面し、透過型電子顕微鏡で断面を画像化し、断面に沿って特定の場所から電子回折のパターンを測定することができます。この技術は、これまで、炭酸カルシウムの形態および構造に対する様々な分子の影響を研究するために使用されてきた。この方法を、バイオフィルムで細菌細胞によって生成されるバイオポリマーに詳しく説明しました。異なる細菌株によって生成される他のバイオポリマーとの追加の研究を行うことが興味深いでしょう。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

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One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

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Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

製膜上のハイブリッドペロブスカイト製造方法、電子構造、および太陽電池の性能に及ぼす影響

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成と評価

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

F− 310 Nm 剥離によって示されている陰イオンの光電子イメージング

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

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Luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々 な立体構造の形成

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...