Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Prof. Lia Addadi, Prof Jonathan Erez, og Dr. Yael politi for fruktbart diskusjoner. Denne forskningen har blitt støttet av den israelske Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.

1. kalsium på krystallisering
<ol><li>Kontrollere klargjøring og optimalisering
	<ol><li>Forbered rent glass stykker. Bruk samme rengjøringsprosedyre for å rengjøre glasset.<ol>
<li>Bruk en diamant penn til å skjære deler av et glass mikroskop lysbilde slik at de passer i en brønn av en 96-brønn plate. Merk: 5 mm x 5 mm deler bør i stor grad passe.</li>
			<li>Plasser glassbitene i et beger med trippel destillert vann (TDW) slik at vannet dekker glass lysbildene og sonikere i et bad sonica...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).</li><li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).</li><li>Page, M. G., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion:+Application+in+Mesocrystal+Assembly.">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth &amp; Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li><li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate.">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li><li>Sedl&#225;k, M., Antonietti, M., C&#246;lfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals.">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li><li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+aragonite+synthesis.">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li><li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asprich+mollusk+shell+protein:+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization.">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li><li>Gehrke, N., C&#246;lfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment.">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth &amp; Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li><li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3.">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li><li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Calcite+(Calcium+Carbonate)+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon.">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527 (1973).</li><li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization.">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li><li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons.">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199 (1978).</li><li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon,+Oncorhynchus+kisutch.">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure.">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li><li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications.">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li><li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mollusc+larval+shell+formation:+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite.">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li><li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaCO3/chitin-whisker+hybrids:+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension.">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583 (2010).</li><li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies.">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li></ol>

Metoden som er beskrevet her er rettet mot forming kalsium på krystaller i nærvær av organiske tilsetningsstoffer og evaluere effekten av organiske biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium på krystaller in vitro. Metoden er basert på sammenligning av krystaller dannet i nærvær av organiske tilsetningsstoffer til kalsitt krystaller dannet i kontrollen eksperimentet. Vi har vist hvordan du bruker Diffusion metode for å danne kalsium, hvordan å karakterisere deres morfologi ved hjelp av optiske og elektron...

Biomineralization er dannelsen av mineraler i nærvær av organiske molekyler, ofte knyttet til funksjonelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Biomineralization kan være intracellulære, som i dannelsen av magnetitt inne magnetotactic bakterier1, eller ekstracellulære, som i dannelsen av kalsium, i sjø Urchin pigger2, av hydroksyapatitt som er relatert med kollagen i Bones3 og emalje som er forbundet med amelogenin i tennene4. Biomineralization er en kompleks prosess som avhenger av mange parametre i den levende organismen. Derfor, for å forenkle systemet under studien, er det nødvendig å evaluere effekten av separate komponenter på prosessen. I mange tilfeller er biomineralization indusert av tilstedeværelsen av ekstracellulære biopolymerer. Formålet med metoden som presenteres her er som følger: (1) for å danne kalsium, og krystaller i nærvær av isolerte biopolymerer in vitro, ved hjelp av en damp diffusjon metode. (2) for å studere effekten av biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium.
Tre viktigste metoder for å fremskynde kalsium, i vitro i nærvær av organiske tilsetningsstoffer brukes5,6. Den første metoden, som vi vil referere til som løsningen metoden, er basert på å blande et løselig salt av kalsium (f. eks CaCl2) med et løselig salt av Blandingsprosessen kan utføres på flere måter: inne i en reaktor med tre celler som er adskilt av porøse membraner7. Her inneholder hver av de ytre cellene et løselig salt og den sentrale cellen inneholder en løsning med tilsetningsstoff som skal testes. Kalsium og overflate diffus fra den ytre til den midterste cellen, noe som resulterer i utfelling av den mindre løselige kalsium-veggen når konsentrasjonene av kalsium og andre overskrider deres løselighet produkt, KSP = [ca2 +] [co3 2-]. En ekstra blanding metoden er dobbel-Jet prosedyre8. I denne metoden injiseres hvert løselig salt fra en separat sprøyte til en rørt løsning som inneholder tilsetningsstoffet, der kalsium precipitates. Her injeksjon og derfor blande hastigheten er godt kontrollert, i motsetning til den forrige metoden der miksing er kontrollert av diffusjon.
Den andre metoden som brukes til å utkrystallisere CaCO3 er den Kitano metoden9. Denne metoden er basert på likevekt/hydrogen-balanse (2HCO3- (AQ) + ca2 +(AQ) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> caco3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Her, CO2 er boblet til en løsning som inneholder caco3 i en solid form, skiftende likevekt til venstre og derfor oppløses av kalsium. Den uoppløste kalsium er filtrert og ønsket tilsetningsstoffer er lagt til bikarbonat-rik løsning. CO2 er da lov til å fordampe, og dermed skiftende reaksjonen til høyre, forming kalsium i nærvær av tilsetningsstoffene.
Den tredje metoden for kalsium på krystallisering, som vi vil beskrive her, er dampen diffusjon metoden10. I dette oppsettet, den organiske tilsetningsstoff, oppløst i en løsning av kalsiumklorid, er plassert i et lukket kammer nær ammonium i pulverform. Når ammonium dekomponerer inn i karbondioksid og ammoniakk, diffus de inn i oppløsningen som inneholder kalsium ioner (f.eks. CaCl2), og det er utløst kalsium (se figur 1 for illustrasjon). Den kalsium med krystaller kan vokse ved langsom nedbør eller ved rask nedbør. For langsom nedbør plasseres en løsning som inneholder tilsetningsstoffet i CaCl2 -løsningen, i en desikator ved siden av ammonium. I den raske nedbøren, beskrevet i lengden i protokollen, er både additiv løsning og ammonium, plassert tettere sammen i en multi-brønn plate. Den langsomme nedbørs metoden vil produsere færre kjerne sentre og større krystaller, og den raske nedbøren vil føre til mer kjernedannelse sentre og mindre krystaller.
Metodene som er beskrevet ovenfor, varierer i deres tekniske kompleksitet, i nivået av kontroll og i hastigheten på nedbørs prosessen. Blandings metoden krever et spesielt oppsett6 for både dobbel stråle og tre celle system. I miksing metoden, tilstedeværelsen av andre oppløselige Counter ioner (f. eks na+, CL-)6 er uunngåelig, mens i Kitano metoden, kalsium og (BI) er de eneste ioner i løsningen, og det innebærer ikke tilstedeværelsen av ytterligere (f. eks na+, CL-). Videre, blande metoden krever relativt store volumer og derfor er det ikke egnet for å arbeide med dyre biopolymerer. Fordelen med dobbel stråle er at det er mulig å kontrollere frekvensen av løsnings injeksjon og at det er en rask prosess i forhold til andre metoder.
Fordelen med Kitano metoden og damp diffusjon metoden er at dannelsen av kalsium er kontrollert av diffusjon av CO2 inn/ut av en CaCl2 -løsning, og dermed tillater å undersøke tregere kjernedannelse og utfelling prosesser 11 flere , 12. Videre kan kalsium-formasjonen ved diffusjon av co2 ligne forkalkning prosesser i vivo13,14,15. I denne metoden, veldefinerte og separerte krystaller dannes16. Til sist kan effekten av enkelt-eller fler biopolymerer på dannelse av kalsium, testes. Dette gjør det mulig med en systematisk studie av effekten av en rekke tilsetnings konsentrasjoner på kalsium og en studie av blandinger av biopolymerer-alt utført på en kontrollert måte. Denne metoden er egnet for bruk med et stort utvalg av konsentrasjoner og mengder tilsetningsstoffer. Minimalt volum som brukes er omtrent 50 μL, og derfor er denne metoden fordelaktig når det er en begrenset mengde av de tilgjengelige biopolymerer. Det maksimale volumet avhenger av tilgjengeligheten til en større brønn plate, eller desikator som platen eller begeret med CaCl2 skal settes inn i. Metoden som er beskrevet nedenfor er optimalisert for arbeid i en 96-brønn plate med en Biopolymer valgt å være proteinet tapas17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

Biomineralization er dannelsen av mineraler i nærvær av organiske molekyler, ofte knyttet til funksjonelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Det er en kompleks prosess og derfor en enkel, in vitro, systemet er nødvendig for å forstå effekten av isolerte molekyler på biomineralization prosessen. I mange tilfeller er biomineralization regissert av biopolymerer i ekstracellulære matrise. For å evaluere effekten av isolerte biopolymerer på morfologi og struktur av kalsitt in vitro, har vi brukt damp diffusjon metode for utfelling av kalsium, skanning elektron mikroskopi og mikro Raman for karakterisering, og ultrafiolett-synlig (UV/Vis) absorbansen for å måle mengden av en Biopolymer i krystaller. I denne metoden, utsetter vi den isolerte biopolymerer, oppløst i en kalsiumklorid løsning, til gass ammoniakk og karbondioksid som kommer fra nedbryting av solide ammonium. Under de forhold hvor løselighet produktet av kalsium er nådd, dannes kalsium precipitates og krystaller. Kalsium har forskjellige polymorphs som avviker i deres termodynamisk stabilitet: amorfe kalsium, vaterite, Aragonitt og kalsitt. I fravær av biopolymerer, under rene forhold, er kalsium, hovedsakelig til stede i kalsitt form, som er den mest termodynamisk stabile polymorf av kalsium. Denne metoden undersøker effekten av biopolymeric tilsetningsstoffer på morfologi og struktur av kalsium, og krystaller. Her demonstrerer vi protokollen gjennom studiet av et ekstracellulære bakterie protein, tapas, på dannelsen av krystaller med kalsium. Nærmere bestemt fokuserer vi på den eksperimentelle satt opp, og karakterisering metoder, for eksempel optiske og elektron mikroskopi samt Raman spektroskopi.

En skjematisk av den eksperimentelle satt opp er vist i figur 1. Kort, er Diffusion metoden som brukes for å danne kalsium kilt krystaller i 96-brønn plater og teste effekten av biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium med krystaller. I disse eksperimentene deles ammonium inn i ammoniakk og CO2, som diffus i løsninger for kalsium, noe som resulterte i dannelse av kalsium-krystaller (figur 1 og figur 2).
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives at JoVE.com

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Kalsium skrive formasjon i nærvær av Biopolymeric tilsetningsstoffer

Vi beskriver en protokoll for nedbør og karakterisering av kalsium og krystaller som dannes i nærvær av biopolymerer.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Vår protokoll beskriver et enkelt in vitro-system, for å studere effekten av isolerte molekyler på morfologien og strukturen av kalsiumkarbonat. Denne teknikken er en fordel i tilfeller der biomolekylene jeg tester er dyre, eller tilgjengelige i små mengder, samt når langsom kalsiumkarbonatnedbørning er nødvendig. Videre gjør det mulig å sondere flere nedbørseksperimenter under de samme forholdene samtidig.Først forberede kontrolleksperimentet. Bruk trippel destillert vann og etanol til å rengjøre glassbiter og glass. Bruk en diamantpenn til å kutte biter av et glassmikroskopsklie, slik at de får plass i en brønn på en 96-brønns plate.Legg glasset i et beger med trippel destillert vann, slik at vannet dekker glassskliene. Sonicate i et bad sonicator i 10 minutter. Dekanter vannet.Tilsett etanol for å dekke glassskliene, og soniker igjen i en bade sonicator i 10 minutter. Tørk deretter lysbildene og glasset med en strøm av nitrogengass, og legg dem i en luftplasmarenser i 10 minutter ved 130 watt. I en røykhette fyller du brønnene i hjørnene på en 96-brønns plate med ammoniumkarbonatpulver, og forsegler platen ved hjelp av aluminiumsfolie.Dekk folien med parafinfilm. Rengjør eventuelle gjenværende ammoniumkarbonat ved hjelp av nitrogengass. Plasser de tidligere kuttede og rengjorte glassbitene i fem forskjellige brønner nærmest sentrum.Fyll hver brønn bærer et glassstykke med 100 mikroliter kalsiumklorid løsning tilberedt med trippel destillert vann ved en økende gradient på 10, 20, 30, 40, og 50 millimolar konsentrasjoner. Deretter punkterer du dekselet på hver av brønnene som inneholder ammoniumkarbonat tre ganger med en nål. Sett lokket tilbake, forsegle grensene med parafinfilm, og hold det på 18 grader Celsius i en inkubator i 20 timer.Under inkubasjonen brytes ammoniumkarbonat ned i ammoniakk og karbondioksid, som sprer seg til kalsiumkloridløsninger, noe som resulterer i dannelsen kalsiumkarbonatkrystaller. Etter inkubasjonen åpner du lokket forsiktig inne i en røykhette, og bruk en løkke for å fjerne krystallene som dannes ved vannluftgrensesnittet. Bruk pinsett til å overføre glassbitene til et beger som inneholder dobbelt destillert vann for en kort dukkert.Fjern deretter prøvene fra begeret, og bruk dobbeltsidig tape for å feste glassbitene på bunnen av petriskålen. Tørt overdrevent vann som berører lysbildets grenser, med vevsservietter. Dekk petriskålen, og legg den i en desiccator i 24 timer.Vær oppmerksom på krystallene som dannes på glassbitene med et oppreist optisk mikroskop ved 10 til 40 ganger forstørrelse. De observerte rhombohedralkrysteriene er mest sannsynlig kalser. Hvis i tillegg til rhombohedral krystaller, inneholder løsningen sfæriske krystaller som er mest sannsynlig vaterite, gjenta krystalliseringsprotokollen, og pass på at rengjøringstrinnet utføres riktig.Videre må du sørge for at det ikke er ammoniumkarbonat i andre områder av platen enn de dedikerte brønnene. Den optimale konsentrasjonen for kalsiumklorid bestemmes i henhold til prøven rik med glatte faserte kalsittkrystaller uten vateritekrystaller. For å begynne, rengjør glass lysbilder og glass som gjort tidligere.I en røykhette plasserer du ammoniumkarbonatpulver i hjørnene på en 96-brønns plate. I hver brønn hvor nedbør vil skje, plasser et glassstykke som ble kuttet og rengjort. Forbered kontrollbrønnene.I to kontrollbrønner, pipette 90 mikroliter på 25 millimolar Tris buffer ved pH 8, supplert med 100 millimolar natriumklorid. Tilsett deretter 10 mikroliter med 0,5 molar kalsiumklorid lagerløsning. Deretter justerer du konsentrasjonen av additivprotein TapA til 10 mikromolar TapA, 100 millimolar natriumklorid og 25 millimolar Tris buffer ved pH 8.Forbered tilsetningsstoffet som inneholder brønner ved å tilsette 90 mikroliter av additivløsningen. Tilsett 10 mikroliter med 0,5 molarkalsiumkloridlagerløsning til tilsetningsstoffet som inneholder brønner for å nå den optimale konsentrasjonen ved 50 millimolar kalsiumklorid bestemt tidligere. Forbered platen med hull på dekselet over brønner som inneholder ammoniumkarbonat, og inkuber ved 18 grader Celsius som tidligere gjort.Etter inkubasjon, forberede glassbitene i en petriskål som gjort før, og legg parabolen i en desiccator i 24 timer. For å kvantifisere masseprosenten av tilsetningsstoffene i kalsiumkarbonatutfellingene, må du først kontrollere utryddelseskoeffisienten til tilsetningsstoffet som brukes. Deretter bruker du en mikrobalanse til å veie glassbitene der krystallene dannes.Deretter skraper du krystallene av glasset til et epperør med 1,2 milliliter 0,1 molar eddiksyreoppløsning. Vortex kort, og deretter plassere røret i en sonicator å sonicate prøven til krystallene forsvinner. Oppbevar prøven ved romtemperatur i 24 timer.Vei glasssklien etter skraping av krystallene. Mål UV-absorbansen A av den 1,2 milliliter sonikerte oppløsningen ved 280 nanometer for proteintilsetningsstoffet. Bruk Øl-Lambert-ligningen til å beregne konsentrasjonen c.L er den optiske banen inne i cuvette. For å beregne massen av tilsetningsstoffene i krystallen, bruk ligningen, c ganger v er lik m, hvis konsentrasjonen er i milligram per milliliter. Hvis konsentrasjonen er i mol per liter, må du beregne molene som bruker c ganger v er lik n.Bruk deretter den molekylære vekten til å beregne massen av tilsetningsstoffene. Beregn vektprosenten av tilsetningsstoffene i krystallene. M er massen av tilsetningsstoffene, og delta m s, er massen av kalsiumkarbonatkrys krystaller som ble skrapt av glassstykket.SEM-bilder viser sammenligningen mellom en riktig kontroll med glatte kalsituttansikter, og kalserer krystaller med ansikter sammensatt av trinn. De sfæriske krystallene er vaterite. De vellykkede og mislykkede kontrolleksperimentene resulterte i Raman-spektroskopi, som viste den typiske spektra av henholdsvis kalsitt og vaterite.Splitten av Raman-skiftet på rundt 1080 per centimeter er den mest åpenbare egenskapen til vaterite. Krystallene av kalsiumkarbonat dannet i nærvær av TapA, er forskjellig fra kontrollkrys krystallene. En kompleks sfærisk kalsiumkarbonatenhet, bestående av flere kalsitmikrokrystaller ble dannet.Raman spekteret av krystaller dannet i nærvær av TapA, ligner på spekteret av kalsitt. De absorberende spekterene av TapA, og kontrollen uten tilsetningsstoff, ble målt etter oppløsning av krystallene i syre. Masseprosenten av TapA var fastslått å være 1,8 pluss eller minus 0,2%Det er viktig å følge rengjøringstrinnene nøye, og for å sikre at kontrollstandardene er oppfylt før de tester tilsetningsstoffenes effekt på dannelsen av kalsiumkarbonat.I tillegg er det viktig å fjerne overflødig ammoniumkarbonat i pulverisert form fra brønnene. Ammoniumkarbonat brytes ned til ammoniakk og karbondioksid. Ammoniakk er giftig ved innånding, og derfor bør ammoniumkarbonat kun håndteres inne i en røykhette.For å evaluere krystallenes indre morfologi og struktur, kan du dele dem ved hjelp av en fokusert iionstråle, bilde seksjonene med et transmisjonselektronmikroskop og måle elektrondiffraksjonens mønstre fra bestemte steder langs seksjonene. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å studere effekten av ulike molekyler på morfologi og struktur av kalsiumkarbonat. Vi har utarbeidet denne metoden til biopolymerer som produseres av bakterielle celler i biofilmer.Det vil være interessant å utføre flere studier med andre biopolymerer produsert av forskjellige bakterielle stammer.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrobølgeovn-assistert funksjon av Poly (etylenglykol) og On-resin Peptider for bruk i Chain polymerisasjoner og hydrogeldannelse

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomerking og Kvantifisering av Cellular Nivåer av Phosphoinositides ved HPLC-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av Plant Wall Heteroxylans Bruke enzymic, Chemical (Metylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Influence of Hybrid Perovskite Fabrication Methods on Film Formation, Electronic Structure, and Solar Cell Performance

Påvirkning av Hybrid perovskitt fabrikasjon metoder på filmdannelse, Elektronisk struktur og Solar Cell Ytelse

Hybrid organic/inorganic halide perovskites have lately been a topic of great interest in the field of solar cell applications, with the potential to ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Syntese og evaluering av en Ruthenium-baserte mitokondrie kalsium opptak hemmer

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membran ombygging av gigantiske blemmer svar på lokaliserte kalsium Ion graderinger

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron avbildning av anioner illustrert av 310 Nm avdeling av F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of GoldIII

Luminophore formasjon i ulike konformasjonen av bovin Serum Albumin ved Binding av Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...