Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Prof. lia Addadi, Prof. Jonathan Erez, e ao Dr. Yael Politi por discussões frutíferas. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de ciência israelense (ISF), conceder 1150/14.

1. cristalização do carbonato de cálcio
<ol><li>Preparação e otimização de controle
	<ol><li>Prepare peças de vidro limpas. Use o mesmo procedimento de limpeza para limpar os copos.<ol>
<li>Use uma pena do diamante para cortar partes de uma corrediça de vidro do microscópio de modo que caiam em um poço de uma placa 96-well. Nota: 5 mm x 5 mm peças devem caber em grande parte.</li>
			<li>Coloc as partes de vidro em um copo com água destilada tripla (TDW) de modo que a água cubra as cor...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals.">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth &amp; Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li><li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein.">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li><li>Gauldie, R. W., Sharma, S. 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O método aqui descrito destina-se a formar cristais de carbonato de cálcio na presença de aditivos orgânicos e avaliar o efeito de biopolímeros orgânicos na morfologia e estrutura de cristais de carbonato de cálcio in vitro. O método é baseado na comparação dos cristais formados na presença dos aditivos orgânicos aos cristais de calcita formados no experimento de controle. Nós mostramos como usar o método de difusão para formar os cristais de carbonato de cálcio, como caracterizar sua morfologia usando m...

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. A biomineralização pode ser intracelular, como na formação de magnetita dentro de bactérias magnetotáticas1, ou extracelular, como na formação de carbonato de cálcio em picos de ouriço-do-mar2, de hidroxiapatita que está relacionada com colágeno em ossos3 e do esmalte que está associado com amelogenina nos dentes4. A biomineralização é um processo complexo que depende de muitos parâmetros no organismo vivo. Portanto, a fim de simplificar o sistema em estudo, é necessário avaliar o efeito de componentes separados no processo. Em muitos casos, a biomineralização é induzida pela presença de biopolímeros extracelulares. O objetivo do método aqui apresentado é o seguinte: (1) formar cristais de carbonato de cálcio na presença de biopolímeros isolados in vitro, utilizando um método de difusão de vapor. (2) estudar o efeito dos biopolímeros na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio.
São utilizados três métodos principais para precipitar o carbonato de cálcio in vitro na presença de aditivos orgânicos5,6. O primeiro método, que vamos referir como o método de solução, é baseado na mistura de um sal solúvel de cálcio (por exemplo, CaCl2) com um sal solúvel de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio). O processo de mistura pode ser realizado de várias maneiras: dentro de um reator com três células separadas por membranas porosas7. Aqui, cada uma das células exteriores contém um sal solúvel e a célula central contém uma solução com o aditivo a ser testado. O cálcio e o carbonato difuso do exterior à pilha média, tendo por resultado a precipitação do carbonato de cálcio menos solúvel quando as concentrações de cálcio e de carbonato excedem seu produto da solubilidade, KSP = [Ca2 +] [co3 2-]. Um método de mistura adicional é o procedimento de jato duplo8. Neste método, cada sal solúvel é injetado a partir de uma seringa separada para uma solução agitada contendo o aditivo, onde o carbonato de cálcio precipita. Aqui, a injeção e, portanto, a taxa de mistura é bem controlada, em contraste com o método anterior, onde a mistura é controlada pela difusão.
O segundo método usado para cristalizar CaCO3 é o método Kitano9. Este método baseia-se no equilíbrio carbonato/carbonato de hidrogênio (2HCO3- (AQ) + CA2 +(AQ) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> caco3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Aqui, o CO2 é borbulhado em uma solução contendo caco3 em uma forma sólida, deslocando o equilíbrio para a esquerda e, portanto, dissolvendo o carbonato de cálcio. O carbonato de cálcio não dissolvido é filtrado e os aditivos desejados são adicionados à solução rica em bicarbonato. O CO2 é então autorizado a evacir, deslocando assim a reacção à direita, formando carbonato de cálcio na presença dos aditivos.
O terceiro método de cristalização do carbonato de cálcio, que descreveremos aqui, é o método de difusão de vapor10. Nesta set-up, o aditivo orgânico, dissolvido em uma solução de cloreto de cálcio, é colocado em uma câmara fechada perto de carbonato de amônio em forma de pó. Quando o pó de carbonato de amônio se decompõe em dióxido de carbono e amônia, eles se difusas na solução contendo íons de cálcio (por exemplo, CaCl2), e o carbonato de cálcio é precipitado (ver Figura 1 para ilustração). Os cristais do carbonato de cálcio podem crescer pela precipitação lenta ou pela precipitação rápida. Para a precipitação lenta, uma solução que contenha o aditivo na solução de CAcl2 é coloc em um exsicador ao lado do pó do carbonato de amónio. Na precipitação rápida, descrita de comprimento no protocolo, tanto a solução aditiva quanto o carbonato de amônio são colocados mais próximos em uma placa de múltiplos poços. O método de precipitação lenta produzirá menos centros de nucleação e cristais maiores, e a precipitação rápida resultará em mais centros de nucleação e cristais menores.
Os métodos descritos acima diferem em sua complexidade técnica, no nível de controle e na taxa do processo de precipitação. O método de mistura requer uma set-up especial6 para o jato duplo e o sistema de três células. No método de mistura, a presença de outros íons contrários solúveis (por exemplo, na+, CL-)6 é inevitável, enquanto que no método Kitano, o cálcio e (BI) carbonato são os únicos íons em solução e não envolve a presença de adicionais contra íons (por exemplo, na+, CL-). Além disso, o método de mistura requer volumes relativamente grandes e, portanto, não é adequado para trabalhar com biopolímeros caros. A vantagem do jato dobro é que é possível controlar a taxa de injeção da solução e que é um processo rápido em comparação com outros métodos.
A vantagem do método de Kitano e o método de difusão de vapor é que a formação de carbonato de cálcio é controlada pela difusão de CO2 em/fora de uma solução CAcl2 , permitindo assim a sonda de nucleação mais lenta e processos de precipitação 11 anos de , 12. Além disso, a formação de carbonato de cálcio por difusão de co2 pode assemelhar-se a processosde calcificação in vivo13,14,15. Neste método, os cristais bem definidos e separados são formados16. Por último, o efeito de biopolímeros únicos ou múltiplos na formação de carbonato de cálcio pode ser testado. Isto permite um estudo sistemático do efeito de uma série de concentrações aditivas na formação de carbonato de cálcio, bem como um estudo de misturas de biopolímeros-todos realizados de forma controlada. Este método é adequado para uso com uma grande variedade de concentrações e volumes de aditivos. O volume mínimo utilizado é de aproximadamente 50 μL e, portanto, este método é vantajoso quando há uma quantidade limitada de biopolímeros disponíveis. O volume máximo depende da acessibilidade de uma placa de poço maior, ou do dessecador em que a placa ou taça contendo CaCl2 devem ser inseridos. O método descrito abaixo foi otimizado para trabalhar em uma placa 96-well com um biopolímero escolhido para ser a proteína TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. É um processo complexo e, portanto, um sistema simples, in vitro, é necessário para compreender o efeito de moléculas isoladas no processo de biomineralização. Em muitos casos, a biomineralização é dirigida por biopolímeros na matriz extracelular. Para avaliar o efeito de biopolímeros isolados na morfologia e estrutura da calcita in vitro, utilizou-se o método de difusão de vapor para a precipitação de carbonato de cálcio, microscopia eletrônica de varredura e micro Raman para a caracterização, e absorvância ultravioleta-visível (UV/VIS) para medir a quantidade de um biopolímero nos cristais. Neste método, expõem-se os biopolímeros isolados, dissolvidos em solução de cloreto de cálcio, a amônia gasosa e dióxido de carbono que se originam da decomposição de carbonato de amônio sólido. Nas condições em que o produto de solubilidade do carbonato de cálcio é atingido, os precipitados de carbonato de cálcio e os cristais são formados. O carbonato de cálcio tem diferentes polimorfos que diferem em sua estabilidade termodinâmico: carbonato de cálcio amorfo, vaterita, aragonita e calcita. Na ausência de biopolímeros, em condições limpas, o carbonato de cálcio está principalmente presente na forma de calcita, que é o polimorfo mais termodinògica estável do carbonato de cálcio. Este método examina o efeito dos aditivos biopoliméricas na morfologia e na estrutura de cristais do carbonato de cálcio. Aqui, demonstramos o protocolo através do estudo de uma proteína bacteriana extracelular, TapA, sobre a formação de cristais de carbonato de cálcio. Especificamente, focamos no conjunto experimental, e métodos de caracterização, tais como microscopia óptica e eletrônica, bem como Espectroscopia Raman.

Um esquema do conjunto experimental é mostrado na Figura 1. Resumidamente, o método de difusão é utilizado para formar cristais de carbonato de cálcio em placas de 96 poços e testar o efeito de biopolímeros na morfologia e estrutura dos cristais de carbonato de cálcio. Nesses experimentos, o carbonato de amônio é decomposto em amônia e CO2, que se difunde em soluções de carbonato de cálcio, resultando na formação de cristais de carbonato de cálcio (<strong class="...

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Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

Descrevemos um protocolo para a precipitação e caracterização de cristais de carbonato de cálcio que se formam na presença de biopolímeros.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Nosso protocolo descreve um simples sistema in vitro, para estudar o efeito de moléculas isoladas na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio. Esta técnica é vantajosa nos casos em que as biomoléculas que eu testam são caras, ou disponíveis em pequenas quantidades, bem como quando a precipitação lenta de carbonato de cálcio é necessária. Além disso, permite sondar múltiplos experimentos de precipitação sob as mesmas condições ao mesmo tempo.Primeiro, prepare o experimento de controle. Use água tripla destilada e etanol para limpar peças de vidro e vidros. Use uma caneta de diamante para cortar pedaços de um slide de microscópio de vidro, de modo que eles se encaixam em um poço de uma placa de 96 poços.Coloque os lugares de vidro em um béquer com água tripla destilada, de modo que a água cubra os slides de vidro. Sonicate em um sonicator de banho por 10 minutos. Decante a água.Adicione etanol para cobrir os slides de vidro, e sonicar novamente em um sônico de banho por 10 minutos. Em seguida, seque as lâminas e os vidros com um fluxo de gás nitrogênio, e coloque-os em um limpador de plasma de ar por 10 minutos a 130 watts. Em um capô de fumaça, encha os poços nas esquinas de uma placa de 96 poços com pó carbonato de amônio, e sele a placa usando papel alumínio.Cubra a folha com filme de parafina. Limpe qualquer carbonato de amônio residual usando gás nitrogênio. Coloque as peças de vidro previamente cortadas e limpas em cinco poços diferentes mais próximos do centro.Encha cada poço com uma peça de vidro com 100 microliters de solução de cloreto de cálcio preparada com água tripla destilada a um gradiente crescente de 10, 20, 30, 40 e 50 concentrações milimonas. Em seguida, puna a tampa de cada um dos poços contendo carbonato de amônio três vezes com uma agulha. Coloque a tampa para trás, sele as bordas com filme de parafina, e mantenha-a a 18 graus Celsius em uma incubadora por 20 horas.Durante a incubação, o carbonato de amônio é decomposto em amônia e dióxido de carbono, que se difundem em soluções de cloreto de cálcio, resultando na formação de cristais carbonato de cálcio. Após a incubação, abra a tampa cuidadosamente dentro de um capô de fumaça e use um laço para remover os cristais formados na interface água-ar. Use pinças para transferir as peças de vidro em um béquer contendo água dupla destilada para um pequeno mergulho.Em seguida, remova as amostras do béquer e use fita dupla face para fixar as peças de vidro na parte inferior da placa de Petri. Seque água excessiva tocando as bordas do escorregador, com lenços umedecidos. Cubra a placa de Petri, e coloque-a em um desiccador por 24 horas.Observe os cristais formados nas peças de vidro com um microscópio óptico vertical de 10 a 40 vezes. Os cristais rombedais observados são provavelmente calcita. Se além dos cristais romboedais, a solução contém cristais esféricos que são provavelmente vaterita, repita o protocolo de cristalização, certificando-se de que a etapa de limpeza seja executada corretamente.Além disso, certifique-se de que não há carbonato de amônio em áreas diferentes dos poços dedicados. A concentração ideal para cloreto de cálcio é determinada de acordo com a amostra rica com cristais de calcita rossados lisos sem cristais de vaterita. Para começar, limpe lâminas de vidro e vidros como feito anteriormente.Em um capô de fumaça, coloque pó de carbonato de amônio nos cantos de uma placa de 96 poços. Em cada poço onde ocorrerá a precipitação, coloque uma peça de vidro que foi cortada e limpa. Prepare os poços de controle.Em dois poços de controle, pipeta 90 microliters de 25 mililitros tris tampão no pH 8, suplementado com cloreto de sódio de 100 mililitros. Em seguida, adicione 10 microliters de 0,5 solução de cloreto de cálcio molar. Em seguida, ajuste a concentração de proteína aditiva TapA para 10 micromolar TapA, 100 mililitro de sódio e 25 milimil tris tampão no pH 8.Prepare o aditivo contendo poços adicionando 90 microliters da solução aditiva. Adicione 10 microliters de 0,5 solução de cloreto de cálcio molar ao aditivo contendo poços para atingir a concentração ideal em cloreto de cálcio de 50 mililitros determinado anteriormente. Prepare a placa com furos na tampa sobre poços contendo carbonato de amônio e incubar a 18 graus Celsius como feito anteriormente.Após a incubação, prepare as peças de vidro em uma placa de Petri como feito antes, e coloque a placa em uma desiccadora por 24 horas. Para quantificar a porcentagem de massa dos aditivos nos precipitados carbonato de cálcio, verifique primeiro o coeficiente de extinção do aditivo utilizado. Em seguida, use um microequilípmo para pesar as peças de vidro onde os cristais se formaram.Depois disso, raspe os cristais do vidro em um tubo de eppe com 1,2 mililitros de solução de ácido acético molar de 0,1. Vórtice brevemente, e, em seguida, coloque o tubo em um sonicator para sonicar a amostra até que os cristais desapareçam. Armazene a amostra em temperatura ambiente por 24 horas.Pese o deslizamento de vidro depois de raspar os cristais. Meça a absorvância UV A da solução sonicada de 1,2 mililitro a 280 nanômetros para o aditivo proteico. Use a equação Beer-Lambert para calcular sua concentração c.L é o caminho óptico dentro da cuvette. Para calcular a massa dos aditivos no cristal, use a equação, c vezes v é igual a m, se a concentração estiver em miligramas por mililitro. Se a concentração estiver em mols por litro, então calcule as verrugas aplicando c vezes v é igual a n.Em seguida, use o peso molecular para calcular a massa dos aditivos. Calcule a porcentagem de peso dos aditivos nos cristais. M é a massa dos aditivos, e delta m s, é a massa dos cristais carbonato de cálcio que foram raspados da peça de vidro.As imagens SEM mostram a comparação entre um controle adequado com rostos calcitas lisos e cristais de calcita com rostos compostos por passos. Os cristais esféricos são vaterite. Os experimentos de controle bem sucedidos e mal sucedidos resultaram em espectroscopia de Raman, mostrando os espectros típicos de calcita e vaterite, respectivamente.A divisão do turno de Raman em torno de 1080 por centímetro é a característica mais evidente do vaterite. Os cristais de carbonato de cálcio formados na presença de TapA, são distintos dos cristais de controle. Foi formado um complexo conjunto esférico de carbonato de cálcio, composto por múltiplos microcristais de calcita.O espectro raman dos cristais formados na presença de TapA, é semelhante ao espectro de calcita. Os espectros absorventes de TapA, e o controle sem o aditivo, foram medidos após a dissolução dos cristais em ácido. A média de Dano foi determinada como sendo 1,8 mais ou menos 0,2% É fundamental seguir as etapas de limpeza cuidadosamente, e garantir que os padrões de controle sejam cumpridos antes de testar o efeito dos aditivos na formação de carbonato de cálcio.Além disso, é importante remover qualquer excesso de carbonato de amônio em pó dos poços. Carbonato de amônio se decompõe em amônia e dióxido de carbono. A amônia é tóxica se inalada e, portanto, o carbonato de amônio deve ser manuseado apenas dentro de um capô de fumaça.A fim de avaliar a morfologia interna e a estrutura dos cristais, você pode secioná-los usando um feixe de íons focalado, imaginar as seções com um microscópio eletrônico de transmissão e medir os padrões da difração eletrônica de locais específicos ao longo das seções. Esta técnica tem sido usada anteriormente para estudar o efeito de várias moléculas na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio. Elaboramos este método para biopolímeros que são produzidos por células bacterianas em biofilmes.Será interessante realizar estudos adicionais com outros biopolímeros produzidos por diferentes cepas bacterianas.

Research

JoVE Journal

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Química

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