Name: calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00
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Los autores desean agradecer a la Prof. Lia Addadi, al Prof. Jonathan Erez y al Dr. Yael Politi por sus fructíferas discusiones. Esta investigación ha sido apoyada por la Fundación Israelí de Ciencia (ISF), subvención 1150/14.

1. Cristalización de carbonato de calcio
<ol><li>Preparación y optimización del control
	<ol><li>Prepare piezas de vidrio limpias. Utilice el mismo procedimiento de limpieza para limpiar la cristalería.<ol>
<li>Utilice una pluma de diamantes para cortar trozos de un portaobjetos de microscopio de vidrio para que quepan en un pozo de una placa de 96 pocillos. NOTA: Las piezas de 5 mm x 5 mm deben encajar en gran medida.</li>
			<li>Coloque las piezas de vidrio en un vaso de precipitados con agua ...

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li><li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase.">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. 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El método descrito aquí está dirigido a la formación de cristales de carbonato de calcio en presencia de aditivos orgánicos y la evaluación del efecto de los biopolímeros orgánicos en la morfología y estructura de los cristales de carbonato de calcio in vitro. El método se basa en la comparación de los cristales formados en presencia de los aditivos orgánicos con los cristales de calcita formados en el experimento de control. Hemos demostrado cómo utilizar el método de difusión para formar los cristales de...

La biomineralización es la formación de minerales en presencia de moléculas orgánicas, a menudo relacionadas con funciones funcionales y/o estructurales en organismos vivos. La biomineralización puede ser intracelular, como en la formaciónde magnetita dentro de las bacterias magnetotácticas 1, o extracelulares, como en la formación de carbonato de calcio en las espigas de erizo de mar2, de hidroxiapatita que está relacionada con el colágeno en huesos3 y de esmalte que se asocia con amelogenina en los dientes4. La biomineralización es un proceso complejo que depende de muchos parámetros en el organismo vivo. Por lo tanto, para simplificar el sistema en estudio, es necesario evaluar el efecto de componentes separados en el proceso. En muchos casos, la biomineralización es inducida por la presencia de biopolímeros extracelulares. El propósito del método aquí presentado es el siguiente: (1) Formar cristales de carbonato de calcio en presencia de biopolímeros aislados in vitro, utilizando un método de difusión de vapor. (2) Estudiar el efecto de los biopolímeros en la morfología y estructura del carbonato de calcio.
Se utilizan tres métodos principales para precipitar el carbonato de calcio in vitro en presencia de aditivos orgánicos5,6. El primer método, al que nos referiremos como método de solución, se basa en mezclar una sal soluble de calcio (por ejemplo, CaCl2) con una sal soluble de carbonato (por ejemplo, carbonato sódico). El proceso de mezcla se puede realizar de varias maneras: dentro de un reactor con tres células separadas por membranas porosas7. Aquí, cada una de las células externas contiene una sal soluble y la célula central contiene una solución con el aditivo que se va a probar. Calcio y carbonato difuso desde el exterior hasta la célula media, lo que resulta en la precipitación del carbonato de calcio menos soluble cuando las concentraciones de calcio y carbonato exceden su producto de solubilidad, Ksp á [Ca2+][CO3 2-]. Un método de mezcla adicionales el procedimiento de doble chorro 8. En este método, cada sal soluble se inyecta de una jeringa separada a una solución agitada que contiene el aditivo, donde se precipita el carbonato de calcio. Aquí, la inyección y por lo tanto la velocidad de mezcla está bien controlada, en contraste con el método anterior donde la mezcla se controla por difusión.
El segundo método utilizado para cristalizar CaCO3 es el método Kitano9. Este método se basa en el equilibrio de carbonato/hidrógeno (2HCO3- (aq) + Ca2+(aq) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO 3(s) + CO 2(g) + H2O (l)). Aquí, el CO2 se burbujea en una solución que contiene CaCO3 en una forma sólida, desplazando el equilibrio a la izquierda y por lo tanto disolviendo el carbonato de calcio. El carbonato de calcio no disuelto se filtra y los aditivos deseados se añaden a la solución rica en bicarbonato. A continuación, se permite que el CO2 se evapore, desplazando así la reacción a la derecha, formando carbonato de calcio en presencia de los aditivos.
El tercer método de cristalización de carbonato de calcio, que describiremos aquí, es el método de difusión de vapor10. En esta configuración, el aditivo orgánico, disuelto en una solución de cloruro de calcio, se coloca en una cámara cerrada cerca del carbonato de amonio en forma de polvo. Cuando el polvo de carbonato de amonio se descompone en dióxido de carbono y amoníaco, se difunden en la solución que contiene iones de calcio (por ejemplo, CaCl2) y se precipita el carbonato de calcio (véase la figura 1 para la ilustración). Los cristales de carbonato de calcio pueden crecer por precipitación lenta o por precipitación rápida. Para la precipitación lenta, una solución que contiene el aditivo en la solución CaCl2 se coloca en un desecador junto al polvo de carbonato de amonio. En la precipitación rápida, descrita en longitud en el protocolo, tanto la solución aditiva como el carbonato de amonio se colocan más cerca en una placa de varios pocillos. El método de precipitación lenta producirá menos centros de nucleación y cristales más grandes, y la precipitación rápida resultará en más centros de nucleación y cristales más pequeños.
Los métodos descritos anteriormente difieren en su complejidad técnica, en el nivel de control y en la velocidad del proceso de precipitación. El método de mezcla requiere una configuración especial6 tanto para el doble chorro como para el sistema de tres celdas. En el método de mezcla, la presencia de otros iones de contador solubles (por ejemplo, Na+, Cl-)6 es inevitable, mientras que en el método Kitano, calcio y (bi) carbonato son los únicos iones en solución y no implica la presencia de contraiones (por ejemplo, Na+, Cl-). Además, el método de mezcla requiere volúmenes relativamente grandes y por lo tanto no es adecuado para trabajar con biopolímeros caros. La ventaja del doble chorro es que es posible controlar la velocidad de inyección de la solución y que es un proceso rápido en comparación con otros métodos.
La ventaja del método Kitano y el método de difusión de vapor es que la formación de carbonato de calcio se controla mediante la difusión de CO2 hacia/fuera de una solución CaCl2, lo que permite sondear procesos de nucleación y precipitación más lentos 11 , 12. Además, la formación de carbonato de calcio por difusión de CO2 puede parecerse a los procesos de calcificación in vivo13,14,15. En este método, se forman cristales bien definidos y separados16. Por último, se puede probar el efecto de uno o varios biopolímeros en la formación de carbonato de calcio. Esto permite un estudio sistemático del efecto de una serie de concentraciones aditivas en la formación de carbonato de calcio, así como un estudio de mezclas de biopolímeros - todos realizados de manera controlada. Este método es adecuado para su uso con una amplia gama de concentraciones y volúmenes de aditivos. El volumen mínimo utilizado es de aproximadamente 50 l y, por lo tanto, este método es ventajoso cuando hay una cantidad limitada de los biopolímeros disponibles. El volumen máximo depende de la accesibilidad de una placa de pozo más grande, o del desecador en el que se va a insertar la placa o vaso de precipitados que contiene CaCl2. El método descrito a continuación ha sido optimizado para trabajar en una placa de 96 pocillos con un biopolímero elegido para ser la proteína TapA17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-19-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ammonium carbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">506-87-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:127px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol Absolute</td>
			<td style="width:127px;">Gadot</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Micro-Raman</td>
			<td style="width:127px;">Renishaw</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Eclipse 90i model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nis elements Br software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FEI Sirion microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Spectrophotometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td></td>
			<td>V-670 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:127px;">Polaron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>SC7640 model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium carbonate formation in the presence of biopolymeric additives

La biomineralización es la formación de minerales en presencia de moléculas orgánicas, a menudo relacionadas con funciones funcionales y/o estructurales en organismos vivos. Es un proceso complejo y por lo tanto se requiere un sistema simple, in vitro, para entender el efecto de las moléculas aisladas en el proceso de biomineralización. En muchos casos, la biomineralización está dirigida por biopolímeros en la matriz extracelular. Con el fin de evaluar el efecto de los biopolímeros aislados en la morfología y estructura de la calcita in vitro, hemos utilizado el método de difusión de vapor para la precipitación de carbonato de calcio, microscopía electrónica de barrido y micro Raman para la caracterización, y la absorbancia ultravioleta-visible (UV/Vis) para medir la cantidad de un biopolímero en los cristales. En este método, exponemos los biopolímeros aislados, disueltos en una solución de cloruro de calcio, a amoníaco gaseoso y dióxido de carbono que se originan a partir de la descomposición del carbonato de amonio sólido. En las condiciones donde se alcanza el producto solubilidad de carbonato de calcio, se precipita el carbonato de calcio y se forman cristales. El carbonato de calcio tiene diferentes polimorfos que difieren en su estabilidad termodinámica: carbonato de calcio amorfo, vaterita, aragonita y calcita. En ausencia de biopolímeros, en condiciones limpias, el carbonato de calcio está presente principalmente en la forma de calcita, que es el polimorfo más estable termodinámicamente del carbonato de calcio. Este método examina el efecto de los aditivos biopoliméricos en la morfología y estructura de los cristales de carbonato de calcio. Aquí, demostramos el protocolo a través del estudio de una proteína bacteriana extracelular, TapA, sobre la formación de cristales de carbonato de calcio. Específicamente, nos centramos en la configuración experimental y los métodos de caracterización, como la microscopía óptica y electrónica, así como la espectroscopia De Raman.

En la Figura 1se muestra un esquema de la configuración experimental. Brevemente, el método de difusión se utiliza para formar cristales de carbonato de calcio en placas de 96 pocillos y probar el efecto de los biopolímeros en la morfología y estructura de los cristales de carbonato de calcio. En estos experimentos, el carbonato deamonio se descompone en amoníaco y CO2, que se difunden en soluciones de carbonato de calcio, lo que resulta en la formación de cristales de carb...

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Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Formación de carbonato de calcio en presencia de aditivos biopoliméricos

Describimos un protocolo para la precipitación y caracterización de cristales de carbonato de calcio que se forman en presencia de biopolímeros.

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Nuestro protocolo describe un sistema simple in vitro, para estudiar el efecto de las moléculas aisladas en la morfología y la estructura del carbonato de calcio. Esta técnica es ventajosa en los casos en que las biomoléculas I prueba son costosas, o disponibles en pequeñas cantidades, así como cuando se requiere precipitación lenta de carbonato de calcio. Además, permite sondear múltiples experimentos de precipitación en las mismas condiciones a la vez.Primero, prepare el experimento de control. Utilice agua triple destilada y etanol para limpiar piezas de vidrio y cristalería. Utilice una pluma de diamante para cortar trozos de un portaobjetos de microscopio de vidrio, de modo que encajen en un pozo de una placa de 96 pozos.Coloque los lugares de vidrio en un vaso de precipitados con agua destilada triple, de modo que el agua cubra los toboganes de vidrio. Sonicar en un sonicador de baño durante 10 minutos. Decantar el agua.Agregue etanol para cubrir los portaobjetos de vidrio y sonice de nuevo en un sonicador de baño durante 10 minutos. Luego, seque los portaobjetos y la cristalería con una corriente de gas nitrógeno, y colóquelos en un limpiador de plasma de aire durante 10 minutos a 130 vatios. En una campana de humo, llene los pozos en las esquinas de una placa de 96 pozos con polvo de carbonato de amonio, y selle la placa con papel de aluminio.Cubra el papel de aluminio con película de parafina. Limpie cualquier carbonato de amonio residual con gas nitrógeno. Coloque las piezas de vidrio previamente cortadas y limpiadas en cinco pozos diferentes más cercanos al centro.Llene cada pozo con una pieza de vidrio con 100 microlitros de solución de cloruro de calcio preparada con agua triple destilada a un gradiente creciente de 10, 20, 30, 40 y 50 concentraciones miliamperosas. A continuación, perfore la cubierta de cada uno de los pozos que contienen carbonato de amonio tres veces con una aguja. Ponga la tapa hacia atrás, selle los bordes con película de parafina y manténgala a 18 grados centígrados en una incubadora durante 20 horas.Durante la incubación, el carbonato de amonio se descompone en amoníaco y dióxido de carbono, que se difunden en soluciones de cloruro de calcio, lo que resulta en la formación de cristales de carbonato de calcio. Después de la incubación, abra la tapa cuidadosamente dentro de una campana de humo, y utilice un bucle para eliminar los cristales formados en la interfaz agua-aire. Utilice pinzas para transferir las piezas de vidrio en un vaso de precipitados que contenga agua doble destilada para un chapuzón corto.A continuación, retire las muestras del vaso de precipitados y use cinta adhesiva de doble cara para fijar las piezas de vidrio en la parte inferior de la placa Petri. Seca el exceso de agua que toca los bordes del tobogán, con toallitas de tejido. Cubra el plato de Petri y colóquelo en un desecador durante 24 horas.Observe los cristales formados en las piezas de vidrio con un microscopio óptico vertical de 10 a 40 veces el aumento. Los cristales rombodral observados son probablemente calcita. Si además de los cristales romboédricos, la solución contiene cristales esféricos que probablemente son vateritas, repita el protocolo de cristalización, asegurándose de que el paso de limpieza se realiza correctamente.Además, asegúrese de que no haya carbonato de amonio en áreas de la placa que no sean los pozos dedicados. La concentración óptima para el cloruro de calcio se determina de acuerdo con la muestra rica en cristales de calcita facetadas lisas sin cristales de vaterita. Para empezar, limpie los portaobjetos de vidrio y la cristalería como se ha hecho anteriormente.En una campana de humo, coloque el polvo de carbonato de amonio en las esquinas de una placa de 96 pozos. En cada pozo donde se producirá la precipitación, coloque una pieza de vidrio que fue cortada y limpiada. Preparen los pozos de control.En dos pozos de control, pipeta 90 microlitros de 25 mililitros Tris tampón a pH 8, complementado con 100 cloruro de sodio mililolar. A continuación, añada 10 microlitros de solución de 0,5 molares de cloruro de calcio. A continuación, ajuste la concentración de proteína aditiva TapA a 10 TapA micromolar, 100 cloruro de sodio mili evolucionado y 25 tampón Tris mililolares a pH 8.Preparar el aditivo que contiene los pozos añadiendo 90 microlitros de la solución aditiva. Añadir 10 microlitros de solución de 0,5 molar de cloruro de calcio al aditivo que contiene los pozos para alcanzar la concentración óptima a 50 cloruros de calcio mililosos determinados previamente. Preparar la placa con agujeros en la cubierta sobre los pozos que contienen carbonato de amonio, e incubar a 18 grados Centígrados como se hacía anteriormente.Después de la incubación, preparar las piezas de vidrio en un plato de Petri como se hizo antes, y colocar el plato en un desecador durante 24 horas. Para cuantificar el porcentaje de masa de los aditivos en los precipitados de carbonato de calcio, primero verifique el coeficiente de extinción del aditivo utilizado. Luego, usa un microbalance para pesar las piezas de vidrio donde se formaron los cristales.Después de eso, raspa los cristales del vidrio en un tubo eppe con 1,2 mililitros de solución de ácido acético molar 0.1. Vórtice brevemente, y luego coloque el tubo en un sonicador para sonicar la muestra hasta que los cristales desaparezcan. Conservar la muestra a temperatura ambiente durante 24 horas.Pesar el portaobjetos de vidrio después de raspar los cristales. Mida la absorbancia UV A de la solución sonicada de 1,2 mililitros a 280 nanómetros para el aditivo proteico. Utilice la ecuación Beer-Lambert para calcular su concentración c.L es la trayectoria óptica dentro de la cubeta. Para calcular la masa de los aditivos en el cristal, utilice la ecuación, c por v es igual a m, si la concentración está en miligramos por mililitro. Si la concentración está en lunares por litro, calcule los lunares que se aplican c por v es igual a n.A continuación, utilice el peso molecular para calcular la masa de los aditivos. Calcular el porcentaje de peso de los aditivos en los cristales. M es la masa de los aditivos, y delta m s, es la masa de los cristales de carbonato de calcio que fueron raspados de la pieza de vidrio.Las imágenes SEM muestran la comparación entre un control adecuado con caras de calcita lisas, y cristales de calcita con caras compuestas de escalones. Los cristales esféricos son vaterita. Los experimentos de control exitosos e infructuosos dieron lugar a la espectroscopia Raman, mostrando los espectros típicos de calcita y vaterita respectivamente.La división del desplazamiento de Raman alrededor de 1080 por centímetro es la característica más evidente de la vaterita. Los cristales de carbonato de calcio formados en presencia de TapA, son distintos de los cristales de control. Se formó un complejo conjunto de carbonato de calcio esférico, compuesto por múltiples microcristales de calcita.El espectro Raman de los cristales formados en presencia de TapA, es similar al espectro de calcita. Los espectros absorbentes de TapA, y el control sin el aditivo, se midieron después de la disolución de los cristales en ácido. El porcentaje de masa de TapA se determinó que es 1.8 más o menos 0.2%Es fundamental seguir los pasos de limpieza cuidadosamente, y para asegurarse de que se cumplen los estándares de control antes de probar el efecto de los aditivos en la formación de carbonato de calcio.Además, es importante eliminar cualquier exceso de carbonato de amonio en forma de polvo de los pozos. El carbonato de amonio se descompone en amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco es tóxico si se inhala y, por lo tanto, el carbonato de amonio debe manipularse únicamente dentro de una campana de humo.Para evaluar la morfología interna y la estructura de los cristales, puede secarlos usando un haz de iones enfocado, tomar imágenes de las secciones con un microscopio electrónico de transmisión y medir los patrones de la difracción de electrones desde ubicaciones específicas a lo largo de las secciones. Esta técnica se ha utilizado previamente para estudiar el efecto de varias moléculas en la morfología y estructura del carbonato de calcio. Hemos elaborado este método para biopolímeros que son producidos por células bacterianas en biopelículas.Será interesante realizar estudios adicionales con otros biopolímeros producidos por diferentes cepas bacterianas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

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Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Investigación

Química

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In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

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Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

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