Name: construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Den Særlige Fond for Agrovidenskabelig Forskning i offentlighedens interesse (201403071), National risikovurdering stort specialprojekt for kvalitet og sikkerhed i forbindelse med mejeriprodukter (GJFP201800804) og projekter baseret på Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. sgRNA oligonucleotid design
<ol><li>Design sgRNAs ved hjælp af online værktøjer såsom Cas-Designer online værktøj (http://www.rgenome.net/cas-designer/). PAM-sekvensen er vigtig baseret på, at Cas9 anvendes. For xCas9 er de relevante PAM-sekvenser NG, og det tidligere henviste Cas-Designer onlineværktøj kan generere xCas9 relevante sgRNAs.<ol>
<li>Brug sgRNA-designværktøjer, der omfatter algoritmer til on- og off-target forudsigelse (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)<s...

<ol>
	<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR/Cas9+in+targeted+mutagenesis.">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency.">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells.">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li><li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells.">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li><li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair.">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646 (2010).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases.">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253 (2015).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+plasmid+with+double+fluorescent+groups+and+its+application+as+standard+substance.">An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance.</a> China patent. , (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels.">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+sgRNAs+targeting+porcine+RELA+gene.">A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene.</a> China patent. , (2015).</li></ol>

De sgRNA vektor kloning procedurer, vi har beskrevet her letter effektiv produktion af sgRNAs, med de fleste af de omkostninger, der stammer fra oligonucleotid bestilling og vektor sekventering. Mens den skitserede metode er designet til at give brugerne mulighed for at generere sgRNA'er til brug med CRISPR/Cas9, kan protokollen nemt tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleaser såsom Cpf1, der indfører mindre ændringer af vektorens rygrad og oligonukleotid overhængende sekvenser.
...

CRISPR sgRNA'erne omfatter en 20-nukleotidsekvens (protospaceren), som supplerer den genomiske målsekvens1,2. Selv om crispr/cas-systemet er meget effektivt, kræver det, at der oprettes en vektor, der bæreret effektivt sgRNA, der er unikt for målsted(-2). Dette papir beskriver de vigtigste trin i generationen af denne sgRNA vektor.
For vellykket genomredigering ved hjælp af CRISPR/Cas-systemet er brugen af højeffektive sgRNA'er en afgørendeforudsætning 3,4,5. Da konstruerede nukleaser, der anvendes i genomredigering, manifesterer forskellige effektivitetsgevinster ved forskellige målrettede loci1, er det nødvendigt med en forhåndsudvælgelse af kandidatsgRNA-mål for at spare tid ogindsats 6,7,8,9. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-streng pause reparation via enkelt streng glødning3,10. Her bruger vi dette reportersystem til at vælge et foretrukket CRISPR sgRNA-mål fra forskellige kandidatsgRNA-vektorer designet til specifik genredigering. Protokollen, der er anført her, er blevet implementeret i vores gruppe og samarbejdende laboratorier i de sidste par år for at generere og evaluere CRISPR sgRNAs.
Følgende protokol opsummerer, hvordan man designer egnet sgRNA via netværkssoftware. Når de egnede sgRNAs er valgt, beskriver vi de forskellige trin for at opnå de nødvendige oligonukleotider samt tilgangen til indsættelse af de parrede oligonukleotider i pX330-xCas9-ekspressionsvektoren. Vi præsenterer også en metode til at samle sgRNA-udtryk og dobbelt luciferase reporter vektorer baseret på ligation af disse sekvenser i en præedigested udtryk vektor (trin 2-10, Figur 1A). Endelig beskriver vi, hvordan man analyserer DNA-skæreeffektiviteten for hver af sgRNAs (trin 11-12).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A new generation of full touch screen gradient PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>A200</td>
			<td>Target gene amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0558V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td>
			<td>A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>K613</td>
			<td>Plasmid vector transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferas Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>Dual-luciferas reporter assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>DK-S24</td>
			<td>Heating reagent by constant temperature in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td>Control voltage, current, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Reference 2</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>Reference 2</td>
			<td>Accurately draw and transfer traces of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging analyzer</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>WD-9413B</td>
			<td>For the analysis of electrophoresis gel images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td>Detect dual luciferase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>BMH</td>
			<td>sigma 3K15</td>
			<td>Nucleic acid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent biochemical incubator</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>SHP-160</td>
			<td>Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003-0250</td>
			<td>For the cultivation of E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>DNA Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518131-0050</td>
			<td>Recycling DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518191-0100</td>
			<td>Extraction of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202V</td>
			<td>Link DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9761</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pressure steam sterilizer</td>
			<td>JIBIMED</td>
			<td>LS-50LD</td>
			<td>High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath thermostat</td>
			<td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>SHZ-82</td>
			<td>Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system

Selvom det er meget effektivt, kræver en ændring af et genomisk sted ved CRISPR-enzymet, at der på forhånd er skabt et sgRNA, der er unikt for målstederne. Dette arbejde beskriver de vigtigste trin, der fører til konstruktion af effektive sgRNA-vektorer ved hjælp af en strategi, der gør det muligt for en effektiv detektion af de positive kolonier ved PCR forud for DNA sekventering. Da effektiv genomredigering ved hjælp af CRISPR-systemet kræver et yderst effektivt sgRNA, er det nødvendigt med et forvalg af kandidatsgRNA-mål for at spare tid og kræfter. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-strand pause reparation via enkelt streng glødning. Her bruger vi dette reportersystem til at opfange det foretrukne xCas9/sgRNA-mål fra kandidatsgRNA-vektorer til specifik genredigering. Den protokol, der er skitseret, vil give en foretrukken sgRNA/CRISPR enzymvektor om 10 dage (begyndende med passende designede oligonukleotider).

De metoder, der er skitseret i denne protokol er til opførelse af sgRNA og xCas9 udtryksvektorer og derefter til optimering screening af sgRNA oligos med relativt højere gen målretning effektivitet. Her viser vi et repræsentativt eksempel på 3 sgRNA-mål til får 2. kr. SgRNA og xCas9 udtrykke vektorer kan bygges ved at predigesting vektoren rygrad (Figur 2) efterfulgt af ligating det i en række korte dobbelt-streng DNA fragmenter gennem glødende oligo par. De positive koloni...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Her præsenterer vi en protokol, der beskriver en strømlinet metode til effektiv generering af plasmider, der udtrykker både CRISPR-enzymet og tilhørende enkelt guide RNA (sgRNAs). Co-transfektion af pattedyrceller med denne sgRNA/ CRISPR vektor og en dobbelt luciferase reporter vektor, der undersøger dobbelt-streng pause reparation giver mulighed for evaluering af knockout effektivitet.

Opførelse af CRISPR Plasmids og påvisning af Knockout Effektivitet i pattedyrceller gennem en Dobbelt Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Denne protokol beskriver de vigtigste trin i generering og optimering af effektive sgRNA-vektorer. Vores preacceleration af kandidat sgRNA mål relativ tid og slutning. Den største fordel ved denne protokol er, at det gør det muligt at analysere DNA kodning indtryk for hver af de sgRNAs uden at redigere endogene gener.Denne forvalgsmetode kan også anvendes på andre genredigeringsforanstaltninger gennem dobbeltstrengede pauser. Begynd med at fortynde de frysetørrede oligonukleotider til en endelig koncentration på 10 mikromolar i dobbelt destilleret vand. Bland fremad og omvendte oligonukleotrider i et pcr-rør med tyndvægget vægge i et en-til-en-forhold uden at tilføje ekstra buffer.Inkuber blandingen ved 95 grader Celsius i fem minutter, derefter rampe ned temperaturen til 72 grader Celsius i 10 minutter. Fjern oligonukleotidblandingen fra PCR-maskinen, og lad den køle af ved stuetemperatur. At fordøje pX330-xCas9 vektor, med Bbs1, kombinere vektor, enzym, og fordøjelse buffer i en 50 mikroliter volumen og inkubere reaktionen ved 37 grader Celsius i to timer.Efter at have udført celle transformation, vælge fem til 10 bakterielle kolonier fra LB plade og bruge hver af dem til at vaccinere en milliliter LB medier med 60 milligram ampicillin i en 1,5 milliliter rør. Derefter inkuberes rørene på en roterende shaker i to til tre timer. Udfør PCR til skærm for rekombinant plasmider som beskrevet i tekstmanuskriptet, og kør derefter produkterne på en 2% Agarose gel under 10 volt per centimeter.Efter at have identificeret de positive plasmider, bruge dem, sammen med en reporter vektor, at co-transfect en passende cellelinje. For at lyse cellerne, skal du fjerne vækstmediet fra de dyrkede celler. Vask forsigtigt overfladen af kulturbeholderen med PBS og afbryd 100 mikroliter PLB i hver kulturblyd for helt at dække cellemonstren.Lad pladen inkubere ved stuetemperatur i 20 minutter, og overfør derefter lysatet til et rør eller hætteglas med behov for yderligere håndtering eller opbevaring. For at udføre den dobbelte luciferase-analyse programmeres lysarmaturerne for at give en forsinkelse på to sekunder efterfulgt af en 10 sekunders måleperiode. Derefter dispenseres 100 mikroliter luciferase assay reagens i et passende antal lysometerrør.Tilsæt forsigtigt 20 mikroliter cellelysat i luminometerrøret og blandes ved at pipettere to eller tre gange. Sæt røret i luminometeret og start aflæsningen. Fjern prøverøret fra luminometeret.Tilsæt 100 mikroliter af stop reagens og vortex kort at blande. Sæt prøven tilbage i luminometeret, og aflæsning påbegyndes. Optag Renilla Luciferase aktivitet, normaliseret til Firefly Luciferase aktivitet, specielt den gensidige af forholdet vises på skærmen.Kassér reaktionsrøret, når det er færdigt. Denne metode blev brugt til at generere tre sgRNA-vektorer for får DKK2 Exon 1. sgRNA og xCas9 udtrykke vektorer blev bygget ved pre-fordøje vektor rygraden efterfulgt af ligating det i en række korte, dobbelt-streng DNA fragmenter gennem glødende oligo par.Syv bakteriekolonier blev screenet med specifikke primer par guidet PCR og de positive kolonier blev opdaget. Genmålskapaciteten pX330-xCas9 T1, T2 og T3 blev samtidig påvist med den dobbelte luciferase-analyse. Den sidste sgRNA vektor viste det højeste detektionssignal og blev efterfølgende brugt til får genredigering forskning.Efter denne protokol, en T7EI assay eller en Ribonuclease assay kan udføres. Disse yderligere foranstaltninger giver mere præcise indtryk af endogene gener redigering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Påvisning og isolation af cirkulerende melanom celler ved hjælp af Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriel Detection og identifikation Brug elektrokemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Konstruktion og karakterisering af en roman Vocal Fold bioreaktor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrkning af pattedvrceller hjælp af en enkelt brug Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

En protokol til multipel gen-knockout i mus-små tarmorganoider ved anvendelse af en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital ryster kultur i pattedyrsceller i O-formede fartøjer til at producere Uniform aggregeringer

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Skalerbar fabrikation af elastisk, Dual Channel, mikrofluid orgel Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Opførelse af et flerlaget mesenkymale stamceller ark med en 3D dynamisk kultur System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...