Name: construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי המחלקה הראשונה גראסלאנד מדע משמעת תוכנית של מחוז שאנדונג (סין), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31301936, 31572383), הקרן המיוחדת למחקר אגרו-מדעי באינטרס הציבורי (201403071), הערכת סיכונים לאומית לפרויקט מיוחד של איכות ובטיחות של מוצרי חלב (GJFP201800804) ופרויקטים של מדע וטכנולוגיה של פרנסה של אנשי צ'ינגדאאו (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. עיצוב sgRNA אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>עיצוב sgRNAs באמצעות כלים מקוונים כגון הכלי המקוון Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). רצף PAM חשוב בהתבסס על Cas9 בשימוש. עבור xCas9, רצפי PAM הרלוונטיים הם NG והתוחלת הכלי המקוון Cas-Designer לשעבר יכול ליצור xCas9 sgRNAs רלוונטי.<ol>
<li>השתמש בכלי עיצוב sgRNA המקיפים אלגוריתמים לחיזוי יע?...

<ol>
	<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR/Cas9+in+targeted+mutagenesis.">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency.">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells.">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li><li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells.">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li><li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair.">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646 (2010).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases.">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253 (2015).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+plasmid+with+double+fluorescent+groups+and+its+application+as+standard+substance.">An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance.</a> China patent. , (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels.">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+sgRNAs+targeting+porcine+RELA+gene.">A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene.</a> China patent. , (2015).</li></ol>

הליכי השיבוט הווקטור sgRNA שתיארנו כאן מקל על ייצור יעיל של sgRNAs, עם רוב העלויות הנגזרות הזמנת oligonucleotide ושורק וקטור. בעוד השיטה המתוארת נועדה לאפשר למשתמשים ליצור sgRNAs לשימוש עם CRISPR/Cas9, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם Cas9 orthologues או אנדונוקלאות מונחה RNA אחרות כגון Cpf1, הצגת שינויים קלים ?...

SGRNAs CRISPR מהווים רצף של 20 נוקלאוטידים (הפרוטו-ספייסר), המשלים את רצף היעד הגנומי1,2. למרות יעילות רבה, היכולת של מערכת CRISPR/Cas לשנות אתר גנומי נתון דורשת יצירת וקטור הנושא sgRNA יעיל ייחודי לאתרי היעד2. מאמר זה מתאר את השלבים המרכזיים בדור של וקטור sgRNA זה.
לעריכת גנום מוצלחת באמצעות מערכת CRISPR/Cas, השימוש sgRNAs יעיל מאוד הוא תנאימוקדםחיוני 3,4,5. מאז גרעין מהונדס המשמש בעריכת הגנום להפגין יעילות מגוונת ב lociממוקד שונים 1, בחירה מראש של מטרות sgRNA מועמד יש צורך כדי לחסוך זמןומאמץ 6,7,8,9. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות גדיל יחיד annealing3,10. כאן אנו משתמשים במערכת כתבים זו כדי לבחור יעד CRISPR sgRNA מועדף ממועמדים שונים sgRNA וקטורים המיועדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול שצוין כאן יושם במעבדות הקבוצה ושיתוף הפעולה שלנו בשנים האחרונות כדי ליצור ולהעריך את CRISPR sgRNAs.
הפרוטוקול הבא מסכם כיצד לעצב SgRNA מתאים באמצעות תוכנת רשת. לאחר הבחירה sgRNAs המתאימים, אנו מתארים את השלבים השונים כדי להשיג את האוליגונוקלאוטידים הנדרשים, כמו גם את הגישה להכנסת oligonucleotides לזווג לתוך וקטור הביטוי pX330-xCas9. כמו כן, אנו מציגים שיטה להרכבת וקטורים כתב sgRNA-הבעת וגם וקטורים כתב לוציפראז כפול בהתבסס על הקשירה של רצפים אלה לתוך וקטור ביטוי ים-10 (שלבים 2-10, איור 1A). לבסוף אנו מתארים כיצד לנתח את יעילות חיתוך ה-DNA עבור כל sgRNAs (שלבים 11-12).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A new generation of full touch screen gradient PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>A200</td>
			<td>Target gene amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0558V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td>
			<td>A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>K613</td>
			<td>Plasmid vector transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferas Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>Dual-luciferas reporter assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>DK-S24</td>
			<td>Heating reagent by constant temperature in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td>Control voltage, current, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Reference 2</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>Reference 2</td>
			<td>Accurately draw and transfer traces of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging analyzer</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>WD-9413B</td>
			<td>For the analysis of electrophoresis gel images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td>Detect dual luciferase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>BMH</td>
			<td>sigma 3K15</td>
			<td>Nucleic acid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent biochemical incubator</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>SHP-160</td>
			<td>Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003-0250</td>
			<td>For the cultivation of E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>DNA Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518131-0050</td>
			<td>Recycling DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518191-0100</td>
			<td>Extraction of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202V</td>
			<td>Link DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9761</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pressure steam sterilizer</td>
			<td>JIBIMED</td>
			<td>LS-50LD</td>
			<td>High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath thermostat</td>
			<td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>SHZ-82</td>
			<td>Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system

למרות יעיל מאוד, שינוי של אתר גנומי על ידי אנזים CRISPR דורש הדור של sgRNA ייחודי לאתרי היעד מראש. עבודה זו מתארת את הצעדים המרכזיים המובילים לבניית וקטורים SGRNA יעילים באמצעות אסטרטגיה המאפשרת זיהוי יעיל של המושבות החיוביות על ידי PCR לפני רצף DNA. מאחר שעריכת גנום יעילה באמצעות מערכת CRISPR דורשת SGRNA יעילה ביותר, יש צורך בבחירה מוקדמת של יעדי SGRNA של מועמדים כדי לחסוך זמן ומאמץ. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות חיתוק גדיל יחיד. כאן, אנו משתמשים במערכת הכתבים הזו כדי לאסוף את היעד המועדף של xCas9/sgRNA מקטורי SGRNA מועמדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול המתואר יספק וקטור אנזים sgRNA/CRISPR מועדף בתוך 10 ימים (החל מאוליגונוקלאוטידים מעוצבים כראוי).

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הן לבניית וקטורים ביטוי sgRNA ו xCas9 ולאחר מכן עבור הקרנת אופטימיזציה של sgRNA אוליגוס עם יעילות מיקוד גנים גבוהה יחסית. כאן אנו מציגים דוגמה מייצגת של 3 מטרות sgRNA לכבשים DKK2 exon 1. SgRNA ו xCas9 לבטא וקטורים ניתן לבנות על ידי נטיעת עמוד השדרה וקטור (איור 2)...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

פרוטוקול זה מתאר את שלבי המפתח בהידור ואופטימיזציה של וקטורים יעילים של sgRNA. ההקדמה שלנו של מועמד sgRNA מטרות זמן יחסי והסקת מסקנות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנתח את רשמי קידוד ה- DNA עבור כל אחד מה- sgRNAs מבלי לערוך גנים אנדוגניים.ניתן להחיל שיטת בחירה מוקדמת זו גם על אמצעים אחרים לעריכת גנים באמצעות הפסקות דו-לוגיות. התחל על ידי דילול oligonucleotides lyophilized לריכוז סופי של 10 micromolar במים מזוקקים כפולים. ערבבו קדימה ואחורי אוליגונוקלאוטידים בצינור PCR דק-קירות ביחס של אחד לאחד מבלי להוסיף מאגר נוסף.להחגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן רמפה למטה את הטמפרטורה ל 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את תערובת oligonucleotide ממכונת PCR ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לעיכול וקטור pX330-xCas9, עם Bbs1, שלבו את מאגר הווקטור, האנזים והעיכול בנפח של 50 מיקרוליטר והדקירה את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.לאחר ביצוע טרנספורמציה התא, לבחור חמש עד 10 מושבות חיידקים מהצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן מיליליטר אחד של מדיה LB עם 60 מיליגרם אמפיצילין בצינור 1.5 מיליליטר. ואז להדרגר את הצינורות על שייקר סיבובי במשך שעתיים עד שלוש שעות. בצע PCR כדי לסנן עבור פלסמידים רקומביננטי כמתואר בכתב יד טקסט, ולאחר מכן להפעיל את המוצרים על 2%Agarose ג'ל תחת 10 וולט אחוזים.לאחר זיהוי הפלסמידים החיוביים, השתמש בהם, יחד עם וקטור כתב, כדי לבצע חילוף שותף של קו תא מתאים. כדי ללת את התאים, הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התרבותיים. בעדינות לשטוף את פני השטח של כלי התרבות עם PBS ולחלק 100 microliters של PLB לתוך כל תרבות היטב כדי לכסות לחלוטין את שכבת מונו התא.תן את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את lysate לצינור או בקבוקון להמשך טיפול או אחסון. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז הכפולה, תכנת את הזוהר לספק השהיה של שתי שניות לפני הקריאה ואחריה תקופת מדידה של 10 שניות. לאחר מכן, מחלקים 100 מיקרוליטרים של לוציפראז מסאי רגנט למספר המתאים של צינורות לומינומטר.בזהירות להוסיף 20 microliters של lysate התא לתוך צינור זוהר ומערבבים על ידי צינור פעמיים או שלוש פעמים. מניחים את הצינור בלומינומטר ויוזם את הקריאה. הסר את צינור הדגימה מהלומינומטר.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של עוצרי ים ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. מחזירים את הדגימה ללומינומטר ויוזם קריאה. הקלט את פעילות רנילה לוציפראז, מנורמלת לפעילות פיירפלי לוציפראז, במיוחד הגומלין של היחס המוצג על המסך.השלך את צינור התגובה בסיום. שיטה זו שימשה ליצירת שלושה וקטורים sgRNA עבור כבשים DKK2 אקסון 1. sgRNA ו- xCas9 וקטורים מבטאים נבנו על ידי עיכול מראש של עמוד השדרה הווקטור ואחריו קשירה בסדרה של שברי DNA קצרים, כפולי גדילים באמצעות זוגות אוליגו חישול.שבע מושבות חיידקים הוקרנו עם PCR מונחה זוג פריימר ספציפי ואת המושבות החיוביות זוהו. יכולות מיקוד הגנים של pX330-xCas9 T1, T2 ו- T3 זוהו בו-זמנית עם המוצג הכפול של לוציפראז. וקטור SgRNA האחרון הציג את אות הגילוי הגבוה ביותר ולאחר מכן שימש למחקר עריכת גנים כבשים.בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקות T7EI או מוצג ריבונוקלאז. אמצעים נוספים אלה מעניקים רשמים מדויקים יותר של עריכת גנים אנדוגניים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...