Name: construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Este projeto foi financiado pelo Programa de Disciplina de Ciência de Pastagens de Primeira Classe da Província de Shandong (China), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31301936, 31572383), fundo especial de pesquisa agrocientífica de interesse público (201403071), Avaliação nacional de risco grande projeto especial de qualidade e segurança do produto leite (GJFP201800804) e Projetos de Ciência e Tecnologia de Sustento do Povo de Qingdao (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. sgRNA design de oligonucleotídeo
<ol><li>Design sgRNAs usando ferramentas on-line, como a ferramenta online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). A sequência PAM é importante com base no Cas9 que está sendo usado. Para xCas9, as sequências pam relevantes são NG e a antiga ferramenta on-line Cas-Designer referida pode gerar sgRNAs relevantes xCas9.<ol>
<li>Use ferramentas de design sgRNA que englobam algoritmos para previsão on-and-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools...

<ol>
	<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR/Cas9+in+targeted+mutagenesis.">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency.">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells.">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li><li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells.">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li><li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair.">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646 (2010).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases.">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253 (2015).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+plasmid+with+double+fluorescent+groups+and+its+application+as+standard+substance.">An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance.</a> China patent. , (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels.">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+sgRNAs+targeting+porcine+RELA+gene.">A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene.</a> China patent. , (2015).</li></ol>

Os procedimentos de clonagem de vetores sgRNA que descrevemos aqui facilitam a produção eficiente de sgRNAs, com a maioria dos custos derivados do pedido de oligonucleotídeos e sequenciamento vetorial. Embora o método delineado seja projetado para permitir que os usuários gerem sgRNAs para uso com CRISPR/Cas9, o protocolo pode ser facilmente adaptado para uso com ortomologias Cas9 ou outros endonucleases guiados por RNA, como o Cpf1, introduzindo pequenas modificações na espinha dorsal vetorial e nas sequências d...

Os sgRNAs CRISPR compreendem uma sequência de 20 nucleotídeos (o protoespaço), que é complementar à sequência genômica de alvo1,2. Embora altamente eficiente, a capacidade do sistema CRISPR/Cas de modificar um determinado site genômico requer a geração de um vetor que carrega um sgRNA eficiente exclusivo do site de destino2. Este artigo descreve os principais passos na geração desse vetor sgRNA.
Para a edição de genoma bem-sucedida usando o sistema CRISPR/Cas, o uso de sgRNAs altamente eficientes é um pré-requisito crucial3,4,5. Uma vez que os núcleos projetados usados na edição de genomas manifestam diversas eficiências em diferentes loci1direcionados , uma pré-seleção de metas de sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço6,7,8,9. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único fio de ressarcimento3,10. Aqui usamos este sistema de repórteres para escolher um alvo sgRNA CRISPR preferido de diferentes vetores sgRNA candidatos projetados para edição específica de genes. O protocolo aqui estabelecido foi implementado em nosso grupo e laboratórios colaboradores nos últimos anos para gerar e avaliar as SGRNAs crispr.
O protocolo a seguir resume como projetar sgRNA adequado através de software de rede. Uma vez selecionados os sgRNAs adequados, descrevemos as diferentes etapas para obter os oligonucleotídeos necessários, bem como a abordagem para inserir os oligonucleotídeos emparelhados no vetor de expressão pX330-xCas9. Também apresentamos um método para a montagem de vetores de repórter sgRNA e dupla luciferase baseado na ligadura dessas sequências em um vetor de expressão predigdenciado (passos 2-10, Figura 1A). Finalmente descrevemos como analisar a eficiência de corte de DNA para cada um dos sgRNAs (etapas 11-12).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A new generation of full touch screen gradient PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>A200</td>
			<td>Target gene amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0558V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td>
			<td>A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>K613</td>
			<td>Plasmid vector transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferas Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>Dual-luciferas reporter assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>DK-S24</td>
			<td>Heating reagent by constant temperature in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td>Control voltage, current, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Reference 2</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>Reference 2</td>
			<td>Accurately draw and transfer traces of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging analyzer</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>WD-9413B</td>
			<td>For the analysis of electrophoresis gel images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td>Detect dual luciferase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>BMH</td>
			<td>sigma 3K15</td>
			<td>Nucleic acid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent biochemical incubator</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>SHP-160</td>
			<td>Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003-0250</td>
			<td>For the cultivation of E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>DNA Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518131-0050</td>
			<td>Recycling DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518191-0100</td>
			<td>Extraction of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202V</td>
			<td>Link DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9761</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pressure steam sterilizer</td>
			<td>JIBIMED</td>
			<td>LS-50LD</td>
			<td>High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath thermostat</td>
			<td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>SHZ-82</td>
			<td>Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system

Embora altamente eficiente, a modificação de um site genômico pela enzima CRISPR requer a geração de um sgRNA exclusivo do site de destino de antemão. Este trabalho descreve os principais passos que levam à construção de vetores sgRNA eficientes usando uma estratégia que permite a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Uma vez que a edição eficiente do genoma usando o sistema CRISPR requer um sgRNA altamente eficiente, uma pré-seleção de alvos sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único ressarcimento de fios. Aqui, usamos este sistema de repórteres para pegar o alvo xCas9/sgRNA preferido dos vetores sgRNA candidatos para edição específica de genes. O protocolo delineado fornecerá um vetor de enzima sgRNA/CRISPR preferido em 10 dias (começando com oligonucleotídeos devidamente projetados).

Os métodos descritos neste protocolo são para a construção de vetores de expressão sgRNA e xCas9 e, em seguida, para a triagem de otimização de oligos sgRNA com eficiências relativamente mais altas de segmentação genética. Aqui exibimos um exemplo representativo de 3 alvos sgRNA para ovelhas DKK2 exon 1. Os vetores de expressão SgRNA e xCas9 podem ser construídos predigesting a espinha dorsal vetorial (Figura 2), seguido por ligante-lo em uma série de fragmentos curtos...

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Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.

Construção de Plasmids CRISPR e Detecção de Eficiência de Nocaute em Células Mamíferas através de um Sistema de Repórteres Dual Luciferase

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Este protocolo descreve os principais passos na geração e otimização de vetores sgRNA eficientes. Nossa pré-celeração de candidato sgRNA visa tempo relativo e inferência. A principal vantagem deste protocolo é que torna possível analisar as impressões de codificação de DNA para cada uma das sgRNAs sem editar genes endógenos.Este método de pré-seleção também pode ser aplicado a outras medidas de edição de genes através de quebras duplas. Comece diluindo os oligonucleotídeos linofphilizados para uma concentração final de 10 micromolar em água dupla destilada. Misture oligonucleotídeos para a frente e para frente em um tubo PCR de paredes finas em uma proporção de um para um sem adicionar nenhum buffer extra.Incubar a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos, depois diminuir a temperatura para 72 graus Celsius por 10 minutos. Remova a mistura de oligonucleotídeo da máquina PCR e deixe esfriar à temperatura ambiente. Para digerir o vetor pX330-xCas9, com Bbs1, misture o vetor, a enzima e o tampão de digestão em um volume de 50 microliter e incubar a reação a 37 graus Celsius por duas horas.Após realizar a transformação celular, escolha de cinco a dez colônias bacterianas da placa LB e use cada uma delas para inocular um mililitro de mídia LB com 60 miligramas de ampicillina em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, incubar os tubos em um agitador rotativo por duas a três horas. Execute PCR para tela para plasmídeos recombinantes, conforme descrito no manuscrito do texto, em seguida, execute os produtos em um gel Agarose de 2% abaixo de 10 volts por centímetro.Depois de identificar os plasmídeos positivos, use-os, juntamente com um vetor repórter, para co-transfectar uma linha celular apropriada. Para lise as células, remova o meio de crescimento das células cultivadas. Lave suavemente a superfície do vaso de cultura com PBS e dispense 100 microliters de PLB em cada cultura bem para cobrir completamente a camada mono celular.Deixe a placa incubar à temperatura ambiente por 20 minutos e, em seguida, transfira o lise para um tubo ou frasco para mais manuseio ou armazenamento. Para realizar o ensaio de luciferase dupla, programe os luminômetros para proporcionar um atraso pré-leitura de dois segundos seguido de um período de medição de 10 segundos. Em seguida, distribua 100 microliters de reagente de ensaio de luciferase no número apropriado de tubos luminômetros.Adicione cuidadosamente 20 microliters de lise celular no tubo luminômetro e misture por pipetação duas ou três vezes. Coloque o tubo no luminômetro e inicie a leitura. Remova o tubo de amostra do luminômetro.Adicione 100 microliters de reagente stop e vórtice brevemente para misturar. Devolva a amostra ao luminômetro e inicie a leitura. Regisso recorde a atividade Renilla Luciferase, normalizada para a atividade Desalumbrada Luciferase, especificamente a recíproca da razão exibida na tela.Descarte o tubo de reação quando terminar. Este método foi usado para gerar três vetores sgRNA para ovelhas DKK2 Exon 1. sgRNA e xCas9 expressando vetores foram construídos pré-digerindo a espinha dorsal vetorial seguido por ligando-o em uma série de fragmentos de DNA curtos e de dois fios através de pares de oligo de renas.Sete colônias bacterianas foram examinadas com par de primer específico guiado PCR e as colônias positivas foram detectadas. As capacidades de segmentação genética de pX330-xCas9 T1, T2 e T3 foram detectadas simultaneamente com o ensaio de luciferase dupla. O último vetor sgRNA exibiu o maior sinal de detecção e foi posteriormente usado para pesquisa de edição de genes de ovelhas.Seguindo este protocolo, um ensaio T7EI ou um ensaio de Ribonuclease podem ser realizados. Essas medidas adicionais dão impressões mais precisas da edição de genes endógenos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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