Name: construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Bu proje Shandong Eyaleti Birinci Sınıf Otlak Bilim Disiplin Programı (Çin), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31301936, tarafından finanse edilmiştir 31572383), Kamu Yararına Tarımsal Bilimsel Araştırma Özel Fonu (201403071), Ulusal risk değerlendirme ana projesi süt ürünleri kalitesi ve güvenliği (GJFP201800804) ve Qingdao Halk Geçim Bilimi ve Teknolojisi Projeleri (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. sgRNA oligonükleotid tasarımı
<ol><li>Cas-Designer çevrimiçi aracı (http://www.rgenome.net/cas-designer/) gibi çevrimiçi araçları kullanarak sgRNA'ları tasarla. PAM dizisi, Cas9'un kullanılmasına göre önemlidir. xCas9 için, ilgili PAM dizileri NG'dir ve eski başvuruyapılan Cas-Designer çevrimiçi aracı xCas9 ilgili sgRNA'lar oluşturabilir.<ol>
<li>Hedef te ve hedef dışı tahmin (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11için algoritmaları...

<ol>
	<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR/Cas9+in+targeted+mutagenesis.">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency.">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells.">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li><li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells.">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li><li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair.">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646 (2010).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity.">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases.">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253 (2015).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+plasmid+with+double+fluorescent+groups+and+its+application+as+standard+substance.">An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance.</a> China patent. , (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels.">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+sgRNAs+targeting+porcine+RELA+gene.">A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene.</a> China patent. , (2015).</li></ol>

Burada tanımladığımız sgRNA vektör klonlama prosedürleri, maliyetlerin çoğu oligonükleotid siparişi ve vektör diziliminden elde edilen sgRNA'ların verimli üretimini kolaylaştırır. Ana hatlarıyla anlatılan yöntem, kullanıcıların CRISPR/Cas9 ile kullanılmak üzere sgRNA'lar oluşturmasına olanak sağlamak üzere tasarlanmış olsa da, protokol, Cas9 ortologları veya Cpf1 gibi diğer RNA güdümlü endoklezazlarla kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir ve vektör omurgasında ve oligonükleotid ...

CRISPR sgRNA'lar 20 nükleotit dizisini (protospacer) oluşturur ve bu dizi1,2'yitamamlar. Son derece verimli olmasına rağmen, CRISPR/Cas sisteminin belirli bir genomik siteyi değiştirebilme yeteneği, hedef bölgeye özgü verimli bir sgRNA taşıyan bir vektörün üretilmesi için2. Bu makalede, sgRNA vektörünün oluşumundaki önemli adımlar açıklanmaktadır.
CRISPR/Cas sistemi kullanılarak başarılı genom düzenleme için, yüksek verimli sgRNA kullanımı önemli bir ön koşul3,4,5. Genom düzenlemede kullanılan mühendislik çekirdekleri farklı hedeflenen loci1'defarklı verimlilikler gösterdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin ön seçimigereklidir 6,7,8,9. Çift luciferase muhabir sistemi tek iplikçik annealing 3 ,10ile çift iplikçik break onarım inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Burada bu muhabir sistemini, belirli gen düzenleme için tasarlanmış farklı aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen CRISPR sgRNA hedefini seçmek için kullanıyoruz. Burada belirtilen protokol, CRISPR SGRNA'ları oluşturmak ve değerlendirmek için son birkaç yıldır grubumuzda ve işbirliği laboratuvarlarımızda uygulanmaktadır.
Aşağıdaki protokol, ağ yazılımı aracılığıyla uygun sgRNA'nın nasıl tasarılabildiğini özetleyin. Uygun sgRNA'lar seçildikten sonra, gerekli oligonükleotidleri elde etmek için farklı adımları ve eşleştirilmiş oligonükleotidlerin pX330-xCas9 ekspresyon vektörüne eklenmesi için farklı adımları anlatıyoruz. Ayrıca, bu dizilerin önceden sindirilmiş bir ifade vektörü içine bağlanmasına dayalı sgRNA-ekspres ve çift luciferase muhabiri vektörlerinin biraraya getirilmesi için bir yöntem satıyoruz (2-10 adım, Şekil 1A). Son olarak, sgRNA'ların her biri için DNA kesme veriminin nasıl analiz edilebildiğini anlatıyoruz (11-12. adım).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A new generation of full touch screen gradient PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>A200</td>
			<td>Target gene amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0558V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean workbench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td>
			<td>A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>K613</td>
			<td>Plasmid vector transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferas Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td>Dual-luciferas reporter assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>DK-S24</td>
			<td>Heating reagent by constant temperature in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td>Control voltage, current, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Reference 2</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>Reference 2</td>
			<td>Accurately draw and transfer traces of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging analyzer</td>
			<td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>WD-9413B</td>
			<td>For the analysis of electrophoresis gel images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td>Detect dual luciferase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>BMH</td>
			<td>sigma 3K15</td>
			<td>Nucleic acid extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent biochemical incubator</td>
			<td>Sanfa Scientific Instruments</td>
			<td>SHP-160</td>
			<td>Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003-0250</td>
			<td>For the cultivation of E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>DNA Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI restriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138V</td>
			<td>Cutting target vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518131-0050</td>
			<td>Recycling DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B518191-0100</td>
			<td>Extraction of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202V</td>
			<td>Link DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9761</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pressure steam sterilizer</td>
			<td>JIBIMED</td>
			<td>LS-50LD</td>
			<td>High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath thermostat</td>
			<td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>SHZ-82</td>
			<td>Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of crispr plasmids and detection of knockout efficiency in mammalian cells through a dual luciferase reporter system

Yüksek verimli olmasına rağmen, crispr enzimi ile genomik bir alanın değiştirilmesi, önceden hedef bölgeye özgü bir sgRNA(lar) oluşturmayı gerektirir. Bu çalışma, DNA dizilimi öncesinde PCR tarafından pozitif kolonilerin etkin bir şekilde algılanmasını sağlayan bir strateji kullanarak verimli sgRNA vektörlerinin inşasına giden önemli adımları açıklamaktadır. CRISPR sistemi kullanılarak verimli genom düzenleme sgRNA gerektirdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin önceden seçilmesi gereklidir. Çift iplikçikli break onarımı tek iplikçikli annealing ile inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için çift luciferase muhabir sistemi geliştirilmiştir. Burada, belirli gen düzenleme için aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen xCas9/sgRNA hedefini almak için bu muhabir sistemini kullanıyoruz. Belirtilen protokol 10 gün içinde tercih edilen bir sgRNA/CRISPR enzim vektörü sağlayacaktır (uygun şekilde tasarlanmış oligonükleotidlerden başlayarak).

Bu protokolde belirtilen yöntemler sgRNA ve xCas9 ekspresyon vektörlerinin yapımı ve daha sonra nispeten daha yüksek gen hedefleme verimliliğine sahip sgRNA oligolarının optimizasyon taraması içindir. Burada koyun DKK2 ekson 1 için 3 sgRNA hedeflerinin temsili bir örnek görüntüler. SgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi yle(Şekil 2)oluşturulabilir ve ardından oligo çiftçifti aracılığıyla kısa çift iplikli DNA parçalar?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System at JoVE.com

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Burada, hem CRISPR enzimini hem de ilişkili tek kılavuz RNA'ları (sgRNA) ifade eden verimli plazmid üretimi için aerodinamik bir yöntemi açıklayan bir protokol salıyoruz. Memeli hücrelerinin bu sgRNA/CRISPR vektörü ve çift iplikli break onarımını inceleyen çift luciferase muhabiri vektörü ile birlikte transfeksiyonu nakavt etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar.

CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Bu protokol, verimli sgRNA vektörlerinin üretilmesi ve optimizasyonundaki önemli adımları açıklar. Aday sgRNA'nın ön ivmesi göreceli zamanı ve çıkarımları hedeflemektedir. Bu protokolün en büyük avantajı, endojen genleri düzenlemeden her bir sgRNA için DNA kodlama gösterimlerinin analiz edilebilmektedir.Bu ön seçim yöntemi, çift iplikli molalar yoluyla diğer gen düzenleme önlemlerine de uygulanabilir. Lyophilized oligonükleotidleri çift distile suda 10 mikromolar son konsantrasyonuna seyrelterek başlayın. İnce duvarlı PCR tüpünde ileri ve ters oligonükleotidleri bire bir oranında ekstra tampon eklemeden karıştırın.Karışımı 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın, sonra sıcaklığı 10 dakika boyunca 72 dereceye düşürün. Oligonükleotid karışımını PCR makinesinden çıkarın ve oda sıcaklığında soğumasını bekleyin. Bbs1 ile pX330-xCas9 vektörü sindirmek için vektör, enzim ve sindirim tamponunu 50 mikrolitrelik bir hacimde birleştirin ve reaksiyonu 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın.Hücre dönüşümü yaptıktan sonra, LB plakabeş ila 10 bakteri kolonileri seçin ve 1.5 mililitretüp 60 miligram ampisilin ile LB medya bir mililitre aşılamak için her birini kullanın. Sonra tüpleri bir döner çalkalayıcının üzerine 2-3 saat kuluçkaya yatırın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi rekombinant plazmidleri taramak için PCR'yi gerçekleştirin, ardından ürünleri 10 volt santimetrenin altında %2'lik Agarose jel üzerinde çalıştırın.Pozitif plazmidleri tanımladıktan sonra, uygun bir hücre hattını eş-transfect için, bir muhabir vektörü ile birlikte kullanın. Hücreleri lyse için, kültürlü hücrelerden büyüme ortamı kaldırın. Kültür kabının yüzeyini PBS ile hafifçe yıkayın ve hücre mono tabakasını tamamen kapsayacak şekilde her kültüre 100 mikrolitre PLB dağıtın.Plaka 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yada, daha sonra daha fazla işleme veya depolama için bir tüp veya şişe için lysate aktarın. Çift luciferase tayini gerçekleştirmek için, luminometreleri iki saniyeönceden okuma gecikmesi ve ardından 10 saniyelik bir ölçüm süresi sağlamak üzere programlayın. Daha sonra, 100 mikrolitre luciferase asay reaktifini uygun sayıda luminometre tüpüne dağıtın.Luminometre tüpüne 20 mikrolitre hücre lisatını dikkatlice ekleyin ve iki veya üç kez borulandırarak karıştırın. Tüpü luminometreye yerleştirin ve okumayı başlatın. Örnek tüpü luminometreden çıkarın.Karıştırmak için kısa bir süre stop reaktif ve girdap 100 mikrolitre ekleyin. Örneği luminometreye geri verin ve okumayı başlatın. Firefly Luciferase aktivitesine normalleştirilen Renilla Luciferase etkinliğini, özellikle ekranda görüntülenen oranın karşılıklı olarak kaydedin.Bittiğinde reaksiyon tüpünü atın. Bu yöntem koyun DKK2 Exon 1 için üç sgRNA vektörü oluşturmak için kullanılmıştır. sgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi ve ardından çift iplikli DNA parçalarının annealing oligo çiftleri aracılığıyla bir dizi kısa, çift iplikli DNA parçasıile bağlanması ile oluşturulmuştür.Yedi bakteri kolonisi spesifik primer çifti güdümlü PCR ile tarandı ve pozitif koloniler tespit edildi. pX330-xCas9 T1, T2 ve T3'ün gen hedefleme kapasiteleri aynı anda çift luciferase testi ile tespit edildi. Son sgRNA vektörü en yüksek algılama sinyalini sergiledi ve daha sonra koyun geni düzenleme araştırmalarında kullanıldı.Bu protokolü takiben, bir T7EI tsay veya Ribonuclease test yapılabilir. Bu ek önlemler endojen genlerin düzenlenmesi daha doğru izlenimler verir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...