Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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必须承认西尔维·莫尔格博士和让-米歇尔·查萨尔博士的主要参与，以建立疫苗批次的ELISA测定赛，并组织国际讲习班和合作研究。我们感谢萨布丽娜·卡利对手稿的批判性解读。皮埃尔·佩林博士负责mAb-D1的隔离和表征。这项工作主要由巴斯德研究所资助。

1. 安全防范措施
注：此方法适用于活式 RABV 和灭活疫苗。
<ol><li>使用良好的实验室实践和安全程序。</li>
	<li>佩戴足够的个人防护设备 （PPE），包括一次性外套、手套、面罩、眼镜等。</li>
	<li>当活病毒被定化时，使用II类生物安全柜。<ol>
<li>将任何与样品接触的材料（试剂、洗涤溶液等）视为传染性材料。</li>
		<li>通过浸入漂白液（次氯酸钠的2.5%）进行30分钟的净化，处?...

mAb-D1识别的表位位于RABV糖蛋白的抗原部位III，它不仅是VNAbs诱导的免疫主导物，而且还涉及神经毒性、致病性40、41,41和受体识别42。沿糖蛋白的另一个重要的抗原位点，站点II43，有几个MAbs已被隔离，如mAb-WI-111235。这些也可用于类似类型的实验。
ELISA的这种体外方法的一个局限?...

50多年来，NIH测试1被用作一种黄金标准方法，在批次发布前评估狂犬病疫苗的功效。该测试包括对带有疫苗的小鼠组进行腹内免疫，然后14天后与狂犬病病毒挑战病毒标准（CVS）菌株（RABV）进行脑内（IC）挑战。从在IC挑战中幸存下来的小鼠比例来评估效力。虽然世卫组织2和欧洲药典3仍然需要NIH测试来评估疫苗的功效，但该测试面临几个障碍：结果高度可变4;传染性RABV在挑战期间使用，这既需要技术技能和严格的生物安全措施;大量动物被使用，挑战的严重性引起了严重的伦理问题。这种测试的一个不太严重的变异已经形成：在腹管内免疫两周后，小鼠不受IC的挑战，而是通过体外中和测试，在血清中存在特定的RABV中和抗体（VNAbs）进行流血和测试。然而，这项试验仍然需要牺牲大量的实验鼠，虽然它已经用于兽医疫苗66，7，7并已考虑为人类疫苗8。.
截至目前，国际9国和欧洲10项建议都鼓励制造商和国家控制实验室（官方药物控制实验室 -OMCL）实施实验室动物检测的更换、减少和改进，即3R战略。欧洲第2010/63/EU号指令（自2013/01/01月起生效）也加强了对疫苗制造商和实验室参与狂犬病疫苗质量控制以及狂犬病研究的限制。因此，开发、验证和使用替代体外方法现已成为优先事项。这些不仅在道德上是健全的，而且还可以减少批次测试成本，并将结果的时间缩短到数小时，而不是第3周。
在RABV粒子的表面，糖蛋白采用12、13、14、15、1613,14,15,16的三角状。12在狂犬病疫苗中，这种原生三分体构成诱导VNAbs17的主要免疫原，而单体、可溶性或变性糖蛋白的免疫原性差18、19。,19因此，沿疫苗生产过程中保存糖蛋白的修剪器是保存最佳免疫原性潜力的良好指标。几种免疫化学方法，如抗体结合测试20、21、,21单径向免疫扩散（SRD）测试22和ELISA测试23、24、25、26、27，均被世卫组织技术报告系列23,24,25,26,272和欧洲专著3推荐，以量化狂犬病疫苗中的抗原含量。制造商使用这些来监测疫苗生产的一致性，并由OMCL评估人类疫苗的批次28的一致性配方，即使NIH测试仍考虑其效力。
然而，所有这些免疫化学方法并不等效。SRD测试需要预先处理，可能会改变膜锚定修剪器，并导致糖蛋白22，29,29的可溶性或变性形式。因此，SRD在区分免疫原性和非免疫原性糖蛋白方面效率不高，导致对疫苗批次的免疫原性评价不完善。相比之下，ELISA测试更敏感22，保留了糖蛋白的原生结构，更适合确定糖蛋白的原生折叠修剪器的含量。ELISA 测试可以使用兔子多克隆或小鼠单克隆抗糖蛋白抗体纯化和浓缩与硫酸铵。研究表明，NIH测试与ELISA在疫苗中评估的抗原含量良好一致，并得出结论，ELISA方法适用于体外效力测试。这主张ELISA测试至少可以补充甚至取代NIH测试44，26，27，30，31，32，33。,26,27,30,31,32,33今天，欧洲药典建议使用经过验证的血清学或免疫化学测定作为NIH测试3的替代品。完全避免动物使用疫苗效力已成为一个现实的观点。
下面介绍的方法是基于一个间接的ELISA三明治免疫捕获使用小鼠单克隆抗体克隆（mAb-D1），识别的抗原位点III（a330至338）的三角RABV糖蛋白15，34。15,该方法最初是在巴斯德研究所26、30,30中开发，然后由国家国家麻醉研究所（ANSM）实验室（即法国OMCL4,4，33）进行优化和验证。mAb-D1 既用于使板敏感，又用于检测捕获的抗原。这允许对糖蛋白修剪器进行特定定量，即免疫原性RABV抗原。用于检测的 mAb-D1 标有过氧化物酶，在基材和色蛋白存在时会显示此特性。对经测试的疫苗和参考疫苗的吸收度进行比较，可以确定免疫原糖蛋白含量。值得注意的是，同一类型的测定可以适用于不同的mAbs识别不同的抗原位点的RABV糖蛋白35。与硫酸铵抗糖蛋白多克隆兔免疫球蛋白G（IgG）或单克隆小鼠球蛋白一起获得和纯化或浓缩的方法，在36之前与过氧化物酶37结合抗体的方法中得到了广泛的描述。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

全球对动物福利的日益关注鼓励制造商和国家控制实验室 （OMCL） 遵循实验室动物检测的替换、减少和改进的 3R 战略。建议在世卫组织和欧洲各级制定体外方法，作为NIH检测的替代品，以评估狂犬病疫苗的效力。在狂犬病病毒 （RABV） 颗粒的表面，糖蛋白的修剪器构成诱导病毒中和抗体 （VNAbs） 的主要免疫原。ELISA测试，其中中和单克隆抗体（mAb-D1）识别糖蛋白的三氯体形式，已经开发，以确定原生折叠三氯糖蛋白的内容以及疫苗批次的生产。这种体外效力测试与NIH测试良好一致，并发现适合RABV疫苗制造商和OMCL的合作试验。在不久的将来，避免使用动物是一个可以实现的目标。
所介绍的方法基于使用mAb-D1的间接ELISA三明治免疫捕获，该mAb-D1可识别三角RABV糖蛋白的抗原位点III（aa 330至338），即免疫原性RABV抗原。mAb-D1 用于疫苗批次中糖蛋白修剪器的涂层和检测。由于表位因其构象特性而得到识别，因此 mAb-D1 无法捕获和检测潜在的变性糖蛋白（免疫原性较低）。要测试的疫苗在mAb-D1的培养板中孵育。结合三聚三叶胶质的拉巴糖蛋白通过再次添加mAb-D1来识别，用过氧化物酶标记，然后在基质和色蛋白的存在下显示。对经测试的疫苗和参考疫苗的吸收度进行比较，可以确定免疫原糖蛋白含量。

在下面的示例中，使用了参考疫苗09，包括纯化灭活狂犬病病毒颗粒（PV疫苗毒株）。在测定病毒蛋白总量（BCA测试）和通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估糖蛋白百分比后，确定了其中的糖蛋白修剪器（10 μg/mL）含量。或者，可以使用经过校准的参考疫苗，例如，世卫组织第六届狂犬病疫苗国际标准（NIBSC代码：07/162）。
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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

在这里，我们描述了一个间接的ELISA三明治免疫捕获，以确定狂犬病疫苗中的免疫原性糖蛋白含量。本测试使用中和单克隆抗体（mAb-D1）识别糖蛋白修剪器。它是体内NIH测试的替代方案，用于在生产过程中遵循疫苗效力的一致性。

体外ELISA测试评估狂犬病疫苗效力

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

为了减少动物试验，并由于NH试验的变异性，世卫组织鼓励制定体外方法，评估狂犬病疫苗的功效。此 ELISA 测试显示与经典 NH 测试在识别糖蛋白的免疫原性形式方面良好一致，表现出高灵敏度，且只能在一天内完成。ELISA对狂犬病疫苗在体外效力的评价是体内NH试验的替代方案。它由制造商和国家控制实验室推广。每次稀释时，必须按重复的体积分发预尺寸的卷，并在洗涤后将盘子干燥在吸水纸上，以避免开始此过程，安装足够的个人防护设备，包括一次性外套、手套、面罩和眼镜。将受污染的材料浸入2.6%次氯酸钠溶液中，30分钟进行净化，对受污染的材料进行处理。接下来，设置一个96井的免疫测定板，并添加200微升的单克隆抗体稀释在每一个井的碳酸盐缓冲液。用胶粘膜盖住板，在加湿环境中在37摄氏度下孵育微孔板3小时。然后小心吸气，将井内含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接收方中。反转微孔板，在室温下在吸水纸上干燥五分钟。首先，向每井添加300微升钝化缓冲液。用胶粘膜盖住盘子，在37摄氏度下孵育30分钟。在此之后，将井内装物转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的井中。要清洗盘子，请在每个井中加入300微升的洗涤缓冲液。然后小心吸气，将井内含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接收方中。再重复此洗涤过程五次，以广泛清洗敏感板。在此之后，反转微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。在一毫升蒸馏水中重组参考疫苗，使狂犬病病毒糖蛋白的最终浓度为每毫升10微克。在稀释剂中准备10倍稀释重组参考疫苗，以达到狂犬病病毒糖蛋白浓度每毫升1微克。接下来，如文本协议表之一所述，在稀释剂中对该参考疫苗进行六次连续的两倍稀释。在重复井中分配200微升稀释剂，作为盲控，每口200微升用于重复的参考疫苗稀释。然后在稀释剂中准备10倍的稀释测试疫苗，并准备七倍的稀释剂的稀释剂，如文本协议表二所述。将每个测试的疫苗稀释的 200 微升重复分发到微孔板的每个孔中。用胶粘膜盖住微孔板，在37摄氏度下孵育一小时。在此之后，取出薄膜。小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.7%次氯酸钠溶液的接受者中。要清洗盘子，在每一个井中加入300微升的洗涤缓冲液，小心吸气，并将每一井的内含物转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。再重复洗涤过程五次，去除未绑定的抗原，并保存与涂层抗体结合的 G 蛋白修剪剂。倒置洗涤的微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。然后将推荐的200微升的过氧化物酶的稀释剂（标有D1单克隆抗体）在稀释剂中分配到每井。用胶粘膜盖住微孔板，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，取出薄膜，小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。要清洗微孔板，请在每个孔中加入300微升的洗涤缓冲液。小心吸气，将每一井的含量转移到含有2.6%次氯酸钠溶液的接受者中。重复此洗涤过程五次，以去除未绑定过氧化物酶标记的抗体。倒置洗涤的微孔板，让它在室温下在一块吸水纸上干燥一分钟。接下来，将200微升基基铬质溶液分配到每一个井中。用薄膜密封微孔板，在黑暗中室温下孵育30分钟。然后在每个井中加入50微升的停止溶液，以停止反应。小心地擦拭微孔板的底部，并放在分光光度计中。确定所有使用油井的光学密度为 492 纳米。在电子表格文件中收集此数据以进行分析。在此之后，为参考疫苗曲线和文本协议中概述的光学密度值创建绘图。在这项研究中，体外ELISA测试用于评估狂犬病疫苗的功效。此处显示了典型实验中的代表性光学密度值。这些值用于绘制参考疫苗曲线，通过绘制垂直轴上参考疫苗的不同稀释和水平轴上糖蛋白浓度的不同稀释度均值光学密度。然后使用此曲线估计被测试疫苗的糖蛋白含量。对于参考疫苗曲线的衬里区域具有平均光学密度值的稀释值，评估是精确的。考虑到1至40的稀释，X轴上的OD 1534的垂直投影相当于每毫升500毫微克。因此，测试的疫苗估计为每毫升糖蛋白20微克。在确定体外效力时，有必要将经检测的疫苗与在国际单位中校准的世卫组织六项国际标准进行比较。同样的方法可以与其他抗体一起使用，以扩大对更多疫苗株的检测，包括那些用于兽医疫苗的疫苗，这些疫苗通常更具有变数。抗体也可用于竞争在马或人血清中滴定抗狂犬病抗体。对未灭活或病毒的疫苗必须采取预防措施。请务必使用个人防护设备，戴上手套，并正确净化所有物品。此外，要小心片剂，因为它们是致癌的和酸钠次氯酸盐溶液。

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