Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.

1. Précautions de sécurité
REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé.
<ol><li>Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire.</li>
	<li>Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc.</li>
	<li>Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II.<ol>
<li>Considérez tout matériau en conta...

L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI...

Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit plusieurs obstacles : les résultats sont très variables4; LE RABV infectieux est utilisé pendant le défi, ce qui exige à la fois des compétences techniques et des mesures de biosécurité strictes; un grand nombre d’animaux sont utilisés, et la gravité du défi soulève de sérieuses préoccupations éthiques5. Une variation moins grave de ce test a été développée : deux semaines après la vaccination intra-péritonéale, les souris ne sont pas contestées par IC mais saignées et testées pour la présence d’anticorps neutralisant RABV spécifiques (VNAbs) dans leur sérum à l’aide d’un test de neutralisation in vitro. Cependant, ce test nécessite encore de sacrifier un grand nombre de souris de laboratoire, bien qu’il soit déjà utilisé pour les vaccins vétérinaires6,7 et a été considéré pour les vaccins humains8.
À l’heure actuelle, les recommandations internationales9 et européennes10 encouragent les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle (Laboratoires officiels de contrôle des médicaments - OMCL) à mettre en œuvre le remplacement, la réduction et le raffinement des essais sur les animaux de laboratoire, appelé la stratégie 3R. La directive européenne 2010/63/UE (en vigueur depuis 2013/01/01) relative à la protection et au bien-être des animaux a également renforcé les contraintes pour les fabricants de vaccins et les laboratoires impliqués dans le contrôle de la qualité des vaccins antirabiques ainsi que dans la recherche sur la rage11. En conséquence, le développement, la validation et l’utilisation d’approches in vitro alternatives sont maintenant devenus une priorité. Ceux-ci sont non seulement éthiquement sains, mais peuvent également réduire les coûts de test par lots et raccourcir le temps pour les résultats à des heures au lieu de semaines3.
À la surface de la particule RABV, la glycoprotéine adopte une forme trimétérique12,13,14,15,16. Dans le vaccin contre la rage, cette forme trimériique indigène constitue l’immunogène majeur induisant VNAbs17 tandis que les glycoprotéines monomériques, solubles ou dénaturées sont mal immunogéniques18,19. Ainsi, la préservation des garnitures de la glycoprotéine le long du processus de production du vaccin est un bon indicateur pour la préservation d’un potentiel immunogène optimal. Plusieurs méthodes immunochimiques, telles que l’anticorps-contraignant-test20,21, letest d’immunodiffusion radiale unique (SRD) et le test ELISA23,24,25,26,27 sont recommandés par le rapport technique de l’OMS Série2 et la monographie européenne3 pour quantifier la teneur en antigènes dans les vaccins contre la rage. Ceux-ci sont utilisés par les fabricants pour surveiller l’uniformité de la production de vaccins et par l’OMCL pour évaluer la formulation cohérente de lots de vaccins humains28, même si le test des NIH est toujours considéré pour la puissance.
Cependant, toutes ces méthodes immunochimiques ne sont pas équivalentes. Le test SRD nécessite un pré-traitement qui peut modifier les garnitures à la membrane et entraîner une forme soluble ou dénaturée de la glycoprotéine22,29. Par conséquent, SRD n’est pas très efficace en discriminant entre les glycoprotéines immunogéniques et non immunogènes résultant en une évaluation imparfaite de l’immunogénicité d’un lot vaccinal. En revanche, le test ELISA est plus sensible22, préserve la structure indigène de la glycoprotéine, et est plus approprié pour déterminer le contenu des garnitures pliées indigènes de glycoprotéine. Le test ELISA peut utiliser soit des anticorps anti-glycoprotéines monoclonals de lapin ou de souris purifiés ou concentrés avec du sulfate d’ammonium. Des études ont démontré une bonne concordance entre le test des NIH et le contenu antigène évalué par ELISA dans les vaccins et ont conclu que les méthodes ELISA conviennent au test de puissance in vitro. Cela préconise que les tests ELISA pourraient au moins compléter ou même remplacer le test des NIH4,26,27,30,31,32,33. Aujourd’hui, la Pharmacopoeia européenne recommande l’utilisation d’essais sérologiques ou immunochimiques validés comme alternatives au test des NIH3. L’évitement complet de l’utilisation animale de la puissance vaccinale est devenu une perspective réaliste.
La méthode présentée ci-dessous est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant un clone d’anticorps monoclonal de souris (mAb-D1) qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabVtrimeric 15,34. Cette méthode a d’abord été développée à l’Institut Pasteur26,30 puis optimisée et validée par le laboratoire de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), c’est-à-dire le Français OMCL4,33. Le mAb-D1 est utilisé à la fois pour sensibiliser la plaque et par la suite pour détecter l’antigène capturé. Cela permet la quantification spécifique des garnitures de glycoprotéine, c’est-à-dire l’antigène RABV immunogénique. Le mAb-D1 utilisé pour la détection est étiqueté avec peroxidase, qui se révèle en présence du substrat et du chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique. Il est à noter que le même type d’essai peut être appliqué pour différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV35. La méthode pour obtenir et purifier ou se concentrer avec l’ammonium sulfate anti-glycorotein polyclonal rabbit immunoglobulins G (IgG) ou globulines monoclonal de souris ont été largement décrits précédemment36 avec la méthode pour conjuguer des anticorps avec peroxidase37.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.
La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.

Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la norme...

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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Dans le but de réduire les tests sur les animaux et en raison de la variabilité du test nh, l’OMS encourage à développer des approches in vitro pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Ce test ELISA montre une bonne concordance avec un test NH classique dans la reconnaissance de la forme immunogénique de la glycoprotéine, montre une sensibilité élevée, et peut être effectué en seulement une journée. L’évaluation de la puissance vaccinale de la rage in vitro par ELISA est une alternative au test in vivo NH.Il est promu par les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle. Il est essentiel de distribuer des volumes pré-dimensionnés en double pour chaque dilution et de bien sécher la plaque sur du papier absorbant après les lavages pour éviter de commencer cette procédure, mettre sur un équipement de protection personnelle adéquat, y compris manteau jetable, gants, masque, et des lunettes. Traitez les matières contaminées en les immergeant dans une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 % pendant 30 minutes pour la décontamination.Ensuite, installez une plaque d’immunoassay de 96 puits et ajoutez 200 microlitres de l’anticorps monoclonal dilués dans le tampon de carbonate à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures dans un environnement humidifié. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez le contenu du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,6 %.Inverser la microplaque et la laisser sécher sur du papier absorbant à température ambiante pendant cinq minutes. Tout d’abord, ajouter 300 microlitres du tampon de passivation à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après cela, transférer le contenu du puits à celui contenant une solution de 2,6% hypochlorite de sodium. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres du tampon de lavage à chaque puits. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez la teneur du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %.Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour laver abondamment la plaque sensibilisée. Après cela, inverser la microplaque et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Reconstituer le vaccin de référence dans un millilitre d’eau distillée de telle sorte que la concentration finale de virus de la rage glycoprotéine est de 10 microgrammes par millilitre.Préparer une dilution 10 fois du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre une concentration de glycoprotéine du virus de la rage d’un microgramme par millilitre. Ensuite, effectuez six dilutions périodiques doubles de ce vaccin de référence dans le diluant tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte. Distribuer 200 microlitres du diluant dans des puits en double pour servir de contrôle aveugle et 200 microlitres par puits pour chaque dilution vaccinale de référence en double.Préparez ensuite une dilution 10 fois du vaccin testé dans le diluant et préparez sept dilutions en série doubles du vaccin testé en diluant tel que décrit dans le tableau deux du protocole du texte. Distribuez 200 microlitres de chaque dilution vaccinale testée en double à chaque puits de la microplaque. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après cela, retirez le film. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,7 %. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits, aspirer soigneusement et transférer le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %.Répétez le processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéine G liées à l’anticorps enduit. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Ensuite, distribuez 200 microlitres de la dilution recommandée de l’anticorps monoclonal D1 étiqueté peroxidase en diluant à chaque puits.Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %. Pour laver la microplaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits.Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite à 2,6 % de sodium. Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute.Ensuite, distribuez 200 microlitres de solution substrat-chromogène dans chaque puits. Sceller la microplaque avec du film et l’incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-le dans le spectrophotomètre. Déterminer la densité optique à 492 nanomètres pour tous les puits utilisés. Collectez ces données dans un fichier de feuille de calcul pour analyse.Après cela, créez des parcelles pour la courbe vaccinale de référence et les valeurs de densité optique décrites dans le protocole textuel. Dans cette étude, le test ELISA in vitro est utilisé pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Des valeurs de densité optique représentatives d’une expérience typique sont affichées ici.Ces valeurs sont utilisées pour dessiner la courbe vaccinale de référence en traçant la densité optique moyenne pour les différentes dilutions du vaccin de référence sur l’axe vertical et la concentration de la glycoprotéine sur l’axe horizontal. La teneur en glycoprotéines du vaccin testé est ensuite estimée à l’aide de cette courbe. L’évaluation est précise pour les dilutions qui ont une valeur moyenne de densité optique dans la zone du revêtement de la courbe vaccinale de référence.Compte tenu de la dilution de un à 40, la projection verticale de l’OD 1534 sur l’axe x correspond à 500 nanogrammes par millilitre. Ainsi, le vaccin testé est estimé à 20 microgrammes par millilitre de glycoprotéine. Lorsque la puissance in vitro est établie, il est nécessaire de comparer le vaccin testé à la référence six normes internationales de l’OMS calibrées dans des unités internationales.La même méthode peut être utilisée avec d’autres anticorps pour élargir la détection d’un plus grand nombre de souches vaccinal, y compris celles utilisées dans les vaccins vétérinaires qui sont classiquement plus variables. Les anticorps peuvent également être utilisés en compétition pour la titration d’anticorps antirabies dans le sérum équin ou humain. Des précautions doivent être prises avec des vaccins qui ne sont pas inactivés ou avec des virus.Assurez-vous d’utiliser de l’équipement de protection individuelle, de porter des gants et de tout décontaminer correctement. Aussi, soyez prudent avec les comprimés de car ils sont cancérigènes et avec la solution acide d’hypochlorite de sodium.

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