Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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La dott.ssa Sylvie Morgeaux e il Dr. Jean-Michel Chapsal devono essere riconosciuti per la loro partecipazione chiave per stabilire il test ELISA sui lotti di vaccino e per organizzare workshop internazionali e studi collaborativi. Ringraziamo Sabrina Kali per la lettura critica del manoscritto. Il Dr. Pierre Perrin era responsabile dell'isolamento e della caratterizzazione di mAb-D1. Questo lavoro è stato principalmente sostenuto dai finanziamenti dell'Institut Pasteur.

1. Precauzioni di sicurezza
NOTA: questo metodo è applicabile sia al RABV vivo che al vaccino inattivato.
<ol><li>Utilizzare le buone procedure di pratica e sicurezza di laboratorio.</li>
	<li>Indossare attrezzature di protezione personale (PPE) adeguate, tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera, occhiali, ecc.</li>
	<li>Quando il virus vivo è titolato, utilizzare un mobile di sicurezza biologica di classe II.<ol>
<li>Considerare qualsiasi materiale a contatto con i campioni (reagent...

L'epitopo riconosciuto dal mAb-D1 si trova nel sito antigenico III della glicoproteina RABV che non è solo immuno-dominante per l'induzione di VNAbs, ma anche coinvolto nella neurovirulenza, patogenicità40,41 e riconoscimento del recettore42. C'è un altro importante sito antigenico lungo la glicoproteina, sito II43, contro il quale diversi MAbs sono stati isolati come mAb-WI-111235. Questi...

Da più di 50 anni, il test NIH1 viene utilizzato come metodo gold standard per valutare la potenza del vaccino antirabbico prima del rilascio del lotto. Questo test consiste in un'immunizzazione intraperitale di gruppi di topi con il vaccino da testare seguita da una sfida intra-cerebrale (IC) 14 giorni dopo con il ceppo del virus della rabbia (RABV) Challenge Virus Standard (CVS). La potenza viene valutata dalla percentuale di topi che sopravvivono alla sfida IC. Sebbene l'OMS2 e la Pharmacopeia3 europea richiedano ancora il test NIH per valutare la potenza del vaccino, questo test subisce diversi ostacoli: i risultati sono altamente variabili4; il RABV infettivo viene utilizzato durante la sfida e ciò richiede sia abilità tecniche che severe misure di biosicurezza; viene utilizzato un gran numero di animali, e la gravità della sfida solleva gravi preoccupazioni etiche5. È stata sviluppata una variazione meno grave di questo test: due settimane dopo l'immunizzazione intra-peritoneale, i topi non sono sfidati da IC, ma sanguinano e testati per la presenza di specifici anticorpi di neutralizzazione RABV (VNAbs) nel loro siero utilizzando un test di neutralizzazione in vitro. Tuttavia, questo test richiede ancora di sacrificare un gran numero di topi di laboratorio, anche se è già in uso per i vaccini veterinari6,7 ed è stato considerato per i vaccini umani8.
Al momento, sia l'International9 che l'European10 raccomandazioni incoraggiano i produttori e i laboratori nazionali di controllo (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) ad attuare la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio, indicati come strategia 3R. La direttiva europea 2010/63/EU (in vigore dal 2013/01/01) relativa alla protezione e al benessere degli animali ha inoltre rafforzato i vincoli per i produttori e i laboratori di vaccini coinvolti nel controllo della qualità dei vaccini sulla rabbia e nella ricerca sulla rabbia11. Di conseguenza, lo sviluppo, la convalida e l'uso di approcci alternativi in vitro sono diventati una priorità. Questi non sono solo eticamente sani, ma possono anche ridurre i costi di test in batch e ridurre il tempo per i risultati a ore invece di settimane3.
Sulla superficie della particella RABV, la glicoproteina adotta una forma trimrica12,13,14,15,16. Nel vaccino antirabbico, questa forma trimeric autoctona costituisce il principale immunogeno che induce VNAbs17 mentre le lecoproteine monomeriche, solubili o denaturesono scarsamente immunogeniche18,19. Pertanto, la conservazione dei trimer della glicoproteina lungo il processo di produzione del vaccino è un buon indicatore per la conservazione di un potenziale immunogenico ottimale. Diversi metodi immunochimici, come il test anticorpo-legante20,21, il test di immunodiffusione singola radiale (SRD)22 e il test ELISA23,24,25,26,27 sono raccomandati dalla relazione tecnica dell'OMS Serie2 e dalla monografia europea3 per quantificare il contenuto dell'antigene nei vaccini antirabbii. Questi sono utilizzati dai produttori per monitorare la consistenza della produzione di vaccini e dall'OMCL per valutare la formulazione coerente di lotti di vaccini umani28, anche se il test NIH è ancora considerato per la potenza.
Tuttavia, tutti questi metodi immunochimici non sono equivalenti. Il test SRD richiede un pretrattamento che può alterare i trimer a membrana ancorati e provocare una forma solubile o denaturata della glicoproteina22,29. Pertanto, la SRD non è molto efficiente nel discriminare tra le glicoproteine immunogeniche e non immunogeniche con conseguente valutazione imperfetta dell'immunogenicità di un lotto di vaccino. Al contrario, il test ELISA è più sensibile22, conserva la struttura nativa della glicoproteina ed è più appropriato per determinare il contenuto dei trimernativi piegati nativamente di glicoproteina. Il test ELISA può utilizzare anticorpi anticlonali monoclonali di coniglio o murini monoclonali purificati o concentrati con solfato di ammonio. Gli studi hanno dimostrato una buona concordanza tra il test NIH e il contenuto di antigene valutato da ELISA nei vaccini e hanno concluso che i metodi ELISA sono adatti per il test di potenza in vitro. Questo sostiene che i test ELISA potrebbero almeno integrare o addirittura sostituire il test NIH4,26,27,30,31,32,33. Oggi, la Farmacocottoeia europea raccomanda l'uso di saggi sierologici o immunochimici convalidati come alternative al test NIH3 . La completa prevenzione dell'uso animale per la potenza vaccinale è diventata una prospettiva realistica.
Il metodo presentato di seguito si basa su un immunocattura sandwich ELISA indiretto utilizzando un clone anticorpo monoclonale del topo (mAb-D1) che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimerica RABV15,34. Questo metodo è stato sviluppato inizialmente presso l'Institut Pasteur26,30 poi ottimizzato e convalidato dal laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), cioè il francese OMCL4,33. Il mAb-D1 viene utilizzato sia per sensibilizzare la piastra che successivamente per rilevare l'antigene catturato. Ciò consente la quantificazione specifica dei trimer glicoproteici, cioè l'antigene rabV immunogenico. Il mAb-D1 utilizzato per il rilevamento è etichettato con perossidasi, che si rivela in presenza del substrato e del cromogeno. Il confronto dell'assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica. È di nota che lo stesso tipo di saggio può essere applicato a diversi mAbs riconoscendo diversi siti antigenici della glicoproteina RABV35. Il metodo per ottenere e purificare o concentrarsi con anticorpo anti-glicoproteina policlonale immunoglobuline G (IgG) o globuline mureali monoclonali sono stati ampiamente descritti in precedenza36 insieme al metodo per coniugare anticorpi con perossidasi37.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

La crescente preoccupazione globale per il benessere degli animali sta incoraggiando i produttori e i laboratori nazionali di controllo (OMCL) a seguire la strategia 3Rs per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio. Lo sviluppo di approcci in vitro è raccomandato a livello dell'OMS e dell'Europa come alternative al test NIH per valutare la potenza del vaccino della rabbia. Sulla superficie della particella del virus della rabbia (RABV), i trimer di glicoproteina costituiscono il principale immunogeno per indurre gli anticorpi neutralizzanti virali (VNAbs). Un test ELISA, in cui neutralizzare gli anticorpi monoclonali (mAb-D1) riconosce la forma trimerica della glicoproteina, è stato sviluppato per determinare il contenuto della glicoproteina trimeric piegata nativa insieme alla produzione dei lotti di vaccino. Questo test di potenza in vitro ha dimostrato una buona concordanza con il test NIH ed è stato trovato adatto in sperimentazioni collaborative da parte dei produttori di vaccini RABV e oMCL. L'evitare l'uso degli animali è un obiettivo realizzabile nel prossimo futuro.
Il metodo presentato si basa su un'immunocattura indiretta del sandwich ELISA utilizzando l'mAb-D1 che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimovina RABV, cioè l'antigene rabV immunogenico. mAb-D1 viene utilizzato sia per il rivestimento che per il rilevamento dei trimer glicoproteici presenti nel lotto di vaccino. Poiché l'epitopo è riconosciuto a causa delle sue proprietà conformazionali, la glicoproteina potenzialmente denaturata (meno immunogenica) non può essere catturata e rilevata dal mAb-D1. Il vaccino da testare viene incubato in una piastra sensibilizzata con il mAb-D1. Le glicoproteine RABV trimeric legate vengono identificate aggiungendo nuovamente il mAb-D1, etichettato con perossidasi e poi rivelato in presenza di substrato e cromogeno. Il confronto dell'assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica.

Nell'esempio seguente viene utilizzato il vaccino di riferimento Lot 09, costituito da particelle di virus della rabbia inattivate purificate (ceppo vaccino fotovoltaico). Il contenuto di tagliatrici di glicoproteine (10 g/mL) in questo è stato stabilito dopo la determinazione della quantità totale di proteine virali (test BCA) e la valutazione della percentuale della glicoproteina da sDS-poliacritilmide gel elettroforesi. In alternativa, può essere utilizzato un vaccino di riferimento...

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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Qui descriviamo un'immunocattura indiretta del panino ELISA per determinare il contenuto di glicoproteina immunogenica nei vaccini sulla rabbia. Questo test utilizza un anticorpo Monoclonal neutralizzante (mAb-D1) riconoscendo i trimer di lecoproteine. È un'alternativa al test NIH in vivo per seguire la coerenza della potenza del vaccino durante la produzione.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Allo scopo di ridurre la sperimentazione animale e a causa della variabilità del test NH, l'OMS incoraggia a sviluppare approcci in vitro per valutare la potenza del vaccino antiracca. Questo test ELISA mostra una buona concordanza con un classico test NH nel riconoscere la forma immunogenica della glicoproteina, mostra un'alta sensibilità e può essere eseguito entro un solo giorno. La valutazione della potenza del vaccino antiracca in vitro da parte di ELISA è un'alternativa al test NH in vivo.È promosso dai produttori e dai laboratori nazionali di controllo. È fondamentale distribuire volumi di pre-dimensioni in duplicato per ogni diluizione e asciugare bene la piastra su carta assorbente dopo i lavaggi per evitare di iniziare questa procedura, indossare adeguate attrezzature di protezione individuale tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera e occhiali. Trattare i materiali contaminati immergendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6% per 30 minuti per la decontaminazione.Successivamente, impostare una piastra di immunoanalisi da 96 po 'e aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo monoclonale diluito nel tampone di carbonato ad ogni pozzo. Coprire la piastra con pellicola adesiva e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius per tre ore in un ambiente umidificato. Quindi aspirare e trasferire attentamente il contenuto di pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.Invertire la micropiatta e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per cinque minuti. In primo luogo, aggiungere 300 microlitri del tampone di passivazione a ciascun pozzo. Coprire la piastra con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Successivamente, trasferire il contenuto del pozzo in uno contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Per lavare la piastra, aggiungere 300 microlitri del tampone di lavaggio ad ogni bene. Quindi aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per lavare ampiamente la piastra sensibilizzata. Successivamente, invertire la micropiatta e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Ricostituire il vaccino di riferimento in un millilitro di acqua distillata in modo tale che la concentrazione finale di glicoproteina del virus della rabbia sia di 10 microgrammi per millilitro.Preparare una diluizione di 10 volte del vaccino di riferimento ricostituito nel diluente per raggiungere una concentrazione di glicoproteina del virus della rabbia di un microgrammo per millilitro. Successivamente, eseguire sei diluizioni seriali due volte di questo vaccino di riferimento nel diluente come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri del diluente in pozzi duplicati per fungere da controllo cieco e 200 microlitri per pozzo per ogni diluizione vaccinale di riferimento in duplicato.Quindi preparare una diluizione di 10 volte del vaccino testato nel diluente e preparare sette diluizioni seriali due volte del vaccino testato in diluente come delineato nella tabella due del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri di ogni diluizione vaccinale testata in duplice copia ad ogni pozzo della micropiastra. Coprire la micropiatta con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.Dopo questo, rimuovere il film. Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,7%. Per lavare la piastra, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.Ripetere il processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'antigene non legato e conservare i tritori di proteine G legati all'anticorpo rivestito. Invertire la micropiatta lavata e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Quindi distribuire 200 microlitri della diluizione raccomandata della perossidasi etichettata anticorpo monoclonale D1 in diluente ad ogni pozzo.Coprire la micropiatta con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, rimuovere il film, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Per lavare la micropiatta, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo.Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'anticorpo etichettato perossidasi non legato. Invertire la micropiatta lavata e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto.Successivamente, distribuire 200 microlitri di soluzione substrato-cromogeno in ogni pozzo. Sigillare la micropiatta con pellicola e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzo per fermare la reazione.Pulire con cura il fondo della micropiatta e posizionarlo nello spettrofotometro. Determinare la densità ottica a 492 nanometri per tutti i pozzi utilizzati. Raccogliere questi dati in un file di foglio di calcolo per l'analisi.Successivamente, create grafici sia per la curva del vaccino di riferimento che per i valori di densità ottica delineati nel protocollo di testo. In questo studio, il test ELISA in vitro viene utilizzato per valutare la potenza del vaccino antiracca. Qui vengono mostrati i valori rappresentativi della densità ottica di un esperimento tipico.Questi valori sono utilizzati per disegnare la curva del vaccino di riferimento tracciando la densità ottica media per le diverse diluizioni del vaccino di riferimento sull'asse verticale e la concentrazione della glicoproteina sull'asse orizzontale. Il contenuto di glicoproteina del vaccino testato viene quindi stimato utilizzando questa curva. La valutazione è precisa per le diluizioni che hanno un valore medio di densità ottica nell'area del rivestimento della curva del vaccino di riferimento.Tenendo conto della diluizione di uno a 40, la proiezione verticale di OD 1534 sull'asse x corrisponde a 500 nanogrammi per millilitro. Quindi il vaccino testato è stimato in 20 microgrammi per millilitro di glicoproteina. Quando viene stabilita la potenza in vitro, è necessario confrontare il vaccino testato con il riferimento a sei standard internazionali dell'OMS calibrati in unità internazionali.Lo stesso metodo può essere utilizzato con altri anticorpi per ingrandire il rilevamento di più ceppi di vaccini, compresi quelli utilizzati nei vaccini veterinari che sono classicamente più variabili. Gli anticorpi possono anche essere utilizzati in competizione per la titolazione di anticorpi antirabi nel siero equino o umano. Devono essere prese precauzioni con vaccini non inattivati o con virus.Assicurati di utilizzare dispositivi di protezione individuale, indossare guanti e decontaminare tutto correttamente. Inoltre, fai attenzione con compresse di come sono cancerogene e con la soluzione acida di ipoclorito di sodio.

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