Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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シルヴィ・モルゲオー博士とジャン=ミシェル・チャップサル博士は、ワクチンバッチに関するELISAアッセイを確立し、国際的なワークショップや共同研究を組織するために、彼らの主要な参加を認められなければなりません。原稿を批判的に読んでくださったサブリナ・カリに感謝します。ピエール・ペラン博士は、mAb-D1の分離と特性評価を担当しました。この作品は、主にパスツール研究所の資金調達によって支援されています。

1. セキュリティ対策
注:この方法は、ライブRABVと不活性化ワクチンの両方に適用可能です。
<ol><li>良い実験室の練習と安全手順を使用してください。</li>
	<li>使い捨てコート、手袋、マスク、眼鏡など、適切な個人保護具(PPE)を着用してください。</li>
	<li>生きたウイルスが滴定される場合は、クラスIIの生物学的安全キャビネットを使用してください。<ol>
<li>サンプル?...

mAb-D1によって認識されるエピトープは、VNAbsの誘導に対して免疫性だけでなく、神経の活性化にも関与するRABV糖タンパク質の抗原部位IIIに位置するが、病原性40、41,41および受容体認識42にも関与する。糖タンパク質に沿って別の重要な抗原部位があり、部位II43は、mAb-WI-111235など、いくつかのMAb...

50年以上にわたり、NIH試験1は、バッチ放出前に狂犬病ワクチンの効力を評価するための金標準法として使用される。この検査は、ワクチンを用いたマウス群の腹腔内免疫を含み、その後14日後に狂犬病ウイルス(CVS)株のチャレンジウイルスウイルス(RABV)で脳内(IC)チャレンジが行われる。効力は、ICチャレンジを生き残ったマウスの割合から評価されます。WHO2および欧州薬局方3はワクチンの効力を評価するためにNIH試験を必要としますが、このテストはいくつかのハードルに苦しんでいます:結果は非常に可変的です。感染性RABVは挑戦の間に使用され、これは技術的なスキルと厳格なバイオセーフティ対策の両方を必要とします。多数の動物が使用され、挑戦の重大度は深刻な倫理的懸念を提起する5.この検査のあまり深刻なバリエーションが開発されました:腹膜内免疫の2週間後、マウスはICによって挑戦されるのではなく、リンビトロ中和試験を使用して血清中の特定のRABV中和抗体(VNAbs)の存在について血を流し、テストされます。しかし、この試験では、既に獣医ワクチン6,7に使用されており、ヒトワクチン8に対して検討されているが、7多くの実験用マウスを犠牲にする必要がある。
現在、インターナショナル9とヨーロッパの両方の勧告は、3R戦略と呼ばれる実験室動物実験の交換、削減、および改良を実施するためにメーカーと国立管理研究所(公式医学管理研究所 - OMCLs)を奨励しています。動物の保護と福祉に関連する欧州指令2010/63/EU(2013/01/01以降有効)は、狂犬病ワクチンの品質管理および狂犬病研究11に関与するワクチンメーカーおよび研究所の制約も強化している。その結果、代替インビトロアプローチの開発、検証、使用が優先事項となっています。これらは倫理的に健全であるだけでなく、バッチテストのコストを削減し、結果の時間を週3ではなく数時間に短縮することもできます。
RABV粒子の表面において、糖タンパク質は、トリマリック形態12、13、14、15、1614,15を採用12,13する。狂犬病ワクチンにおいて、この天然三量体形態はVNAbs17を誘導する主要な免疫原を構成し、一方、単量体、可溶性または変性糖タンパク質は免疫原性18,19,19が不十分である。したがって、ワクチン産生過程に沿った糖タンパク質の三量体の保存は、最適な免疫原性ポテンシャルの保存のための良い指標である。3抗体結合検査20、21、21単一ラジアル20免疫拡散(SRD)試験22およびELISA試験222323、24、25、26、27などのいくつかの免疫化学的方法は、WHO技術報告シリーズ2および欧州モノグラフ3によって、狂犬病ワクチン中の抗原含有量を定量化することを推奨する。,24,25,26,27これらは、ワクチン産生の一貫性を監視するために製造業者によって使用され、NIH試験がまだ効力について考慮されている場合でも、ヒトワクチン28のバッチの一貫した製剤を評価するためにOMCLによって使用される。
しかしながら、これらの免疫化学的方法はすべて同等ではない。SRD試験では、膜固定三量体を改変し、可溶性または変性型の糖タンパク質22,29,をもたらす前処理が必要です。したがって、SRDは免疫原性と非免疫原性の糖タンパク質の判別においてあまり効率的ではなく、ワクチンロットの免疫原性の不完全な評価をもたらす。対照的に、ELISA試験は、より敏感な22であり、糖タンパク質の天然構造を保存し、そして糖タンパク質の天然に折り畳まれた三量体の含有量を決定するためにより適切である。ELISA試験では、ウサギポリクローナルまたはマウスモノクローナル抗糖タンパク質抗体を精製または硫酸アンモニウムで濃縮して使用できます。研究は、ワクチンでELISAによって評価されたNIH試験と抗原含有量との間の良好な一体性を実証し、ELISA法がインビトロ効力試験に適していると結論付けた。これは、ELISAテストが少なくとも,NIHテスト,,,44、26、27、30、31、32、3326,を補完するか、または置き換えるかもしれないと提唱しています。2730313233今日、欧州薬局方は、NIH試験3の代替として検証された血清学的または免疫化学アッセイの使用を推奨しています。ワクチンの効力のための動物の使用の完全な回避は現実的な視点となっています。
以下に提示される方法は、トリメリックRABV糖タンパク質15,34,34の抗原部位III(aa330〜338)を認識するマウスモノクローナル抗体クローン(mAb-D1)を用いた間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャに基づいている。この方法は、最初にインスティトゥート・パスツール26で開発されました,30その後、アサート・ナショナル・ド・セクリテ・デュ・メディカメント・エ・デ・プロデュース・ド・サンテ(ANSM)研究所、すなわちフランスOMCL4、3333によって最適化され、検証されました。4mAb-D1は、プレートを感作し、その後捕捉した抗原を検出するために使用される。これにより、糖タンパク質三量体、すなわち免疫原性RABV抗原の特異的定量が可能となる。検出に使用されるmAb-D1は、ペルオキシダーゼで標識され、これは基質およびクロモゲンの存在下で明らかにされる。試験ワクチンと基準ワクチンについて測定した吸光度の比較により、免疫原性糖タンパク質含有量の測定が可能になります。同じタイプのアッセイを、RABV糖タンパク質35の異なる抗原部位を認識する異なるmAbsに適用できることに注意する。硫酸アンモニウムポリクローナルウサギ免疫グロブリンG(IgG)またはモノクローナルマウスグロブリンを得、精製または濃縮する方法は、ペルオキシダーゼ37と共に抗体をコンジュゲートする方法とともに、これまでに36を広範囲に説明してきた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

動物福祉に対する世界的な懸念の高まりは、製造業者と国立管理研究所(OMCLs)が、実験動物実験の交換、削減、改良のための3R戦略に従うことを奨励しています。狂犬病ワクチンの効力を評価するためのNIHテストの代替として、IN vitroアプローチの開発はWHOおよびヨーロッパレベルで推奨されています。狂犬病ウイルス(RABV)粒子の表面では、糖タンパク質の三量体は、ウイルス中和抗体(VNAbs)を誘導する主要な免疫原を構成する。中和モノクローナル抗体(mAb-D1)が糖タンパク質の三量体形態を認識するELISA試験は、ワクチンバッチの産生と共に天然の折り畳まれた三量体糖タンパク質の内容物を決定するために開発された。このインビトロ効力試験は、NIH試験との良好な適合性を示し、RABVワクチンメーカーおよびOMCLによる共同試験に適していることが判明した。動物の使用の回避は、近い将来に達成可能な目的です。
提示される方法は、トリメリックRABV糖タンパク質のIII(aa330〜338)の抗原部位を認識するmAb-D1を用いた間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャ、すなわち免疫原性RABV抗原に基づいている。mAb-D1はワクチンバッチに存在する糖タンパク質三量体のコーティングおよび検出の両方に使用される。エピトープは、その立体構造特性のために認識されるため、潜在的に変性糖タンパク質(免疫原性が低い)をmAb-D1で捕捉して検出することはできません。試験されるワクチンをmAb-D1で感作したプレートでインキュベートする。結合した三量体RABV糖タンパク質は、再びmAb-D1を添加することによって同定され、ペルオキシダーゼで標識され、次いで基質およびクロモゲンの存在下で明らかにされる。試験ワクチンと基準ワクチンについて測定した吸光度の比較により、免疫原性糖タンパク質含有量の測定が可能になります。

以下の例では、参照ワクチンLot 09は、ウイルス粒子(PVワクチン株)の精製不活性化狂犬病からなる、使用されている。この中の糖タンパク質三量体(10 μg/mL)含有量は、ウイルスタンパク質の全量の測定(BCA試験)およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による糖タンパク質の割合の評価の後に確立されました。あるいは、校正された基準ワクチン、例えば、WHO第6国?...

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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

ここでは、狂犬病ワクチンにおける免疫原性糖タンパク質の内容を決定するための間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャについて説明する。この試験は、中和モノクローナル抗体(mAb-D1)を使用して、糖タンパク質三量体を認識します。生産中のワクチン効力の一貫性に従うin vivo NIH試験の代替手段である。

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

動物実験の低減を目的とし、NH検査のばらつきのために、WHOは狂犬病ワクチンの効力を評価するためのインビトロアプローチの開発を奨励する。このELISA試験は、糖タンパク質の免疫原性形態を認識する際の古典的なNH試験との良好な一様を示し、高感度を示し、そして1日以内に行うことができる。ELISAによるインビトロにおける狂犬病ワクチンの効力の評価は、インビボNH試験に代わるものである。メーカーや国の管理研究所によって推進されています。希釈ごとに事前サイズのボリュームを複製して配布し、この手順を避けるために、この手順を避けるために、使用できるコート、手袋、マスク、メガネを含む適切な個人保護装置を着用するために、水解後に吸収性紙のプレートをよく乾燥させることが重要です。汚染された材料を除染のために30分間2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液に浸して処理します。次に、96ウェル免疫アッセイプレートをセットし、各ウェルに炭酸塩緩衝液で希釈したモノクローナル抗体の200マイクロリットルを加えます。粘着フィルムでプレートを覆い、加湿環境で37°Cでマイクロプレートをインキュベートします。次に慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むレシピエントにウェル含有量を移す。マイクロプレートを反転させ、室温で吸収性紙で5分間乾燥させます。まず、パッシベーションバッファーの 300 マイクロリットルを各ウェルに追加します。粘着フィルムでプレートを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。この後、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むものにウェルの内容物を移す。プレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。次に慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むレシピエントにウェル含有量を移す。この洗浄工程を5回繰り返して、感作板を広範囲に洗浄する。この後、マイクロプレートを反転し、室温で吸収性紙の上で1分間乾燥させます。狂犬病ウイルス糖タンパク質の最終濃度が1ミリリットル当たり10マイクログラムになるように、1ミリリットルの蒸留水で基準ワクチンを再構成する。1ミリリットル当たり1マイクログラムの狂犬病ウイルス糖タンパク質濃度に到達するために、希釈剤中の再構成された参照ワクチンの10倍希釈を調製する。次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、この参照ワクチンの6つの逐次希釈を希釈剤で行う。重複するウェルに希釈液の200マイクロリットルを分配し、重複する各基準ワクチン希釈に対して、1ウェルあたり200マイクロリットルをブラインドコントロールとして機能する。次に、希釈剤中に試験ワクチンの10倍希釈を調製し、テキストプロトコルの表2に概説されているように、試験ワクチンの7倍の連続希釈液を希釈剤で調製する。各試験ワクチン希釈液をマイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルずつ配布する。マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。この後、フィルムを取り除く。吸気を慎重にし、2.7%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。プレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、非結合抗原を除去し、コーティングされた抗体に結合したGタンパク質三量体を節約する。洗浄したマイクロプレートを反転し、室温で吸収性の紙の上で1分間乾燥させます。次に、D1モノクローナル抗体を各ウェルに希釈剤で標識したペルオキシダーゼの推奨希釈液の200マイクロリットルを分配する。マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、フィルムを取り出し、慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。マイクロプレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。吸気を慎重にし、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。この洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、標識抗体の非結合ペルオキシダーゼを除去する。洗浄したマイクロプレートを反転し、室温で吸収性の紙の上で1分間乾燥させます。次に、各ウェルに200マイクロリットルの基質染色体溶液を分配する。マイクロプレートをフィルムで密封し、暗闇の中で室温で30分間インキュベートします。その後、各ウェルに停止溶液の50マイクロリットルを加え、反応を停止します。マイクロプレートの底を慎重に拭き取り、分光光度計に入れる。使用するすべてのウェルについて、492ナノメートルの光学密度を決定します。分析のためにこのデータをスプレッドシート ファイルに収集します。その後、テキストプロトコルで概説されているように、参照ワクチン曲線と光学密度値の両方のプロットを作成します。本研究では、狂犬病ワクチンの効力を評価するために、in vitro ELISA試験を用いる。代表的な実験の光学密度値を以下に示します。これらの値は、基準ワクチンの異なる希釈に対する平均光学密度を縦軸にプロットし、かつ水平軸上の糖タンパク質の濃度をプロットすることによって、基準ワクチン曲線を描くために使用される。試験されたワクチンの糖タンパク質含有量は、この曲線を使用して推定される。評価は、基準ワクチン曲線のライナー領域に平均光学密度値を有する希釈に対して正確である。1対40の希釈を考慮すると、x軸上のOD1534の垂直投影は、1ミリリットル当たり500ナノグラムに相当する。したがって、試験されたワクチンは、糖タンパク質の1ミリリットル当たり20マイクログラムと推定される。体外効力が確立されると、試験ワクチンを国際単位で校正された6つのWHO国際標準と比較する必要があります。同じ方法は、古典的により可変的である獣医ワクチンに使用されるものを含む、より多くのワクチン株の検出を拡大するために他の抗体と併用することができる。抗体はまた、馬またはヒト血清中の抗可愛抗体の滴定の競争に使用することができる。予防措置は、不活化していないワクチンやウイルスを伴って服用する必要があります。必ず、個人用保護具を使用し、手袋を着用し、すべてを適切に除染してください。また、発がん性のある錠剤や酸性次亜塩素酸ナトリウム溶液にも注意してください。

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